פרוטוקול זה מתאר את הטכניקה החדשה להעשרה בו זמנית של PTMs מרובים עם נוגדנים ואחריו ניתוח ספקטרומטריית מסה רכישה עצמאית נתונים כדי לקבל תובנה ביולוגית על לוקליזציה באתר ו שיחה צולבת. זוהי טכניקה זמן וחסכונית המאפשרת זיהוי וכמות בו זמנית של פפטידים עם חיתוך המכיל אצטילציה ו PTMs succinylation עם כמויות קטנות בלבד של קלט מדגם. מעקב אחר שינויים לאחר התרגום הוא צעד חשוב באפיון ומאבק במצבי מחלה שונים.
אנחנו כבר מודעים לכך ש סוגי סרטן וסוכרת מסוימים מוסדרים מאוד באמצעות שינויים אלה בחלבון. שיטה זו יכולה תיאורטית להחיל על כל PTMs עם נוגדנים להעשרה כגון בכל מקום, זרחון ואחרים. זה יכול לחול גם על סוגי רקמות אחרים או מודלים של תרבות התא.
המפתח להשגת נתונים בעלי ערך באמצעות טכניקה זו הוא רבייה. זה יכול להיות מושגת על ידי הבטחת כל השלבים מבוצעים בזהירות רבה במיוחד את הצעדים מעורבים גם פדילי הנוגדנים. כדי להתחיל, להשיג מחסניות המכילות C18 שף כי בשילוב עד 10 מיליגרם של חלבון.
התאם מחסניות אלה לתוך מנגנון ואקום. הוסיפו 800 מיקרוליטרים של 80% אצטוניטריל ו-0.2% חומצה פורמית למחסניות עם 19.8% מים והתחלו יניקת ואקום כדי למשוך את הנוזל. חזור על שלב זה פעם אחת הימנעות ייבוש של המחסניות לחלוטין.
יש לצייד את המחסניות על ידי הוספת 800 מיקרוליטרים של 0.2% חומצה פורמית במים עם שאיבת ואקום. חזור על זה פעמיים. טען פפטידים של מיליגרם אחד בתמיסה של כ- 1,000 מיקרוליטר על המחסניות עם יניקת ואקום.
לשטוף את הפפטידים פעמיים עם 800 microliters של 0.2% חומצה פורמית במים תחת יניקה ואקום. לאחר מכן מסדרים צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר מתחת לכל מחסנית כדי לאסוף את הפפטיד. תחת שאיבת ואקום, יש לשאוב פפטידים ממחסניות תחילה עם 800 מיקרוליטרים של 80% אצטוניטריל וחומצה פורמית של 0.2% ב-19.8% מים ולאחר מכן עם 400 מיקרוליטרים של אותו פתרון.
יבש את דגימות הפפטיד המותפלות לחלוטין במרכז ואקום למשך שעתיים עד שלוש שעות. עכשיו, תן שימוש חוזר בפפטידים המיובשים ב-1.4 מיליליטר של חיץ טיהור חיסוני קר פי 1. מערבולת לערבב ולהבטיח pH של כ 7.
צנטריפוגה הדגימות ב 10, 000 פעמים g במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. גלולה קטנה מופיעה. מניחים את הפפטידים בצד על קרח בזמן הכנת גם גם נוגדנים.
הוסיפו מיליליטר אחד של PBS 1X קר לצינור המכיל 100 מיקרוליטרים של תרחיף חרוזים נוגדן K-אצטיל וצינור המכיל 100 מיקרוליטרים של תרחיף פרעוזי נוגדנים K-succinyl ומערבבים על ידי צינור. מעבירים את כל הפתרון לצינורות חדשים של 1.5 מיליליטר ומסובבים בצנטריפוגה מיניאטורית למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר. שאף PBS דואג להימנע שאספירה את כל חרוזים.
חזור על לשטוף שלוש פעמים נוספות. לאחר מכן, תן שימוש חוזר לחרוזים בכ-440 מיקרוליטרים של PBS. פיפטה את חרוזים מספר פעמים כדי לערבב היטב.
עם 200 טיפים מיקרוליטר precut, להעביר 100 microliters של כל בחנות נוגדן אצטיליסין וחרוזי נוגדנים succinyllysine לתוך צינור חדש. סובבו למטה במשך 30 שניות בצנטריפוגה מיניאטורית ושאוף את התקשורת עם קצה מטעין ג'ל. חרוזים עכשיו להפוך לבן.
פיפטה הפפטיד המתומשך ישירות אל חרוזים שטופים להידגר פפטידים עם חרוזים בארבע מעלות צלזיוס לילה עם תסיסה. בבוקר, לסובב את דגימות פפטיד ב 2, 000 פעמים g במשך 30 שניות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את העל-טבעי המכיל פפטידים לא מאוגדים ושמור לניסויים עתידיים במידת הרצוי.
מוסיפים מיליליטר אחד של חיץ טיהור אימונואפינטיות קר פי 1 אל חרוזים כדי לשטוף ולערבב על ידי היפוך חמש פעמים. סובב ב 2,000 פעמים g במשך 30 שניות בארבע מעלות צלזיוס. שאפו את פתרון טיהור האימונואפינטיות וחזרו על שלב הטיהור האימונואפינטי פעם נוספת.
לאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של מי HPLC קרים לחבילות ומערבבים על ידי היפוך חמש פעמים. סובב ב 2,000 פעמים g במשך 30 שניות בארבע מעלות צלזיוס. שאפו מהמים וחזרו על שלב שטיפת המים פעמיים נוספות.
לסובב זמן נוסף ב 2, 000 פעמים g במשך 30 שניות בארבע מעלות צלזיוס כדי לאסוף את כל המים הנותרים בתחתית הצינור. עם טיפים שטוחים להעמסת ג'ל, שאפו את כל המים הנוספים שאספו. היזהרו להימנע מחשיפת חרוזים.
הוסיפו 55 מיקרוליטרים של 0.15% חומצה טריפלואורואצטית במים לקדוזים. הדגירה את חרוזים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר תוך הקשה מדי פעם על החלק התחתון של הצינור לערבב. לסובב את חרוזים בטמפרטורת החדר במשך 30 שניות בצנטריפוגה מיניאטורית.
השתמשו בקצה טעינת ג'ל שטוח כדי להעביר את הפפטידים האלודים לצינור חדש. הוסיפו 45 מיקרוליטרים של 0.15% חומצה טריפלואורואצטית במים לקדוזים. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר תוך הקשה על החלק התחתון של הצינור מדי פעם לערבב.
סובבו את החמרוזים בטמפרטורת החדר למשך 30 שניות בצנטריפוגה המיניאטורית. מוציאים את האלוטיון השני בעזרת קצה טעינת ג'ל שטוח ומשלבים אותו עם האלוטיון הראשון. סובבו את הפפטידים האלודים המשולבים ב-12,000 פעמים למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לסלק את כל החמוזים שנושאים.
מעבירים את פתרון דגימת הפפטיד לצינור חדש של 500 מיקרוליטר. בנו את שיטת הטעינה כדי לטעון את תערובות הפפטיד המועשרות על שבב C18 לפני העמודה והתפלת הפפטידים שוב על ידי שטיפה עם שלב A נייד בשני מיקרוליטרים לדקה למשך 10 דקות. בנה את שיטת הכרומטוגרפיה כך שפפטידים יועברו לעמודה אנליטית ויתרחקו בקצב זרימה של 300 ננוליטר לדקה עם מעבר הדרגתי של שעתיים עד שלוש שעות באמצעות שלבים ניידים A ו- B.באופן ספציפי, השתמש במילוי הדרגתי ליניארי מ- 5%mobile phase B ל- 35%mobile phase B במשך 80 דקות.
לאחר מכן, שיפוע את השלב הנייד B ל-80% במשך חמש דקות ולאחר מכן החזק ב- 80%B למשך שמונה דקות לפני שתחזור ל- 5%B לשווי משקל מחדש של 25 דקות. לאחר מכן, בנה שיטת כלי MS עבור רכישה תלוית נתונים. לניסוי ראשון, הגדר סריקת יון מבשר MS1 מ- M/Z 400 עד 1, 500.
הגדר את משך הזמן ל- 120 דקות. צור ניסוי IDA ולחץ על אישור. תחת הכרטיסיה קריטריוני מתג, הגדר את סף העוצמה להפעלת סריקות MS/MS לאיתור יונסים של מדינות טעונות בין שניים לחמישה עד 200 ספירות לשניה. הגדר את ההחרגה הדינמית של היונים המבשרים ל- 60 שניות.
לניסוי שני, הגדר סריקת יון מוצר MS/MS עם טווח סריקת MS2 מ- M/Z 100 עד 1, 500. לחץ על עריכת פרמטרים והגדר את התפשטות אנרגיית ההתנגשות לחמש ובחר את מצב סריקת היונים של המוצר בעל הרגישות הגבוהה. לבסוף, מקם את הדגימה לתוך הדגימה האוטומטית.
שלח את התור לדוגמה והתחל את שיטות הרכישה של LC-MS/MS בבניית שיטת מכשיר MS לרכישה עצמאית של נתונים ולהגדרת שני ניסויים בסריקת מכשירים. בצע סריקות יון מבשר MS1 מ 400 ל 1, 250 מסה כדי לטעון ולהגדיר את משך הזמן ל 120 דקות. הגדר את התפשטות אנרגיית ההתנגשות ל- 10 ותזמן הצטברות ל- 45 אלפיות שניה ולאחר מכן בחר את מצב סריקת היונים של המוצר בעל הרגישות הגבוהה.
לאחר מכן, יבא קובץ טקסט המכיל את ערכת הרכישה DIA SWATH של חלון משתנה 64 כדי לאכלס חלונות רכישת SWATH בשיטה. בתכנית רכישה זו, חלונות משתנים הנעים בין חמש ל -90 מסה לטעינה ורוחב מועברים בצעדים מצטברים על פני טווח המסה המלא של 400 עד 1, 250 מסה כדי לטעון עם סך של 64 מקטעי SWATH כל אחד עם זמן הצטברות של 45 אלפיות שנייה. התאם את זמן הצבירה של MS1 ל- 0.25 שניות.
יחד, סריקת MS1 וסריקות MS2 64 אמורות להניב כעת זמן מחזור כולל של 3.2 שניות. במחקר זה, תוצאות הניסוי תיעדו את האפשרות של גילוי והערכת PTM cross-talk. טבלה זו מראה כיצד ציר הזמן של זרימת העבודה ואת כמויות הדגימה והחלבון הנדרשים.
השיטה של סיר אחד יכולה להתבצע במחצית הזמן ועם מחצית ממספר הדגימות כמו שיטות חלופיות אלה. מקדם הווריאציה החציוני עבור אזורי הפפטיד ששונו היה נמוך יותר בשיטת הסיר האחד מאשר בהעשרת PTM יחידה ו- PTM טורית. תוך השוואת שיטות העשרת PTM בסיר אחד ו- PTM יחיד, לא היו הבדלים בולטים בין המתאמים של כימות ברמת האתר עבור שני השינויים.
איור זה מציג נתונים מהעשרה מוצלחת וממחיש דוגמה לפפטיד המכיל שינויים מרובים ושונים ב-acyl המדמיין דיבור צולב של PTM. פפטיד היה אצטילציה על שאריות ליזין אחד ותמציתי על השני ואילו כאן אותו פפטיד היה מרוטש בשתי ליזינים. זה מדגים כי אותו שאריות ליזין ניתן לשנות עם שתי קבוצות acylation ויש אפשרות של שיחה צולבת המתרחשים באתר זה.
זה חיוני כדי לוודא כי כל מדגם מכיל את אותה כמות של חרוזים ולוודא כי אף אחד חרוזים הם שאפו בטעות בעת שטיפת חרוזים פפטיד. פרופיל מבוסס ספקטרומטריית מסה וניתוח נתונים בכלי תוכנה כגון Spectronaut מבוצעים בעקבות הליך זה כדי לזהות, לכמת ולבצע לוקליזציה של אתרים של PTMs. זרימת עבודה זו של רכישה עצמאית לנתונים בשילוב עם העשרת PTM בו זמנית תפתח אפיקים כדי להעריך ביעילות רבה יותר את הדיבור הצולב של PTM ולספק תובנות טובות יותר לגבי הרלוונטיות של איתות PTM.
