ניתוח של שאינם אנושיים הלבלב של איון צריכת החמצן

שיטה זו מאפשרת לכמת את צריכת החמצן מכמות קטנה של איונים ממינים רלוונטיים, כגון פרימטים לא אנושיים ובני אדם, ומאפשרת הערכה של תפקוד המיטוכונדריאלי. טכניקה זו יכולה להתבצע עם מספר קטן של איונים ראשוניים, הגדלת שכפולים טכניים, המאפשר בדיקה של תנאים מרובים, ושיפור הקשיחות ואת הרבייה של הבדיקה. טכניקה זו מעריכה את בריאות המיטוכונדריה, גורם מכריע בתפקוד איון והפרשת אינסולין שלעתים קרובות נפגעת בסוכרת והיא מנבאת משמעותית של השתלת איון מוצלחת.

זה חיוני כדי לוודא כי איונים הם מקומיים למרכז הבארים לאחר ההעברה. כישלון לעשות זאת גורם למדידות צריכת חמצן לא עקביות. הוכחת הליך זה תהיה, ואלרי ריצ'ארדי, סטודנטית לתואר ראשון שעובדת במעבדה שלי.

יום לפני הראיה, להוסיף 200 microliters של תאים ורקמות דבק 2.8 מיליליטר של 0.1 פתרון סודיום ביקרבונט טוחן ולהוסיף 20 microliters של הפתרון וכתוצאה מכך לתחתית של כל באר של 96 מיקרופלסטיק כדורי היטב. ודא שכל בועות האוויר יוסרו מהטיפ של הפיפיאט. כאשר כל בארות כבר טעון, למקם את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס שאינו פחמן דו חמצני אינקובטור.

לאחר שעה אחת, שאפו את תותבת דבק התא מהצלחת בתוך סביבה סטרילית ושטפו כל באר פעמיים עם 400 מיקרוליטרים של מים סטריליים של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן אפשרו ל בארות להתייבש במשך 30 עד 40 דקות לפני כיסוי הצלחת לאחסון לילה בארבע מעלות צלזיוס. כדי לחות את מחסנית החיישן, בסביבה סטרילית לפתוח את חבילת מחסנית החיישן ולהסיר את התוכן.

מניחים את מחסנית החיישן במהופך ליד צלחת השירות וממלאים כל באר של צלחת השירות עם 200 מיקרוליטרים של מים סטריליים. לאחר שכל הבארות נטענו, הורידו את מחסנית החיישנים לתוך לוחית השירות והצבו את מחסנית החיישן המורכבת ואת לוחית השירות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס שאינו פחמן דו-חמצני במהלך הלילה. ביום ההתראה, להסיר את מכסה מחסנית החיישן ולפענח את המים מן הבארים של צלחת השירות.

הוסף 200 מיליליטר של כיול טרום המלחמה לכל באר והחלף את מכסה מחסנית החיישן. ואז למקם את מחסנית החיישן בחזרה לתוך החממה במשך כשעה. כדי להכין את איונים להעברה, יד לבחור את איונים לתוך צלחת 60 על 15 מילימטר תאים המכיל מדיום מורכב ליד 100% טוהר.

כאשר כל האיונים נאספו, לטעון כל באר של מיקרופלאט ספרואיד מוכן עם 175 microliters של מדיום התאספו ולהשתמש פיפטה P20 להגדיר 15 microliters כדי לשכוף 15 איונים ב 15 microliters של מדיום מן צלחת תרבות התא. כדי לזרוע את האיונים על המיקרופלאט הכדורידי, הורידו את קצה הפיפט לתחתית הגם, בקושי הרימו את הקצה, ופזרו לאט כחמש מיקרוליטרים של מדיום. כדי לטעון את איונים לתוך בארות, לאפשר את איונים להתיישב בקצה פיפטה לפני בעדינות לשחרר אותם ישירות מעל החלק התחתון של מרכז היטב בנפח קטן של מדיום.

אשר כי כל האיים עזבו את קצה פיפטה, מדי פעם בדיקת מיקרופלסטיק כדורית מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא כי האיים הם זרע בתחתית הצלחת ולא דבוקים לצדדים של בארות. כאשר כל האיים הועברו, מניחים את המיקרופלאט ב-37 מעלות צלזיוס שאינם פחמן דו-חמצני. לפני התחלת הליך הבדיקה, טען את יציאה A של מחסנית החיישן עם 20 מיקרוליטרים של אוליגומיצין 45 מיקרומולרים טריים, פורט B עם 22 מיקרוליטרים של FCCP 10 מיקרומולרים שהוכנו זה לזה, ופורט C עם 25 מיקרוליטרים של רוטנונה 25 מיקרומולרים טריים AA. לאחר מכן, לתכנת מתקן שטף חוץ תאיים למשך 30 דקות תקופת נשימה בסיסית, 42 דקות תקופת מדידת אוליגומיצין, תקופת FCCP של 30 דקות, ותהוכת רוטנונה AA של 30 דקות.

לאחר מכן הפעל את ההתראה בהתאם להוראות על המסך לכיול החיישן ולהכנסת המיקרופלסטיק. עבור משלוח איון לצלחת ההתמדה, יש לזמן 15 איונים ב-15 מיקרוליטרים של מדיום כפי שמודגם. טכניקה זו תגרום למיקום עקבי של איונים במרכז התחתון של כל באר מיקרופלסטיק המאפשר מדידות צריכת חמצן מדויקות.

בניסוי מייצג זה מראה את צריכת החמצן של בארות בודדות, הבארים היו טעונים היטב וכתוצאה מכך רמה בסיסית נמוכה מאוד של צריכת חמצן מעט מאוד תגובה FCCP. בניסוי זה, רוב בארות הפגינו נשימה בסיסית משמעותית ותגובה לסמים. עם זאת, שתי בארות לא הציגו תגובה רוטנונה, מה שמרמז כי התרופה לא שוחרר כראוי לתוך באר.

בארות אלה הוצאו מניתוחים נוספים. כאן, ניתן לראות את התוצאות של בדיקה מוצלחת שבה בארות היו טעונות כראוי עם איונים מוזרק כראוי עם תרופות ניתן לראות. זה מועיל להכין את reagents ואת הצלחות יום לפני ביצוע ההתעקשות כדי לאפשר את איונים לשמש זמן קצר לאחר שהם מבודדים או מתקבלים.

לאחר ההתמדה, ניתן לשחזר את איונים עבור חלבון או מיצוי DNA כדי לנרמל את נתוני צריכת החמצן או לכמת את תוכן ה- DNA המיטוכונדריאלי. היכולת למדוד תפקוד מיטוכונדריאלי במספרים קטנים של איוני פרימטים ראשוניים מאפשרת בדיקה של תרופות מרובות ומניפולציות אחרות בשכפול ביולוגי אחד. אנשים העובדים עם איי פרימטים ראשוניים צריכים להיות מאומנים בטיפול הנכון והבטוח עם רקמות אלה.

בפרט, השימוש בציוד מגן אישי מתאים וסילוק נאות של דגימות אלה.