היו מאמצים רבים כדי לגרום אריפטוזיס באמצעות ionomycin. עם זאת, ההליך המדויק לתהליך זה אינו מתואר בבירור בספרות. אנו מספקים הליך צעד אחר צעד כדי לגרום אריפטוזיס באמצעות ionomycin.
היתרון העיקרי של הליך זה הוא לגרום אריפטוזיס אריתרוציטים אנושיים בצורה אמינה לשחזור. כדי להתחיל, להוסיף 500 microliters של דם שלם קר חומצה ציטראט דקסטרוז לצינור מיקרוצנטריפוגה. צנטריפוגה את כל הדם ב 700 פעמים g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר ולהסיר את הפלזמה ברורה ואת מעיל באפי דק באמצעות פיפטה לעזוב את שכבת אריתרוקיט אדום.
הכן ליטר אחד של תותב רינגר המכיל 125 מילימולר נתרן כלורי, חמישה מילימולר אשלגן כלורי, מגנזיום גופרתי מילימולארי אחד, 32 מילימולרים HEPES, חמישה מילימולר גלוקוז, ואחד מילימולר סידן כלורי. כוונן את ה- pH ל- 7.4 על-ידי הוספת שתי טיפות מיקרוליטר של נתרן הידרוקסיד טוחן אחד. כדי להכין פתרון צלצול ללא גלוקוז, בצע את אותו פרוטוקול אך אינם כוללים גלוקוז בתסרון.
לשטוף את אריתרוציטים פעמיים בתתבת רינגר על ידי השעיית גלולת התא ב 1.5 מיליליטר של פתרון רינגר, צנטריפוגה ב 700 פעמים g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר והסרת supernatant. לאחר מכן לעשות 0.4% hematocrit על ידי שימוש חוזר 40 microliters של גלולת אריתרוסיטים ב 9, 960 microliters של פתרון צלצול ללא גלוקוז כדי להגיע לנפח הסופי של 10 מיליליטר. דגירה ההשעיה התא ב 37 מעלות צלזיוס במשך שבעה ימים.
הדגירה מראש של אריתוציטים במאגר ללא גלוקוז מפעילה באופן משמעותי אריפטוזיס. אריפטוזיס גבוה הושג לאחר שבעה ימים של טרום דגירה במאגר ללא סוכר. ממיסים מיליגרם אחד של מלח סידן יונימיצין ב 630 microliters של DMSO כדי להגיע לריכוז סופי של שני מילימולרים.
Aliquot ב 20 מיליליטר ולאחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס. קח מיליליטר אחד של 0.4% המטוקריט מוכן ולהוסיף 0.5 microliters של שני ionomycin מילימולרית כדי להגיע לריכוז סופי של micromolar אחד. דגירה במשך שעתיים ב37 מעלות צלזיוס.
השתמש מיליליטר אחד של המטוקריט ללא טיפול ionomycin כשליטה שלילית. צנטריפוגה ionomycin מטופלים המטוקריט מטופלים ב 700 פעמים g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר ולהסיר את supernatants שלהם להשאיר את כדורי התא בתחתית הצינורות. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם פתרון צלצול על ידי השעיית כדורי התא ב 1.5 מיליליטר של פתרון רינגר, צנטריפוגה ב 700 פעמים g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר והשליכת supernatants.
כדי למדוד המוליזה, מוסיפים מיליליטר אחד של ההמטוקריט הלא מטופל 0.4% לצינור מיקרוצנטריפוגה ודגירה במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס כשליטה שלילית של 0%hemolysis. כדי להכין את השליטה החיובית של 100%hemolysis, להוסיף מיליליטר אחד של hematocrit מטופל 0.4% לצינור microcentrifuge וצנטריפוגה ב 700 פעמים g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. מוציאים את העל-טבעי ומוסיפים מיליליטר אחד של מים מזוקקים לכדור התא כדי לעשות שימוש חוזר ותודגר במשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, מוסיפים מיליליטר אחד של היונומיצין שטופלו 0.4% המטוקריט לצינור מיקרוצנטריפוגה. צנטריפוגה התאים שאינם מטופלים, תאים מטופלים, ואת התאים במים מזוקקים ב 700 פעמים g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. מעבירים 200 מיקרוליטרים של העל-טבעיים לכל באר של צלחת של 96 בארות.
למדוד את הספיגה ב 541 ננומטר באמצעות קורא לוחות מיקרו. חשב את ההמוליזה באמצעות המשוואה שבה A0, A100 ו- AT הם ספיגת אריתרוציטים בתמיסת רינגר במים וספיגת אריתירוציטים מטופלים על ידי ionomycin. לדלל שני מיליליטר של מאגר איגוד 5X Annexin-V בשמונה מיליליטר של PBS כדי להשיג מאגר איגוד 1X.
לחץ מחדש על כדורי התאים שטופלו ביונימיצין ולא מטופלים במיליליטר אחד של מאגר הכריכה 1X. קח 235 microliters של מתלי התא במאגר מחייב ולהוסיף 15 microliters של Annexin-V אלקסה פלואור 488 חידה בצינור מיקרוצנטריפוגה. דגירה התאים בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות במקום חשוך.
צנטריפוגה ב 700 פעמים g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. הסר את העל-טבעי. לשטוף את התאים פעמיים עם חיץ מחייב 1X על ידי השעיית גלולת התא ב 1.5 מיליליטר של המאגר מחייב צנטריפוגה ב 700 פעמים g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
הסר את supernatant ו resuspend כדורי התא ב 250 microliters של מאגר כריכה 1X למדידת ציטומטריה זרימה. עכשיו להעביר 200 microliters של אריתרוסיטים מוכתמים Annexin-V לצינורות פוליסטירן תחתונים עגולים מיליליטר תואם ציטומטריית זרימה. היכנס לתוכנה cytometry זרימה ולחץ על כפתור הניסוי החדש.
לחץ על כפתור הצינור החדש. בחר את הגיליון הכללי ובחר את ניתוח החל כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות עם אורך גל של 488 ננומטר ואורך גל פליטה של 530 ננומטר. הגדר את מספר התאים ל- 20,000 שיש לאסוף לניתוח מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות.
בחר את הצינור הרצוי ולחץ על כפתור העומס. לחץ על כפתור הקלטה עבור פיזור קדימה ומדידת פיזור בצד. חזור על הפעולה עבור כל הדגימות.
לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על לחצן הדגימה ולחץ על החל ניתוח אצווה כדי ליצור את קובץ התוצאה. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על לחצן דגימה ולחץ על ליצור קבצי FSC. בפרוטוקול זה, טיפול אריתרוסיטים עם פתרון אחד ionomycin מיקרומולרי ו רינגר במשך שעתיים היה מספיק כדי לגרום אריפטוזיס כפי שמעיד על ידי תיוג מוצלח עם נספח-V פלואור 488 חידה כימות על ידי ניתוח FACS.
ריכוזים גבוהים יותר של ionomycin ב 5 ו 10 micromolar הביא לעלייה קלה אריפטוזיס. עם זאת, ריכוזים כאלה גם שיפרו את ההמוליזה. דגירה של אריתרוציטים בתמיסת ionomycin ו- Ringer במשך 30 דקות בלבד הספיקה כדי לגרום לאריפטוזיס.
זמן הדגירה המוגבר העלה את רמת אריפטוזיס עד שעתיים. עם זאת, זמן דגירה נוסף הביא לירידה קלה ברמת אריפטוזיס. הערך הגבוה יותר של המוליזה לאחר 180 דקות מסביר את הירידה ב אריפטוזיס לאחר אותה כמות של דגירה כמו תאים פחות קיימא היה קיים על 180 דקות של טיפול עם ionomycin.
אריתרוציטים עם טיפול ionomycin הראו אות פלואורסצנטי בהיר מחייב של Annexin-V כדי phosphatidyl סרין בעלון החיצוני. לעומת זאת, תאים ללא טיפול הראו אות פלואורסצנטי חלש מאוד המציין אריפטוזיס נמוך מאוד. טרום הדגירה במאגר ללא גלוקוז הוא גורם חשוב עבור אינדוקציה של אריפטוזיס.
מאז אריפטוזיס נצפתה במגוון רחב של מחלות, הניסויים הבאים פרוטוקול זה הם ספציפיים לשדה. במעבדה שלנו, אנו מעוניינים לבחון את ההשפעות של אריפטוזיס על תכונות ביופיזיות קרום אינטראקציות קרום עם ננו. אריפטוזיס קשורה למספר רב של מחלות כולל סוכרת, אנמיה חרמשית ותלמיה.
לאחר פרוטוקול לשחזור ל גרימת אריפטוזיס יכול לעזור לחוקרים בכל אחד מהתחומים האלה כדי לחקור שאלות מדעיות נוספות ספציפיות לכל תחום.
