תא תא פיוז'ן של הגנום בעריכה קווי תאים עבור פרטורבציה של מבנה הסלולר ותפקוד

שיטה זו מאפשרת לטרטר מבנה ותפקוד תאיים באמצעות היתוך של שני סוגי תאים שונים כדי לענות על שאלות כגון כיצד תאים מגיבים לשינויים במספר organelle. על ידי הדמיה פלואורסצנטי מתויג חלבונים בתוך תאים מותכים, מבנים הסלולר ניתן להפנות בחזרה לסוג התא שלהם של מקור ללמוד את המנגנונים של הונוסטזיס organelle ותפקוד. עבור תיוג צבע פלואורסצנטי, ראה את אוכלוסיות התאים הסרטניים האנושיים של עניין כך שכל תרבות תתרחב לפחות שש פעמים 10 לתאים השישיים ב 70 עד 90% confluency עד למחרת בבוקר.

ביום התיוג, לשטוף את השורש eGFP ותאי rootletin-mScarlet פעמיים עם 10 מיליליטר של PBS לכל לשטוף. לדלל צבע תא סגול ל 500 nanomolar ב PBS וצבע תא אדום רחוק ל 200 nanomolar ב PBS. סמן את תאי השורש eGFP בצבע התא הסגול המדולל ותאי השורש-mScarlet עם צבע התא האדום הרחוק המדולל למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.

בסוף הדגירה, לעצור את התגובות עם 10 מיליליטר של DMEM במשך חמש דקות. לשטוף הן תרבות תאים שכותרתו ותרבות תאים הורית אחת ללא תווית עם 10 מיליליטר של PBS טרי לפני הדגירה כל התרבויות עם מיליליטר אחד של טריפסין טרום המלחמה. בסוף הדגירה, להעביר את פתרונות התא מנותק צינורות חרוט בודדים 15 מיליליטר עבור צנטריפוגה בעדינות resuspend כדורי צבע שכותרתו במיליליטר אחד של PBS ואת התאים ללא תווית במיליליטר אחד של DMEM.

ואז להחזיר את כל דגימות התאים לאינקובטור תרבות התא. לניסוי היתוך תאים, מערבבים 500 מיקרוליטרים של תאים מסומנים בצבע ויולט עם 500 מיקרוליטרים של תאים מסומנים בצבע אדום רחוק בצינור חדש של 15 מיליליטר ומשמידים את התאים הנותרים שאינם מתויגים על ידי צנטריפוגה. תן שוב את הכדורים במיליליטר אחד של DMEM טרי והחזר את התאים לאנקובטור.

לאסוף את התאים המעורבים על ידי צנטריפוגה ולהוסיף 700 microliters של 50%1450 PEG באופן טיפה חכם לכדור על פני תקופה של 30 שניות. לאחר 3.5 דקות בטמפרטורת החדר, הוסיפו 10 מיליליטר של DMEM נטול סרום לאורך תקופה של 30 שניות והמקמו את הצינורות באינקובטור למשך 10 דקות. בסוף הדגירה, מסיסים את התאים המעורבים על ידי צנטריפוגה ומערבבים בעדינות את גלולת במיליליטר אחד של מדיום שלם.

כדי להעשיר עבור אוכלוסיית התאים התמזגו על ידי FACS, בעדינות לסנן את כל התאים לתוך צינורות FACS בודדים דרך מסננת 70 מיקרומטר וליצור פיזור קדימה לעומת פיזור צד להכפיל חלקות אפליה בתוכנת ציטומטר. הפעל את התאים ללא תריס כדי לתעד את עוצמת הפלואורסצנטיות שלהם וליצור שערים כדי לזהות את התאים התמזגו. לאחר מכן, הפעל את הצבע ויולט חיובי יחיד שכותרתו תאים כדי לאשר כי אין זליגה של אות ויולט לתוך הערוץ האדום הרחוק ואת צבע אדום רחוק חיובי יחיד שכותרתו תאים כדי לאשר כי אין אות אדום רחוק בערוץ ויולט.

לאחר מכן הפעל בקצרה את דגימת ההיתוך כדי לאשר כי התאים התמזגו גלויים עם שערים אלה. כאשר פרמטרי המיון נקבעו, יש ליישר את זרם המיון באופן מרכזי לתוך צלחת הדמיה בת שמונה בארות המכילה 100 מיקרוליטרים של מדיום צמיחה ומיין את התאים המותכים החיוביים הכפולים ישירות לתוך המנה. כאשר כל התאים כבר ממוינים, מיד למקם את המנה לתוך החממה תרבות התא במשך שעתיים עד 16 שעות.

עבור כתמים immunofluorescent, תחילה להחליף את תרבות התא על טבעי עם 200 microliters של 4% paraformaldehyde עבור דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף קיבעון, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 200 microliters של PBS לכל לשטוף לפני permeabilizing התאים ב 200 microliters של 0.1% פעילי שטח לא יוני במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, חסום את הכריכה הלא ספציפית עם 200 מיקרוליטרים של אלבומין סרום 3%bovine ב- PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ואחריו תיוג עם נוגדנים בעלי עניין ב-150 מיקרוליטרים של חיץ כתמים.

לאחר שעה בטמפרטורת החדר, לשטוף את התאים פעמיים 300 microliters של PBS במשך חמש דקות לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, החלף את הכביסה עם 200 microliters של PBS טרי. כדי לרכוש תמונות של התאים המותכים, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי מתאים המסוגל לבצע הדמיה של ארבעה צבעים ולאסוף תמונות תלת מימדיות.

תאים המסומן כראוי גלויים במהלך ציטומטריית זרימה על ידי אות פלואורסצנטי ברמה גבוהה יותר מאשר תאי בקרה ללא תווית. ניתן להגדיר את השערים למיון כדי להעשיר עבור אוכלוסיית התאים החיוביים הכפולים ישירות לתוך כלי הדמיה לניתוח מיקרוסקופי נוסף. היתוך גורם לסידור מחדש גדול של הארכיטקטורה התאית באמצעות ערבוב של שני תאים לאחד.

הטרוקריונים מזוהים כתאים המכילים את שני אותות הצבע הפלואורסצנטיים המעורבים בתוך תא אחד מבלי להתערב במברנות פלזמה. בנוסף, שני גרעינים עשויים להיות גלויים גם בתאים מותכים על ידי הדמיה ברייטפילד. מבנה התא ותפקודו עשויים להיחקר עוד יותר באמצעות מיזוג של תאים המכילים meGFP וחלבונים מתויגים mScarlet.

היתוך גורם להכפלה של מספר centrosome בתוך הטרוקריונים גלוי לפחות ארבעה foci חומר קרום המוח כאשר המרכיב pericentriolar centrosome NEDD1 מתויג באופן פלואורסצנטי. היתוך של תאים עם שורש מתויג אנדוגני פלואורסצנטי מאפשר לתא המקור של כל centrosome להיות מזוהה בהטרוקריון. פרוטוקול זה מדגים כיצד להתיך קווי תאים המסווים באופן דיפרנציאלי וכיצד לדמיין את האיברונים שלהם כדי להבין את המבנה והתפקוד שלהם.

פרוטוקול חזק זה הוא גם קל יחסית וזול יחסית לביצוע בהשוואה לשיטות דומות. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לשאול מגוון של שאלות כגון איך היתוך organelle מוסדר וכיצד התאים מגיבים לשינויים במספר organelle subcellular.