פרוטוקול זה הוא דרך קלה ליצור את הפרופילים של אוביקיטין ושינויים פוסט-תרגומיים דמויי אוביקיטין על ידי זיהוי וכימות למחצה של חלבונים מזוהים ספציפיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא השימוש lentiviruses כדי ליצור קו תא יציב של ביטוי בתוך שבוע, ואת השימוש בשני תגים כדי לטהר חלבונים במיוחד. למעשה, סוג זה של שינויים שלאחר התרגום מעורבים ברוב הפונקציות הביולוגיות, ושינויים של מנגנון זה נמצאים ברוב המחלות.
לכן, זיהוי שינויים אלה עשוי לשמש פרוגנוסטי ו /או אבחון וכמובן מטרות מולקולריות. Ubiquitin הוא אחד החלבון החיסכון ביותר בתאים eukaryotic וזה חיוני להישרדותם. לכן, סוג זה של שיטה יכול להיות מיושם על כל מודל eukaryotic, מיונקים שמרים.
עם זאת, מערכת lentiviral שלנו מוגבלת לחקר תאים. מאז כל ההליך הוא די ארוך עם זמן דגירה ארוך לפעמים, אפשר לעשות את זה במשך יומיים במקום אחד. ניתן להקפיא את ה-eluate מ-nickel חרוזים במינוס 20 ולפני הוספת גם גם את גם את גם גם את גם 10 חרוזי הניקל.
פרוטוקול זה מכיל שלבים רבים ביניהם חלקם קריטיים על מנת להבטיח את ההצלחה הסופית של הטיהור, וכך הקמה מדויקת של פרופיל השינוי שלאחר התרגום. הפגנת ההליך תבוצע על ידי מירנה סווידן ואאורלי דובריק, שני דוקטורים של המעבדה. כדי להתחיל, להוסיף 0.5 פעמים 10 כדי השישי של תאי HEK 293T בצלחת שש באר עם שני מיליליטר לגם של DMEM עם 10% FBS לזרע, ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני, ו 100% לחות.
למחרת מושגת התכנסות של 50 עד 70%. Cotransfect התאים עם תערובת של מיקרוגרם אחד של pCCL-6HF כמו או pCCL-GFP, מיקרוגרם אחד של PBS VG, ומיקרוגרם אחד של וקטורים עוזר דלתא באמצעות רהט transfection ופרוטוקול לייצור lentivirus. לאחר שש שעות של חילוף, שנה את המדיום למדיום טרי המתאים למדיית התאים שיש להחליף.
זרע את התאים להיות מתמר בצלחת שש באר עם מדיה התרבות הסטנדרטית שלהם על מנת לקבל 10 עד 20% confluence ביום שאחרי. 24 שעות לאחר ההחלמה, לשחזר את המדיום המכיל חלקיקי lentiviral, ולסנן באמצעות מסנני 0.45 מיקרון. החלף את המדיה של התאים כדי להיות מומר על ידי המדיום המסונן המכיל lentiviruses.
דגירה התאים עם lentiviruses במשך 24 עד 72 שעות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני, ולאחר מכן לשנות את המדיום עם טרי, סטנדרטי אחד. בדוק ביטוי GFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך כדי להעריך את יעילות ההתמהמה. אם לא זוהתה פלואורסצנטיות, המתן ליומיים-שלושה נוספים.
אם פקד GFP הוא חיובי עם פלואורסצנטיות ירוקה, לגדל את כל התאים עד שיש מספיק כדי לבצע שליטה ביטוי של 6-His-FLAG ubiquitin כמו על ידי immunofluorescence, כפי שמוצג כאן, ואת הכתם המערבי באמצעות נוגדן נגד FLAG. לאחר גידול התאים במנות של 15 ס"מ, שטפו את מנות התרבות לפחות פעם אחת עם מלוחים עם מאגר פוספט בטמפרטורת החדר. כדי להתחיל תריס תא, להוסיף שני מיליליטר של חיץ אחד לתוך כל צלחת 15 ס"מ בטמפרטורת החדר.
השתמש מגרד תא לשחזר את כל lysates לתוך צינורות צנטריפוגה חרוט 50 מיליליטר. Sonicate lystates שלוש פעמים במשך 30 שניות, מופרדים על ידי הפסקה של דקה אחת. צנטריפוגה lysates sonicated ב 15, 000 פעמים גרם במשך 15 דקות.
מעבירים את העל-טבעי לצינור חדש דרך מסננת תאים של 40 מיקרון. חשוב מאוד לסנן ליאזטים לאחר sonication וצנטריפוגה. לא עושה את זה עלול לגרום copurification של חלבונים רבים שאינם ספציפיים, ובכך להגדיל את הרקע מאוד להקטין את גודל פרופיל PTM.
מעבירים כמות שווה של חלבון בין 50 ל-100 מיליגרם לצינורות פלקון חדשים. הוסף גם יון ניקל NTA חרוזים לתוך כל צינור עם כמות של שני microliters של חרוזים לכל מיליגרם אחד של חלבון. מניחים את הצינורות על מסובב כדי לסובב ב 30 סל"ד במשך 2 1/2 שעות בטמפרטורת החדר.
ואז גלולה את חרוזים ב 500 פעמים g במשך חמש דקות. לשטוף את חרוזים עם מיליליטר אחד של חיץ אחד, ולהעביר את הדגימות לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר. מניחים את הצינור על קרח.
לשטוף פעמיים עם מיליליטר אחד של חיץ קר כקרח שני המכיל imidazole עשרה מילימולאר. כדי לסלק חלבונים, להוסיף 600 microliters של חיץ שני המכיל imidazole 250 מילימולאר, ולסובב במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס. לאחר pelleting את חרוזים על ידי צנטריפוגה ב 500 פעמים גרם במשך דקה אחת, להעביר את supernatant לצינור חדש מקורר מראש 1.5 מיליליטר, ולהוסיף 50 microliters של בחנורים נוגדנים M2 אנטי-FLAG M2.
סובב ב-30 סל"ד למשך שעתיים וחצי בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן לשטוף פעמיים עם 500 microliters של חיץ 2, ואז פעמיים עם 500 microliters של חיץ שלוש. לאליטיון הסופי, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של חיץ 3 המכילים פפטיד FLAG ב-0.01 מיקרוגרם למיקרוליטר, וסובבו בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה וחצי.
לאחר צנטריפוגה ב 500 פעמים g במשך דקה אחת, להעביר את supernatant לצינור חדש מקורר מראש. יש ליטול 10 מיקרוליטרים כדי לטעון ב-SDS-PAGE, ולבצע הכתמת כסף של הג'ל כדי לשלוט באיכות הטיהור. אם הטיהור נראה טוב, נתח את ה- 90%שהותיר LC-MS.
כדי לבצע נורמליזציה, השתמש בנוסחאות כדי לנרמל ערכים בין תאים שטופלו בסמים ותאים לא מטופלים עבור ubiquitin ו- GFP. להסרת רקע, חיסור ערכים בדגימה של פקד GFP ערכים בדגימות ubiquitin, כדי לקבל ערכים ספציפיים עבור כל חלבון מזוהה בשני התנאים. כדי להשיג את הווריאציה של בכל מקום, לקבל ציון בין מינוס 100 פלוס 100 עבור וריאציות חיוביות ושליליות של PTMs המושרה על ידי תרופה.
ההפרש בין הערכים הספציפיים של דגימות מטופלות ודגימות לא מטופלות מחולק בסכום כל הערכים, כולל אלה בפקד, ומכפיל את ה- 100. וריאציות מתחת למינוס 50, המייצגות דיכוי של PTM, או מעל 50, המייצג אינדוקציה של PTM, נחשבות למשמעותיות. השתמש בנוסחה זו כדי להשיג ערך אמון בין אפס ל- 100%ערכים מעל 50 נחשבים בדרך כלל בטוחים.
כדי להשיג התפלגות יפה יותר של ערכי אינדוקציה ודיכוי, ולשקול הן פרמטרים וריאציה וביטחון, השתמש בנוסחה זו כדי להכפיל את ערכי השונות והביטחון. במחקר זה, התמרה של תאים יונקים תרבות הושגה כדי ליצור GFP ו 6-היסטידין דגל בכל מקום להביע תאים. היעילות של התמרה lentiviral נשלטה לראשונה על ידי התבוננות פלואורסצנטיות GFP של תאים מתומרים GFP.
הביטוי של FLAG-ubiquitin נעשה על ידי כתמי שפעת חיסונית באמצעות נוגדן נגד FLAG, אשר מראה את אחוז התאים שהתורמים. על מנת לשלוט ברמת הביטוי של FLAG-ubiquitin אקסוגני, ליזטים מתאים מתומרים נותחו על ידי SDS-PAGE ואחריו כתם מערבי עם נוגדן נגד FLAG. לאחר טיהור החלבונים בכל מקום, 10% מהאלוטיון הסופי שימש לשליטה בכמות ושלמות החומר המטוהר על ידי SDS-PAGE וכתמי כסף של הג'ל.
חיסור מדגם GFP ברקע זיהה 364 חלבונים שנמצאים בכל מקום באופן משמעותי עם ציון מעל 50%A ניתוח העשרה של ערכת גנים של חלבונים אלה בכל מקום בוצע על מנת להדגיש את התהליכים הביולוגיים שבהם הם היו מעורבים. רשתות אינטראקציה פוטנציאליות שנוצרו על ידי שינויים הנגרמים על ידי gemcitabine של בכל מקום. זה הוביל לזיהוי של רשתות אינטראקציה תפקודית מושפע מאוד על ידי בכל מקום מוגבר או ירד של החלבונים המעורבים.
זה גם אושר כי בכל מקום של PCNA גדל לאחר טיפול gemcitabine. חשוב מאוד להימנע מהעברת כמה חרוזים לאחר שני שלבי האלוטיון, שכן זה עלול לגרום לעלייה משמעותית ברקע. הליך זה ייצור שינויים ספציפיים שלאחר התרגום אשר, על ידי השוואת תנאים שונים, יאפשר זיהוי של שינויים ספציפיים.
השלב הבא יהיה לאמת לפחות את שינויים של עניין המבוסס על גישות ביוכימיות. פיתחנו שיטה זו כדי לחקור בכל מקום מבוסס, שינויים שלאחר התרגום על מנת לזהות דרכים ומנגנונים חדשים של תאים סרטניים בלבלב. מאז פרוטוקול זה אחרים שפותחו ברחבי העולם הופעלו בהצלחה כדי לפענח תהליכים ביולוגיים שונים.
יש להשתמש ב- lentiviruses לפחות במעבדת BL-2. גואנידין הוא סוכן denaturing חזק ויש להשתמש בו בזהירות. Sonicator יכול גם להזיק לאוזניים ויש להשתמש בו בעקבות המלצות.
