Vitrification מטופל בדרך כלל על ידי רעילות של סוכני cryoprotective. והוכנס מחדש לדגימות קטנות שניתן לקרר במהירות. פרוטוקול זה מאפשר ויטרציה של כמויות תאים גדולות תוך שימוש בריכוז ת"א נמוך במהלך הדגירה מראש.
באמצעות התייבשות אוסמוטית מהירה, רו"ח בין מרתפים נמוך מרוכז בהתקן הנוזלים ישירות לפני vitrification. זה מבטל את הצורך של שקיבוע מלא ריכוזי רו"ח רעילים. סגול טיפה בתפזורת עשוי לספק hepatocytes קיימא ופעילים מטבולית לשימוש השתלת hepatocytes והתקני כבד ביו מלאכותי אשר שלנו כרגע הפריע על ידי תוצאות לקויות לאחר cryopreservation.
שיטה זו עשויה להיות מותאמת vitrification של סוגי תאים אחרים כי צריך להיות cryo נשמר בכמויות גדולות;כגון מוצרי דם או תאי גזע בין היתר. כדי להתחיל, להפוך את פתרון vitrification 1 על ידי הוספת 40 מיליגרם של BSA ל 17.0 מיליליטר של פתרון אוניברסיטת ויסקונסין. השתמש במסנן 0.22 מיקרומטר כדי לסנן את הפתרון ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס.
הפוך את פתרון vitrification 2 כמתואר בפרוטוקול. וסטרילי לסנן אותו דרך מסנן 0.22 מיקרומטר. לטעון 3.5 מיליליטר של פתרון V2 מסונן סטרילי במזרק שלושה מיליליטר ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס.
כדי להכין את מנגנון vitrification טיפה בתפזורת, הראשון, לחתוך לאורך צד אחד של המחטים ערבוב שרוול אפור החיצוני. לכופף את השרוול פתוח כדי להסיר אותו מן המחט ערבוב. לאחר מכן, לחתוך את המחט ערבוב לאורך של 20 מילימטרים ולהכניס את שקע החיתוך שלה לתוך מחט הזרקת מד 20.
החלק שני מקטעי צינורות סיליקון 25 מילימטר מעל הבקתות של מחט הערבוב. ולהבטיח את עמדתם עם דבק. סטריליזציה של הרכבה זו על-ידי הפעלה אוטומטית.
ממלאים בקבוק דיואר סטרילי בחנקן נוזלי. ולעקר את החוץ עם isopropanol לפני הצבתו במכסה המנוע סטרילי לתרבות תא זרימה למינר. הקפד ללבוש ציוד מגן אישי המתאים כמו חנקן נוזלי יכול לגרום לכוויות חמורות.
כדי ליצור את התקן איסוף טיפה להכניס משפך עם קוטר חיצוני זהה לקוטר הפנימי של דיואר, לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר. באמצעות מטחות גדולות, לחץ לאט על התקן איסוף טיפות למטה בחנקן הנוזלי במצבו האנכי הסופי. ודא כי הצינור חרוט נשען במיקום אנכי בחלק התחתון של דיואר.
ומפלס החנקן הנוזלי נמוך בסנטימטר אחד מקצה המשפך. כדי להרכיב משאבת מזרק במיקום אנכי על הקיר של מכסה המנוע של תרבות התא, לקשור חוט מכפות הרגליים של משאבת המזרק לברגים בולטים מקיר מכסה המנוע של תרבות התא. לאחר מכן, מניחים את החנקן הנוזלי Dewar עם מכשיר איסוף טיפות מתחת למשאבת המזרק המותקנת אנכית.
לאחר קבלת hepatocytes עכברוש מבודד טרי, לספור את ריכוז המניות על ידי הדרה כחולה תלת פאן. ולהעביר 40 מיליון hepatocytes קיימא לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר. צנטריפוגה hepatocytes ב 50 פעמים G במשך חמש דקות ללא הפסקה.
שאף את העל-טבעי. להשעות מחדש את hepatocytes ב 3.4 מיליליטר של פתרון V1. ותידגר על קרח במשך שלוש דקות.
לאחר מכן, הוסיפו 150 מיקרוליטרים של DMSO ו-150 מיקרוליטרים של EG;ערבבו בעדינות ודגירה על הקרח שוב במשך שלוש דקות. הוסיפו 150 מיקרוליטרים של DMSO ו-150 מיקרוליטרים של EG להפטוציטים שוב והתערבבו בעדינות. לטעון 3.5 מיליליטר של תערובת זו במזרק שלושה מיליליטר.
הכנס את המזרק עם hepatocytes דגירה מראש ואת המזרק עם פתרון V2 על מתאם משאבת המזרק. חבר שני מתאמי צינור-ברב לולר לוק נקבה למזרקים. ולהחליק את צינורות הסיליקון של מכלול מחט הערבוב מעל אביזרי העקיצה.
שים את כל ההרכבה הזאת במשאבת המזרק. שלוש דקות לאחר המהדורה האחרונה של DMSO ו- EG להפטוציטים, התחל את המשאבה בשני מיליליטר לדקה. אחרי כל hepatocytes נוספו חנקן נוזלי לעצור את המשאבה.
באמצעות מחט 20 מד, לנקב 10 חורים קטנים במכסה של צינור חרוט 50 מיליליטר. ולעטוף את החלק החיצוני של המכסה עם סרט גמיש, יצירת שסתום שיאפשר את הבריחה של אידוי חנקן נוזלי שמאלי. כדי לאסוף את טיפות hepatocyte vitrified, תחילה להסיר את המשפך מן דיואר עם חנקן נוזלי.
לאחר מכן, עם מטחנות ארוכות, להוציא את הצינור חרוט המכיל את טיפות מן החנקן הנוזלי, ולאט לאט לשפוך את החנקן הנוזלי עודף מן הצינור חרוט. סגור את הצינור החרוטי עם המכסה המנוקב ולאחר מכן למקם ישירות את הצינור חרוט סגור עם טיפות hepatocyte סגול בחזרה Dewar עם חנקן נוזלי. לבסוף, להעביר את הצינור חרוט מן החנקן הנוזלי לתוך cryotank חנקן נוזלי.
לאחר יצירת פתרון המלחמה מחדש עם מדיה תרבות סוכרוז ו- DMEM hepatocyte, השתמש במסנן 0.22 מיקרומטר כדי לסנן אותו סטרילי. ואז לחמם אותו ל 37 מעלות צלזיוס. כדי לחזור hepatocytes להסיר את הצינור חרוט עם hepatocytes vitrified מן cryotank ולהעביר אותו חנקן נוזלי Dewar למכסה המנוע תת תרבות.
משחררים קלות את הכובע ומ מניחים את הצינור הקדום בחזרה בחנקן הנוזלי. עובדים במהירות, מוסיפים את כל טיפות hepatocyte סגולים לתוך מקור ריק, ולאחר מכן להוסיף במהירות 100 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס חם חיסון פתרון תוך ערבוב במשך 10 שניות. כאשר טיפות מוסרים הקפאה תוך-est חנקן נוזלי מתרחשת בתוך שניות אם טיפות לא מחדש במהירות.
לכן, זה קריטי להוסיף ישירות את התקשורת המלחמה מחדש טיפות תוך ערבוב. חלק את פתרון המלחמה מחדש עם hepatocytes לשני צינורות חרוט 50 מיליליטר. צנטריפוגה הצינורות במשך שתי דקות ב 100 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס ללא הפסקה.
שאף את העל-טבעיים להשאיר נפח כולל של 12.5 מיליליטר באמצעות סימן סיום הלימודים של הצינור כהפניה. כדי לדלל את פתרון המלחמה מחדש ל 50%להוסיף 12.5 מיליליטר של קרח קר DMEM לכל צינור חרוט. להשעות מחדש ותידגר על קרח למשך שלוש דקות.
כדי לדלל את פתרון המלחמה מחדש ל-25%להוסיף 25 מיליליטר של DMEM קר כקרח לכל צינור חרוט. לאחר צנטריפוגה במשך חמש דקות ב 50 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס ללא הפסקה, שאפו את העל-טבעי והשעו מחדש את ההפטוציטים בשני מיליליטר של מדיום התרבות הרצוי. כאשר נמדד על ידי בדיקות אי הכללה כחולות תלת פאן, אשר קובע שלמות הממברנה, סגולות טיפה בתפזורת הביא הכדאיות hepatocyte לאחר שימור ישיר של 79%זה היה גבוה באופן משמעותי מאשר 68%הכדאיות לאחר cryopreservation אופטימיזציה קלאסית.
התשואה של ויטריפיקציה טיפה בתפזורת היה 56%אשר היה 10% גבוה יותר ועקבי יותר מאשר cryopreservation קלאסי. באמצעות מטבוליזם presto-דבק assay במכללה לטווח ארוך ותרבויות כריך, פעילות מטבולית ב hepatocytes נמדד להיות גבוה באופן משמעותי לאחר סגול טיפה בתפזורת אז לאחר cryopreservation קלאסי. סינתזת אלבומין, כמו הפרמטר הנפוץ ביותר של פונקציה סינתטית של hepatocytes, היה גדול כמעט פי שניים לאחר סגול טיפה בתפזורת, ולאחר מכן לאחר cryopreservation קלאסי.
ייצור אוריאה שימש למדידת פונקציית ניקוי רעלים hepatocyte בתרבות שבוע אחד. ב hepatocytes טיפה בתפזורת סגולה, ייצור אוריאה היה גבוה משמעותית מזה ב hepatocytes cryopreserve קלאסי. לקבלת תוצאות עקביות לאחר vitrification טיפה בתפזורת חשוב בדיוק לעקוב אחר התזמון במהלך הדגירה מראש של רואי ה-IP ו לחנוך מחדש כמפורט בפרוטוקול זה.
לאחר המלחמה מחדש טיפות hepatocyte סגול אתה תהיה בסופו של דבר עם השעיה גודל טוב יותר אשר ולכן ניתן להשתמש בכל אותן דרכים כאילו הם היו מבודדים טריים. כשיטה משופרת לשימור, סגול טיפה בתפזורת עשוי להגדיל את הזמינות pri-ma למחקר ויישומים קליניים.
