קואנזים A, הנקרא CoA בקיצור, הוא גורם חשוב בחילוף החומרים התאי. מדידות כמותיות חושפות שינויים שקורים עם מצבי תזונה והורמונים במודלים של בעלי חיים. שיטה זו מכמתת את הכמות הכוללת של CoA הסלולר, כולל נגזרות CoA ו- CoA חינם, בשיטה פשוטה ואמינה.
מספר סוגים של ניוון עצבי עם הצטברות ברזל במוח קשורים עם מוטציות בגנים של המסלול הביוסינתטי CoA. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל מערכת ביולוגית מאז כל האורגניזמים דורשים CoA להישרדות, צמיחה, ותפקוד. חוקר בפעם הראשונה עשוי להיאבק עם הצעדים הראשונים בהכנת מדגם, שם חשוב לשמור על הדגימות קר לחלוטין ולאחר מכן להעביר אותם במהירות אשלגן הידרוקסיד.
להגביל את מספר הדגימות באצווה לפני העברה אשלגן הידרוקסידי, ולתרגל עם ההעברה לפני העבודה עם דגימות הניסוי. חוקרים רבים אינם מכירים מיצוי בשלב מוצק בהכנת דגימות ביולוגיות לניתוח ביוכימי מאוחר יותר. ראשית, דגירה צלחות תרבות טריליקט במקביל, שניים לניתוח ביוכימי ואחד לקביעת מספר תא קיימא.
כאשר התרבות מתקרבת צפיפות תת מודע מאוחר, למשל, תאי HepG2/C3A האנושי גדל לצפיפות של שש עד שמונה פעמים 10 לשישה או HEK 293T תאים גדל לצפיפות של כ 1.3 פעמים 10 כדי שבעה לכל צלחת 100 מילימטר, לקצור את התאים חסידים בתרבות. לאחר מכן, מוסיפים מיליליטר אחד של מים קרים כקרח לאותה מנה תרבותית. מגרדים תאים למים הקרים בצלחת, ומעבירים את מתלי התא למבחנה מזכוכית המכילה 400 מיקרוליטרים של אשלגן הידרוקסיד 0.25 טוחן ו -1.5 מיליליטר מים כדי להביא את ה- pH מעל 12.
מערבבים את ההשעיה במרץ על ידי מערבולת על גבוה במשך 10 שניות. ואז לכסות בחוזקה עם סרט פרפין, דגירה ב 55 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת בלי לרעוד באמבט מים. לאחר מכן, להוסיף 160 microliters של פתרון אחד טוחן Trizma-hydrochloride ו 10 microliters של 100 מילימולאר mBBr.
מערבבים על ידי מערבולת על גבוה במשך 10 שניות. זה מביא את ה-pH לשמונה בערך כדי לתמוך בתגובת mBBr עם CoA חינם. מכסים את הצינור עם סרט פרפין, ודגירה את הדגימות בטמפרטורת החדר במשך שעתיים בחושך עבור mBBr להגיב עם thiol של CoA.
לאחר שעתיים, מוסיפים 100 מיקרוליטרים של חומצה אצטית, ומערבבים על ידי מערבולת במשך 10 שניות כדי לעצור את התגובה. משקעים נוצרים בצינור. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 2, 000 פעמים g במשך 15 דקות.
כדי להסיר את פסולת התאים המוזרזים, להעביר ולשמור את supernatant במבחנת זכוכית לניקוי עמוד החילוץ בשלב מוצק. לפני תחילת הניתוח, להוסיף שני מיליליטר של אשלגן הידרוקסיד מילימולרי אחד למבחנה זכוכית המיועדת להכנסת בדיקה שיבוש רקמות עם homogenizer רוטור-סטטור. שמור את הצינור על קרח עד השימוש.
לשקול את חתיכות רקמה קפואה במהירות, ולתזמן את המשקל הרטוב עבור כל מדגם. מעבירים את הרקמה לצינור הזכוכית, ומעבירים את הרקמה להומוגניזציה למשך 30 שניות. הימנע הפשרה מלאה של הרקמה.
מוסיפים 500 מיקרוליטרים של אשלגן הידרוקסיד 0.25 טוחן. מערבולת על גבוה במשך 10 שניות, ולשמור על קרח. זה מביא את ה- pH של המדגם מעל 12 כדי הידרוליזה thioesters CoA להניב CoA הכולל.
מכסים את הצינור עם סרט פרפין. הכנת תאים מתורבתים והכנת רקמות הם הצעדים הקריטיים ביותר בהליך זה. חשוב להוסיף אשלגן הידרוקסיד גבוה במהירות כדי למנוע השפלה CoA.
דגירה הדגימות ב 55 מעלות צלזיוס במשך שעתיים באמבט מים מבלי לרעוד כדי לתמוך הידרוליזה. לאחר מכן, להוסיף 150 microliters של אחד טוחן Trizma-hydrochloride ו 10 microliters של 100 מילימולאר mBBr להביא את ה- pH על שמונה לתמיכה בתגובת mBBr עם CoA חינם. מערבולת על גבוה במשך 10 שניות.
מכסים את הצינור עם סרט פרפין, ודגירה את הדגימות בטמפרטורת החדר במשך שעתיים בחושך כדי להבטיח את כל CoA נגזר עם mBBr. לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של חומצה אצטית, ומערבולת על גבוה במשך 10 שניות כדי לעצור את התגובה. צנטריפוגה ב 2, 000 פעמים g במשך 15 דקות כדי גלולה פסולת תאים זירז, ולהעביר את supernatant לתוך מבחנה זכוכית לניקוי עמוד החילוץ בשלב מוצק.
בטמפרטורת החדר, לצייד כל עמוד ג'ל חד פעמי חד-מיליליטר 2-2-פירידל-אתיל סיליקה עם מיליליטר אחד של חיץ לשטוף כדי להבטיח כי הקבוצה הפונקציונלית פירידל הוא protonated ויתפקד כמחליף אניון. לאחר מכן, פיפטה על-טבעי מדגם על העמודה, ולאסוף את eluate. לשטוף את העמוד פעמיים עם מיליליטר אחד של חיץ לשטוף ופעם אחת עם מיליליטר אחד של מים כדי להסיר כל מינים נגועים.
לאחר מכן, לתוך מבחנה זכוכית נפרדת, לשטוף את העמוד פעמיים עם מיליליטר אחד של חיץ אלוטיון כדי לאסוף את CoA-bimane. יבש את דגימת CoA-bimane בצינור תחת גז חנקן. לאטום, לכסות לחלוטין את הצינור, ולאחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס.
כאשר אתה מוכן לניתוח HPLC, יש למצות את הדגימה ב-300 מיקרוליטרים של מים, ולערבב במרץ על-ידי מערבולת גבוהה למשך 10 שניות. מעבירים את הדגימה המתווסת למסנן צינור צנטריפוגה, וצנטריפוגה ב 5, 000 פעמים גרם במשך 10 דקות כדי להסיר כל תריס. לאחר מכן, העבר את הדגימה המסוננת לבקבוקון זכוכית המתאים להזרקת HPLC.
במחקר זה, פרופיל HPLC מייצג מציג את זמן השמירה של תקן CoA-bimane בעמודה C18 HPLC. כמויות הולכות וגדלות של תקן CoA-bimane הוזרקו בנפרד, ואת האזורים מתחת לפסגות הכרומטוגרמות CoA-bimane היו התווה כפונקציה של CoA-bimane קלט. העקומה הסטנדרטית שיקפה את עוצמת הספיגה של CoA-bimane באורך גל של 393 ננומטר.
הפלואורסצנטיות של CoA-bimane באה לידי ביטוי גם באורך גל העירור של 393 ננומטר ואורך גל פליטה של 470 ננומטר. הפרדת HPLC עוקבת ופרופילי זיהוי אופייניים עבור כבד עכבר או תאי C3A מתורבתים אנושיים מסומנים כאן על ידי פסגות אדומות, עם זמן שמירה בין 11 ל -12 דקות באמצעות תוכנית האלוטיון. אם התגובה עם mBBr אינה מניבה תוצאות הניתנות לגילוי, ייתכן שיהיה צורך להתאים את כמות Trizma-HCl כדי להוריד את ה- pH לשמונה בקירוב.
ניתן לזהות מולקולות תאיות נוספות המכילות מותי סולף-הידרויל או תיואסטר כנגזרות בימאן. לדוגמה, ניתן לזהות גלוטתיון-בימאן בשיטת HPLC. טכניקה זו תאפשר לחוקרים אחרים לחקור את התפקיד הפוטנציאלי של תפקוד לקוי של CoA הקשורים לחוסר איזון מטבולי, כגון מודלים של בעלי חיים של סוכרת מסוג 2.
החוקרים צריכים להשתמש בציוד מגן אישי בעת עבודה עם ממיסים אורגניים המשמשים להפקת שלב מוצק.
