Kultivierende Fibroblasten in Sphäroid rekapitulieren Tumorgewebe viel besser als das häufig verwendete 2D-System auf steifem Kunststoff. Es ermöglicht, Fibroblasten Differenzierung in einer tumorähnlichen Umgebung zu studieren. Bei dieser Methode beeinflusst die Steifigkeit der Zellkultur plastische Arbeit nicht künstlich die Fibroblastendifferenzierung.
Stattdessen kann der Einfluss der Zellmatrix-Interaktion auf die tumorinduzierte Differenzierung von Fibroblasten in vitro analysiert werden. Um dieses Verfahren zu beginnen, erhalten Sie die Zellkultur-Medien, die MEM mit 1%Wärme inaktiviert FBS und 1%Penicillin Streptomycin ergänzt ist. Erhalten Sie auch eine Methylcelluloselösung mit sechs Milligramm pro Milliliter.
Mischen Sie einen Teil der Methylcellulose mit drei Teilen der Zellkulturmedien, um die Sphäroid-Bildungslösung vorzubereiten. Heben Sie frisch aufgetaute verewigte normale Fibroblasten oder andere Zelltypen wieder auf, wie im Textprotokoll in der Sphäroidbildungslösung aufgeführt. Wenn Zytokine oder Integrin-Inhibitoren in der Studie enthalten sind, fügen Sie diese Verbindungen der Zellsuspension hinzu, um sie während ihrer Bildung in die Sphäroide einzubetten.
Gegebenenfalls fügen Sie Inhibitorverbindungen zusammen mit 10 Nanogramm pro Milliliter TGF beta one hinzu, um eine Differenzierung in verewigten normalen Fibroblasten auszulösen. Verteilen Sie 100 Mikroliter der Sphäroid-Formationslösung in jeden Brunnen einer runden 96-Multi-Well-Platte. Pipette die Lösung in jedem gut nach oben und unten mehrmals zu mischen.
Dann inkubieren Sie die Platte im Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 24 Stunden, damit ein Sphäroid in jedem Brunnen gebildet werden kann. Schneiden Sie zunächst das Ende einer Pipettenspitze ab, um die Öffnung zu vergrößern. Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, verwenden Sie diese geschnittene Pipette, um die Sphäroide in einem 1,5 Milliliter Reaktionsrohr pro Versuchszustand oder pro zu analysierendem Protein zu sammeln.
Zentrifugieren Sie die Sphäroide bei 1000 mal G für etwa 30 bis 60 Sekunden. Entfernen Sie vorsichtig die Methylcellulose enthaltenden Überstand durch Pipetten, um sicherzustellen, dass die pelletierten Sphäroide nicht stören. Besondere Vorsicht ist bei der Übertragung der Sphäroide auf die Reaktionsröhrchen zu beachten.
Stellen Sie sicher, dass Sie keine Scherendriftkräfte haben, indem Sie die Spitze schneiden. Es ist auch wichtig, dass Sie alle Sphäroide sammeln. Stellen Sie während des Waschschritts sicher, dass Sie die Sphäroide nicht durch Aspiration verlieren.
Zum Waschen der Sphäroide fügen Sie 50 Mikroliter eines X PBS hinzu. Zentrifuge bei 1000 mal G für 30 bis 60 Sekunden. Entfernen Sie dann vorsichtig die PBS durch Pipettieren.
Je nach zu färbendem Protein die Sphäroide entweder mit 50 Mikrolitern 4%Paraformaldehyd und PBS 20 Minuten bei Raumtemperatur fixieren. Waschen Sie die Sphäroide mit PBS, wie zuvor beschrieben. Permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,1%Triton X und PBS für vier Minuten bei Raumtemperatur.
Waschen Sie dann die Sphäroide in PBS dreimal wie zuvor beschrieben. Fügen Sie PBS mit 5%FBS und 2%BSA zu den Sphäroiden hinzu und brüten sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur, um unspezifische Proteininteraktionsstellen zu blockieren. Jetzt inkubieren Sie die Sphäroide mit 30 Mikroliter primärer Antikörper und PBS mit 2,5% FBS und 1%BSA bei vier Grad Celsius über Nacht.
Waschen Sie am nächsten Tag die Sphäroide in PBS dreimal wie zuvor beschrieben. Danach die Sphäroide mit 30 Mikrolitern Sekundärantikörpern und PBS mit 2,5%FBS und 1%BSA bei Raumtemperatur 90 Minuten inkubieren. Waschen Sie die Sphäroide in PBS dreimal wie zuvor beschrieben.
Als nächstes inkubieren Sie die Zellen mit 30 Mikroliter dappy Färbung Lösung für vier Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Sphäroide in PBS einmal wie zuvor beschrieben. Mit einer glasigen Pasteurpipette legen Sie die Sphäroide auf eine Glasrutsche und einen Tropfen PBS.
Verwenden Sie ein Laser-Scanning-Mikroskop, um die Sphäroide durch Fluoreszenzmikroskopie bei einer Vergrößerung von 10 Mal abzubilden. Nehmen Sie verschiedene optische Querschnitt des Sphäroids in verschiedenen optischen Ebenen des Z-Stacks. Ein repräsentatives Bild der immunfluoreszenten Färbung der Homo-Sphäroide normaler Pankreas-Fibroblasten im Vergleich zu den Homo-Sphäroiden von unsterblichen Krebsassoziierten Fibroblasten zeigt ein erhöhtes Signal für die Alpha-Drei-Untereinheit in den differenzierten Zellen.
Das Fluoreszenzsignal der Zellen im Sphäroid wird dann mit den Z-Stack-Bildern des 3D-Sphäroids quantifiziert und die Transkriptionsniveaus des Integrin-Alpha-Drei-Untereinheitsgens werden durch qPCR bestimmt. Alle diese Ergebnisse zeigen, dass integrin alpha 3 in verewigten Krebs assoziierten Fibroblasten im Vergleich zum normalen Pendant hochreguliert ist. Dies beweist, dass integrin alpha drei Beta ein kann als Marker für Pankreas-Fibroblasten Differenzierung betrachtet werden.
Diese Methode ist ideal geeignet, um Selbstgewebe zu kapitulieren, das in der Regel in Organen und Krebsmassen vorkommt, wo die zusätzliche Zellmatrixsteifigkeit das Zellschicksal bestimmt. Sphäroide Kultur ist ein vielseitiges Modell, das mit anderen analytischen Assays nach Sphäroiddissoziation wie Menge Echtzeit-PCR und volle Zytometrie kombiniert werden kann. Paraformaldehyd, das zur Fixierung der Sphäroide verwendet wird, ist ein gefährliches chemisches Mittel.
Handschuhe und Augenbekleidung sollten zum Schutz getragen werden.
