פרוטוקול זה הוא תוצאה של הערכת היבטים מרכזיים של הכנת ספריית circRNA, כגון סוג ערכה, טיפול R, כמויות קלט והשפעתם על זיהוי circRNA. היא מאפשרת זיהוי circRNA אופטימלי ומספקת נתונים על פרמטרים מתכווננים בהתאם לצרכי המשתמש. זיהוי circRNAs בסוגי מדגם שונים יעזור לנו להבין טוב יותר את התפלגות הביטוי שלהם ומגדיר את הבמה לתיווים התפקיד התפקודי של מולקולות אלה.
ניתן להחיל שיטה זו על כל דגימת RNA כוללת. חשוב לשמור דגימות RNA על קרח לפני תחילת הפרוטוקול. להעריך את ערכי RIN ו DV200 על Bioanalyzer Agilent או TapeStation לפני ההכנה, ובצע את ההליכים המתאימים בעת עבודה עם RNA.
התחל בדילול ה-RNA הכולל לארבעה מיקרוגרם ב-39 מיקרוליטרים של מים נטולי RNase והגדלתו מעלה ומטה כדי לערבב. בצינור נפרד, השתמש 1x RNase R Buffer כדי לדלל את R לריכוז עבודה של שתי יחידות לכל microliter. פיפטה 39 microliters של RNA הכולל וחמישה microliters של 10x RNase R תגובה Buffer לתוך צינור תגובה 1.5 מיקרוליטר, ומערבבים.
מוסיפים שישה מיקרוליטרים של RNase R.Then מדולל ואז להתאים את פיפטה לנפח תגובה מלא, ומערבבים את הפתרון על ידי צינור למעלה ולמטה 10 פעמים. מניחים את הצינור באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, מוודאים כי נפח התגובה המלא שקוע באמבט המים. לאחר מכן, מניחים את הצינור על קרח, ומיד להמשיך עם ניקוי RNA וריכוז.
לפני ההתחלה, הכינו את מאגר שטיפת ה-RNA על ידי ערבוב התרכיז עם 48 מיליליטר של 100% אתנול, והניחו עמודי טיהור בצינורות איסוף. כאשר אתה מוכן, הוסף שני אמצעי אחסון של מאגר איגוד RNA לדגימה R שטופלה ב- RNase וערבב היטב. הוסיפו 150 מיקרוליטרים של 100% אתנול לתערובת למשך 300 מיקרוליטרים בסך הכל, העברו את כל אמצעי האחסון לעמודה וצנטריפוגה למשך 30 שניות.
הסר את הזרימה דרך, ולהוסיף 400 microliters של מאגר הכנת RNA ישירות לעמודה. צנטריפוגה במשך 30 שניות, ולזרוק את הזרימה דרך. לאחר מכן, להוסיף 700 microliters של מאגר לשטוף RNA לעמודה, צנטריפוגה במשך 30 שניות, ולזרוק את הזרימה דרך.
הוסיפו עוד 400 מיקרוליטרים של חיץ הכביסה, צנטריפוגה לשתי דקות, והעברו את העמודה לצינור טרי נטול RNase באורך 1.5 מיליליטר. בזהירות להוסיף 11 microliters של מים ללא RNase ישירות לעמודה על ידי החזקת קצה פיפטה ממש מעל מסנן העמודה. תן את המדגם לשבת במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן צנטריפוגה זה במשך דקה אחת.
ודא שיש זרימה דרך הצינור 1.5 מיליליטר, ולזרוק את העמודה. ניתן לאחסן את דגימת ה-RNA המטוהרת במינוס 80 מעלות צלזיוס או להשתמש בה באופן מיידי להכנת הספרייה. העבר 10 מיקרוליטרים של ה-RNA הכולל המטוהר לנקייה בצלחת PCR של 96 באר.
הוסף חמישה microliters של מאגר כריכה rRNA ואחריו חמישה microliters של rRNA הסרת תערובת, ולאחר מכן בעדינות פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב את ריאגנטים. לאטום את הצלחת, ולהדחיר אותו במשך חמש דקות ב 68 מעלות צלזיוס על בלוק תרמוצ'ילר מתוכנת מראש וחומם מראש. לאחר הדגירה, תן לצלחת לשבת בטמפרטורת החדר במשך דקה אחת.
הסר את החותם מהצלחת, והוסף 35 מיקרוליטרים של מערבולת טמפרטורת החדר rRNA הסרת חרוזים לדגימה. כוונן את הפיפיטה ל-45 מיקרוליטרים, ואת פיגט למעלה ולמטה 10 עד 20 פעמים כדי לערבב ביסודיות. תן לצלחת לשבת בטמפרטורת החדר במשך דקה אחת.
מעבירים את הצלחת למצב מגנטי, ודקרים אותה שם לדקה אחת או עד שהפתרון מתבהר. מעבירים את העל-טבעי ל באר חדשה על הצלחת. ואז להעביר את הצלחת מהעמוד המגנטי לדוכן הצלחת.
Vortex RNA ניקוי חרוזים עד שהם מפוזרים היטב, ולהוסיף 99 microliters של חרוזים לדגימה. פיפטה למעלה ולמטה לערבב, ו דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. מעבירים את הצלחת לעמוד המגנטי, ומשאירים אותה שם במשך חמש דקות או עד שהפתרון מתנקה, ואז מסירים ומשליכים את כל העל-טבעי מה באר.
כשהצלחת עדיין על המגנטיות, הוסיפו 200 מיקרוליטרים של אתנול 80% מוכן טרי לבאגם מבלי לשבש את חרוזים. השאירו את האתנול היטב במשך 30 שניות, ולאחר מכן להסיר ולהשליך אותו. הוסיפו 11 מיקרוליטרים של מאגר אלוטיון ל באר, והוסיפו אותה למעלה ולמטה כדי לערבב.
הדגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך שתי דקות, ולאחר מכן להעביר אותו בחזרה לעמוד המגנטי, ולשמור אותו שם עד הפתרון מתנקה. מעבירים 8.5 מיקרוליטרים של העל-טבעי ל הבאר החדשה על אותה צלחת, ומוסיפים 8.5 מיקרוליטרים של Elute, Primer, Fragment High Mix לכל באר המכילה דגימה. פיפטה מעלה ומטה 10 פעמים כדי לערבב ביסודיות, לאטום את הצלחת, ולהדחיר אותו במשך שמונה דקות בתרמוצ'יקלר שחומם מראש ל -94 מעלות צלזיוס.
מקררים את הדגימה לארבע מעלות צלזיוס, מסירים את הצלחת מהתרמוצ'ילר, וצנטריפוגים אותה לזמן קצר. שתי ערכות הכנה לספרייה, TruSeq ו- KAPA, הוערכו עבור פרוטוקול זה. בסך הכל, מספר גבוה יותר של RNAs מעגליים ואחוז נמוך יותר של RNA ריבוזומלי זוהה בעת שימוש בערכת TruSeq, כך TruSeq נבחר לניסויים נוספים.
המשמעות של טיפול מקדים R R R הוערכה על-ידי השוואת הנתונים שנוצרו מספריות מטופלות מראש ולא מטופלות מראש. כצפוי, מספר גבוה יותר של RNAs מעגליים זוהה באופן עקבי בספריות שטופלו מראש בהשוואה לספריות שאינן מטופלות מראש. כמות ה- RNA של הקלט הייתה ממוטבת לזיהוי מגוון גבוה יותר של RNAs מעגליים.
ספריות הוכנו באמצעות אחד, שניים וארבעה מיקרוגרם של RNA קלט, ואת המגוון הגבוה ביותר של מיני RNA עגול נצפתה בעת שימוש ארבעה מיקרוגרם של RNA הכולל. הפרוטוקול האופטימי שימש להשוואת שפעי רנ"א מעגליים בחמישה אזורי מוח מארבעה תורמים בריאים ולסוגי רקמות אחרים משישה תורמים בריאים. בסך הכל, שפע גבוה יותר של RNase מעגלי נצפתה במוח בהשוואה לסוגי רקמות אחרים.
חשוב לזכור לעקוב אחר נהלים מתאימים בעת עבודה עם RNA, כולל ללבוש כפפות, לנקות ביסודיות את הספסל ואת pipettes עם מגבונים RNase או לרסס לפני תחילת הפרוטוקול, ושמירה על RNA על קרח מראש. לאחר הליך זה, ניתן לבצע אימות אורתוגונלי כגון רצף סנגר של צמתים circRNA מזוהים. הגילוי של circRNAs חדשים וראיות נוספות של נוכחותם גילוף את תחום חדש של מחקר לחקר הפונקציות הביולוגיות שלהם.
