חוקרים יצרו בעבר וירוסי שפעת רקומביננטיים המבטאת כתבי חלבון פלואורסצנטיים או ביולומינסנטיים. חלק מהביטוי היחיד שלנו של גנים עיתונאיים בנגיף שפעת מגביל מאוד את השימוש בו בניסויים. הפרוטוקול שלנו מתאר את השימוש בנגיף שפעת bireporter המבטא הן גנים כתב פלואורסצנטי ביולומינסנט, ולכן מגזים את המגבלה שלה.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא השימוש בנגיף שפעת רקומביננטי יחיד עבור במבחנה ו in vivo מחקרים. בעת ביצוע טכניקה זו, הזרקה מהירה של מצע לוציפראז ותכנון נכון של טיפול בעכברים חשוב, כי המצע הוא מטבוליזם במהירות. כמו כן, גילוח של עכברים מומלץ לשפר את הגילוי של אות bioluminescent.
כדי להדביק את העכברים, להתחיל על ידי הכנת BIRFLU ב 1X PBS. לשמור על הנגיף על קרח עד חיסון. בדוק את היעדר רפלקס צביטת בוהן כדי לוודא שהעכבר הוא הרדמה, ולחסן אותו תוך-זמנית עם דילול BIRFLU מוכן.
ודא שכל העכברים נושמים כראוי לפני החזרתם לכלובים שלהם. פתח את תוכנת ההדמיה ולחץ על אתחול ולאחר מכן הגדר את הפרמטרים שישמשו להדמיה. כדי לפקח על העכברים נגועים BIRFLU, לגלח את החזה שלהם כדי לשפר את הגילוי של אות bioluminescent.
לאחר העכברים הם הרדמה, להשתמש במחט מד 22 כדי לנהל רטרו במסלול 100 microliters של מצע Nluc luciferase, מדולל אחד עד 10 ב PBS. מיד לאחר ההזרקה, מניחים את בעלי החיים בתא הבידוד עם החזה שלהם פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, מניחים את תא הבידוד במכשיר ההדמיה, סוגרים את הדלת ורוכשים תמונות.
לאחר ההדמיה, להחזיר את העכברים לכלובים שלהם ולפקח עליהם עד שהם התאוששו באופן מלא. השתמש בכלי ROI של תוכנת ההדמיה כדי לנתח את נתוני הביולומינציה הנרכשים על ידי ייעוד אזור מעניין ואמצעי לחיצה. כדי לבצע הדמיית אקס ויוו של ריאות עכבר, לאסוף את הריאות על פי הוראות כתב היד, להתחיל את התוכנה לרכישת תמונה, ולהגדיר את הפרמטרים להדמיה.
לאחר אתחול המכונה, מניחים את הריאות במגש רקע שחור, ומבטיחים שהרקמות יופרדו זו מהן. הכניסו את המגש לתמונה, סגרו את הדלת ורכשו תמונות. לאחר הדמיה, להסיר את הרקמות מיד ולאחסן אותם על קרח בארבע מעלות צלזיוס אם הדגימות יעובדו באותו יום.
אם הם יעובדו מאוחר יותר, להקפיא אותם במהירות בצינור על קרח יבש, ולאחסן אותם ב 80 מעלות צלזיוס. לעיבוד התמונות, בחרו בכלי ROI, ציירו אזורי עניין סביב כל אחת מהריאות הבודדות ולחצו על המידה. BIRFLU התאפיינה במבחנה על ידי קביעת ונוס, Nluc, ו NP רמות ביטוי בתאים נגועים.
ביטוי ונוס ו- Nluc מזוהים רק בתאים הנגועים על ידי BIRFLU, בעוד NP מתבטא הן בתאי PR8 מסוג פראי והן בתאים נגועים ב- BIRFLU. לא נצפה ביטוי בתאים נגועים בדמה. יתר על כן, פעילות Nluc נמדדה בתרבות הרקמה על טבעי ב 24, 48, 72, ו 96 שעות לאחר ההדבקה.
הוא מזוהה כבר 24 שעות לאחר ההדבקה, ואת רמות הביטוי להגדיל ב 96 שעות. ניתן גם להדגים כי קינטיקה שכפול של BIRFLU דומים וירוס PR8 מסוג פראי. BIRFLU יש את היכולת לבטא הן גנים כתב פלואורסצנטי ביולומינסנט, ואת המתאם בין השניים ניתן להעריך באמצעות הדמיה vivo ו ex vivo של ריאה העכבר.
הריאות של עכברים נגועים BIRFLU הראו ביולומינציה גבוהה vivo ו פלואורסצנטיות אקס ויוו. טיטרים ויראליים ויציבות גנטית של BIRFLU ב vivo נקבעו גם. מנתונים פלאק על וירוסים מריאות העכבר הראו כי הנגיף יכול ליצור לוחות ולהביע את שני הגנים הכתב.
BIRFLU יכול לשמש גם כדי להעריך את האפקטיביות של נוגדנים אנטי ויראליים ונטרול נגד שפעת. הפלט מתנאים אלה כולם היו בקורלציה אחד עם השני והם מהירים וקלים לעשות.
