עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מתקן Core Microarray סקריפס, וחוזה מן המרכז לבקרת מחלות (JCP). RPdV היא כלת מענק הרוביקון ו Veni מההסתדרות הולנד למחקר מדעי (NWO). המאגד עבור glycomics פונקציונלית (http://www.functionalglycomics.org/) במימון NIGMS מענק GM62116 (JCP) סיפק כמה גליקנים השתמשו במחקר זה. זהו פרסום 29,113 ממכון המחקר סקריפס.

הערה: כל השלבים מבוצעים בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת. בניית Array 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת glycan והגדרת פלייט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו מלאי של חיץ הדפסה. תחילה הפוך 500 מ&quot;ל של פתרון המניות 150 מ&quot;מ של פוספט נתרן dibasic. גם לעשות 50 מ&quot;ל של פתרון המניות 150 מ&quot;מ של פתרון פוספט נתרן monobasic. בבקבוק, באמצעות בר ומערבבים מגנטי מטר pH, לאט לכיל הפתרון פוספט נתרן dibasic עם הפתרון monobasic עד pH של 8.5 הוא הגיע. הוספת Tween-20 0.005%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את דגימות glycan. לדלל PAA גליקנים מצומדות, (diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA), 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA) ו 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA (איור 1A הם להיות מדולל)) כדי 100μg / ml דפוס חיץ מן step1.1.1. גליקנים חד ערכי,diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ- (CH 2) 3 NH 2, 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ - (CH 2) 3 NH 2) ו 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1- 4GlcNAcβ - (CH 2) 3 NH 2)) כדי 100μM במאגר הדפסה משלב 1.1.1. לבסוף, להכין את הצבעים פונקציונליים האמינים, להשתמש כסמני רשת / אורות נחיתה. כתמים סמן דיי מודפסים ב 1 מיקרומטר. הערה: צבע Atto488-NHS משמש הדפסים שלנו. עם זאת, כל צבען פונקציונלי אמין, קריא על ידי סורק השקופיות מתאים למטרה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 10 μl של כל דגימה glycan צלחות microtiter 384 גם משמש לטיפול רובוט הדפסה. חנות גליקנים בשימוש בתמיסת חיץ הדפסה ב -20 מעלות צלזיוס צינורות אטומים. Tansfer 10 μl של סמן צבע לצלחת הדפסה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הַדפָּסָה הערה: כל STEps כי חששו לגעת או להזיז את המגלשות חייבים להיעשות עם כפפות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח סיכות arrayer בראש ההדפסה על פי התצורה הנכונה של הפריסה. עבור פריסה זו להשתמש סיכה אחת כדי להדפיס את כל הדגימות ומערכים. הדפס את גליקנים בבלוקים של שש, מדלגי תכונה אחת (תכונה מוגדרת נקודה אחת של תרכובת מסוימת), בכל צד, כך כתם של המדגם הזהה אינם מודפסים בדיוק זה לצד זה. הערה: משתמש הקצה חייב להחליט את התצורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר שקופית משקיות, קופסות פתוחות, ולהסיר כל חלקיקי אבק או חתיכות קטנות של פלסטיק שעשויה להיות על פני השטח שלהם על ידי פיצוץ גז חנקן טוהר גבוה במיוחד על כל שקופית. מניחים את המספר הרצוי של שקופיות, צד מצופה למעלה, על הבמה arrayer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תכנת את arrayer, השתמש בפרמטרים של 27 נקודות בכל ביקור לצלחת מקור, באמצעות 3 &quot;טרום כתמים&quot; על גבי שקופיות מצופה פולי- L- ליזין, כדי להסיר עודפי נוזלים על קצה סיכות הדפסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל MPU (יחידת כוח ראשית) יחידת בקרת האקלים. התוכנה להרחיב ניתוח ריצוף במחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פריסה בחר את האותיות. בחרו כלי פין אפשרויות → לשמש להדפסת כלי הדפסת המערך 1 x 1 - 1 סיכה אחת. בחר בכרטיסייה יעד → Definition מערך כלי → תבנית הדפסה ולהוסיף המגרש (spot-אל-המקום מרחק), מספר שורות ועמודות כדי להכיל דגימות שיודפס, ואת תבנית ההדפסה של דגימות (עבור מערך זה 8 8 x דפוס הדפסה משמש ב 340 מיקרומטר מגרש עבור 7 מכלל דגימות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר פריסת שקופיות יעד → ולתכנת את מרחק בלוק ל-בלוק כדי לאפשר הדפסה של כל מערך לשכפל לתוך תבנית שקופית 48-היטב (4 x 12). בחר מקור ולהוסיף מספר טנדרי מקור (1 עבור כל דגימה בעת שימוש 1 פינים) (עבור טנדרי מקור הדפסת 7 זה ישמש כדי להכיל 6 בארות מדגם סמן צבע 1 היטב). הערה: מקור הדיאלוג צריך להפוך לירוק כדי להראות כי המספרביקורי מקור תואמות את הדגימות שתודפסנה בדפוס ההדפסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר פלייט מתאם → יעד וחלק פריסה ולהתאים את מספר השקופיות (5 מגלשות מודפסות בכל פעם עבור בהדפסה עם שקף 1 תצפית מראש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את המגש על ידי לחיצה על כפתור T1 כדי להפעיל את המגש ולהוסיף את המספר הרצוי של שקופיות למגש, הקדשת תשומת לב למקומות של השקופית מראש התצפית (הכחולה) &quot;אמיתיות&quot; שקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח שקופיות זכוכית רגילות על כל יציאות הוואקום הנותרים לחסום את החלל ולחץ על אישור כדי להפעיל את הוואקום. בדוק שכל השקופיות מוחזקות במקום ולחץ על אישור כדי להחזיר את המגש למיקום הביתה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את צלחת ההדפסה לתוך מחזיק הצלחת ולהבטיח המדף הוגדר כראוי במקום. לחץ GO ולאפשר את תהליך ההדפסה כדי להמשיך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדפס את 24 הנקודות שנותרו משכפל של 6 נקודות לכל מערך (4 מערכים / מקור הביקור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את 384 גם הצלחותלתוך המדפסת להתחיל בהדפסה. לשמור על לחות יחסית, במהלך ההדפסה, ברחבי ההדפסה בין 55 ו -65%. המדפסת מפסיקה לאחר הדפסת 5 שקופיות. הערה: בעוד microarray assay זה מודפס בדפוס 8 x 8 ספציפי, רובוטי הדפסת microarray שונים ידרשו תכנות ציוד ספציפי כדי להשיג את הפריסה הרצויה. זה תלוי למשתמש הקצה כדי לקבוע את הדפוס המתאים ביותר בהתחשב מפרט הציוד שלהם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחות / משתקות הערה: לאחר שקופיות סיום הדפסה, הם עוברים שלב קיבוע זמני, גם humidifying שנקרא. Humidifying-הדפסה פוסט עוזר homogenize את הקובץ המצורף מדגם ידי מחדש להרטיב את הנקודות ולהבטיח חסימה מלאה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים שקופיות בתא לחות 100% מיד לאחר ההדפסה לתקופה של 30 דק &#39;. לבנות את החדר על ידי צבת מגבות נייר רטובות מאוד שטוחות בחלקו התחתון של צלחת זכוכית גדולה, צבת השקופיותעל איזה מדף, כגון למעלה בצד מתלה מבחנה, הדפסה, ואיטום בניילון נצמד כדי ללכוד את הלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספר המחליק עם אלכוהול / עט חנות עמידות ממסים סימון בקופסא התייבשות. לייבש לילה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספור, חסימה, ואחסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את החיץ חסימה - 50 מ&quot;מ ethanolamine ב 50 מ&quot;מ חיץ borate. ראשית, לפזר חומצה בורה, DDH 2 O, לריכוז סופי של 50 מ&quot;מימ בבקבוק המכיל בר ומערבבים מגנטי. מערבב את הפתרון נמרצות על צלחת ערבוב עד שכל המוצק נמס. תוך ערבוב מתמיד, להוסיף את הכמות המתאימה של ethanolamine מפתרון 16.54 M המניה להגיע 50 ריכוז מ&quot;מ הרצוי. הוספת סודיום הידרוקסיד מרוכז להסתגל pH הסופי של 9.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את השקופיות מודפסות הפתרון למאגר החסימה עבור שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות 1 hr, לשטוף את שקופיות DDH 2 O כדי להסיר כל עקבות עודפות של חיץ חסימה.השלך חיץ חסימה מיכל פסולת מתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת שקופיות לבעלי מכתים זכוכית ספין יבש. מערכים יבשים על ידי הצבה בצנטריפוגה מצוידת מחזיקי צלחת מתנדנד, במהירות של 10 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השקופיות הן יבשות, הם יכולים להיות מודגרות מייד או שומרים אותו. תנאי אחסון הם -20 ° C בתוך שקית פלסטיק אטומה. </li></ol></li></ol> 2. ניתוח חלבונים מחייב glycan <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו תא humidified שבו מערכים להיות הכלאה יתאים. חדר פשוט מורכב תבנית פיירקס, שכבתי בתחתית עם מגבות נייר לחות ו מתל, שעליו השקופיות תנחנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש לקטינים biotinylated SNA (agglutinin סמבוקה nigra) ו ECA (Erythrina cristagalli agglutinin) ב 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל + 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל של צבע streptavidin-555, ב חיטוט חיץ (PBS + 0.01% Tween-20). עבור HA (A / וייטנאם / 1203/04 H5N1 ו- A / KY / 07 H1N1, בדוגמה זו), שימושריכוז התחלתי של 20 מיקרוגרם / מ&quot;ל מראש ומורכבת, כפי שתואר לעיל 34. בקצרה, לעשות HA: עכבר-α-סטרפטוקוקוס: תערובת עיזים-α-עכבר-Alexa647 בחסימת המאגר (PBS + 3% BSA + 0.01% Tween-20), בכל 4: יחס טוחנת 1: 2. הערה: המערך ומישש עם לקטינים כדי לוודא גליקנים הם משותקים ו לגילוי (איור 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הפתרון לערבב חלבון-נוגדן מחייב glycan של 20 μl לצלחת 384 גם לדגור על קרח למשך 30 דקות. סדרתי לדלל לקטינים ו HA דגימות 1: 1, במאגר שלהם מתאימה, 8 פעמים, על ידי ערבוב 10 μl של המדגם עם 10 μl של חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 8 μl של המדגם על פני השטח מיקרו-היטב דגירה של humidification אטום (100% לחות יחסית) תא במשך 90 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את השקופיות אחד בכל פעם על ידי לחיצה על בקצוות טבילתם ארבע פעמים בתערובת של PBS ו 0.05% Tween, אז ארבע פעמים PBS, ולבסוף ארבע פעמים deionized H 2 O. שימושבאותו פרוטוקול הייבוש שמתואר בשלב החסימה, לסובב את המערכים לייבש בצנטריפוגה במשך 5 דקות ב 10 x ז. </li></ol> 3. ניתוח סריקת נתונים הערה: microarrays glycan ניתן לסרוק על הגדרות שונות, בהתאם ליצרן של סורק microarray. על ידי שינוי כוח לייזר רזולוציה, המכשיר יכול לייצר תמונה עם אותות רבים ככל האפשר בתוך הטווח הדינמי שלה (תרשים 1C). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בסורק שקופיות פלורסנט ולסרוק את המערכים מייד לאחר דגירה עם החלבונים המחייבים glycan. תשמור על מנת להבטיח את השקופית מוכנסת כהלכה לתוך מכשיר הסריקה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכנת סריקה להרחיב. לחץ על התחל כדי לפתוח את התוכנית. להתחבר סורק: Connect → סורק או כפתור ירוק &#39;מתפריט החלונית ניווט סורק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלת autoloader להרחיב של הסורק. מניח שקופיות חריצי autoloader בסדר מסוימים. דלת autoloader סגורה. Clאיכס &quot;לקרוא מטעין&quot; בחלונית ניווט כלים לזהות אוטומטית שקופיות הסורק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גדר פרמטר סריקה: פרמטרי סריקת → הסורק מתאימים הניסוי (למשל 635 כוח הליזר גבוה, רווח זיהוי 50%). שקופיות סריקה: סורק → סריקה. בחר נתיב-ידי יצירת תיקייה לשמור את תמונות סריקה וסריקות בודדות שם. האם לפני זה כדי הסריקה בפועל. חזור על הפעולה עבור כל שקופית הפרט. לחץ על אישור כדי להתחיל בסריקה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת הסורק כדי להגדיר את המכשיר לסרוק את השקופיות. סורק הגדר כדי לסרוק באופן איטרטיבי בהספק לייזר נמוך (5 mW) עם חיזוק הגדרות רווח של 25%, 50% ו -75%. הערה: ההגדרות תוכלנה להיבדק ולקבל טיפול מותאם, אך יש לזכור כי כל סריקה יכולה להפחית את תפוקת הקרינה של הצבעים בשל photobleaching. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישת תוכנת ניתוח נתוני פתיחה כגון תוכנות Mapix. לחץ על התחל כדי לפתוח את התוכנית. התמונה הסרוקה להרחיב: קובץ → im פתוחגיל. קובץ GAL להרחיב: נתח → רשת פתוחה ובחר בקובץ GAL המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן בלוקים מצב: תמונה → בלוקים מצב להזיז את הרשת. השתמש בסמנים ברשת כדי להגדיר את הרשת אל המיקום המתאים בשקופית. התאם בלוקים בודדים לפי צורך להתאים את המערך המודפס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זן כתמי מצב: תמונת → מצב כתם להתאים מיקום וגודל של מקומות מסוימים בתוך הבלוק. לאחר כל אבני כתמים מותאמים ובמקום, עוצמות אות מידה ידי לנתח חישובים photometric →. שמור את קובץ הפלט. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השקופיות סיימו סריקה, תמונות מנותחות לכריכת אותות עם תכנית עיבוד תמונה המותקנת (האיור 1D - G). לניתוח תמונה, לטעון קובץ GAL (רשימת Array) מעל התמונה TIFF סרק. הערה: קובץ GAL מכיל הוא את דפוס פריסת ספוט זהותם של כל מיקום נקודה. קבצי GAL עבור מערכים הם created ידי תוכנת המדפסת באמצעות קובץ טקסט מופרד באמצעות טאבים המכיל את זהותם של דגימות ומיקומם בצלחת מקור 384 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש אורות רשת סמן / נחיתה מודפסים על microarrays למקם את רשת GAL כראוי. מקומות מסוימים ייתכן שיהיה צורך להתרגש בנפרד, אלא מערך מודפס היטב יאפשר בדרך כלל בלוקים בתוך הרשת להציב בקלות. בעקבות מיקום הרשת, לאסוף עוצמות במקום על ידי התוכנה והציל כקובץ טקסט מופרד באמצעות טאבים (.txt). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תוכנת גיליונות אלקטרוניים, לפתוח את קובץ הפלט מהסורק. פתח את קובץ מאקרו המתאים ממיקום התיקייה. לחץ על הצג → מאקרו → RunMacro. הערה: כתובה מראש יעתיק את נתוני תפוקת גלם, להסיר שורות ועמודות מיותרות, למיין הנתונים לפי מדגם, לחשב את ערכי רקע מינוס אות תוחלת הממוצעים ואת העלילה ערכי הנובע ממנו אל גיליון עבודת התפשטות גיליון המכיל את הגרפים עבור כל מששת samples נבדק על המערך. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Tumpey, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-amino+acid+change+in+the+hemagglutinin+of+the+1918+influenza+virus+abolishes+transmission.">A two-amino acid change in the hemagglutinin of the 1918 influenza virus abolishes transmission.</a> Science. 315 (5812), 655-659 (2007).</li><li>Xu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+balance+of+the+hemagglutinin+and+neuraminidase+activities+accompanies+the+emergence+of+the+2009+H1N1+influenza+pandemic.">Functional balance of the hemagglutinin and neuraminidase activities accompanies the emergence of the 2009 H1N1 influenza pandemic.</a> J Virol. 86 (17), 9221-9232 (2012).</li><li>Bouvier, N. M., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+influenza+viruses.">The biology of influenza viruses.</a> Vaccine. 26, D49-D53 (2008).</li><li>Freidl, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+at+the+animal-human+interface:+a+review+of+the+literature+for+virological+evidence+of+human+infection+with+swine+or+avian+influenza+viruses+other+than+A(H5N1).">Influenza at the animal-human interface: a review of the literature for virological evidence of human infection with swine or avian influenza viruses other than A(H5N1).</a> Euro Surveill. 19 (18), (2014).</li><li>Xu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+recognition+of+avian-like+receptors+in+human+influenza+A+H7N9+viruses.">Preferential recognition of avian-like receptors in human influenza A H7N9 viruses.</a> Science. 342 (6163), 1230-1235 (2013).</li><li>Paulson, J. C., de Vries, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H5N1+receptor+specificity+as+a+factor+in+pandemic+risk.">H5N1 receptor specificity as a factor in pandemic risk.</a> Virus Res. 178 (1), 99-113 (2013).</li><li>Tzarum, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+receptor+binding+of+the+hemagglutinin+from+a+human+H6N1+influenza+virus.">Structure and receptor binding of the hemagglutinin from a human H6N1 influenza virus.</a> Cell Host Microbe. 17 (3), 369-376 (2015).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Human-Infecting+H10N8+Influenza+Virus+Retains+a+Strong+Preference+for+Avian-type+Receptors.">A Human-Infecting H10N8 Influenza Virus Retains a Strong Preference for Avian-type Receptors.</a> Cell Host Microbe. 17 (3), 377-384 (2015).</li><li>Carroll, S. M., Higa, H. H., Paulson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+cell-surface+receptor+determinants+of+antigenically+similar+influenza+virus+hemagglutinins.">Different cell-surface receptor determinants of antigenically similar influenza virus hemagglutinins.</a> J Biol Chem. 256 (16), 8357-8363 (1981).</li><li>Gambaryan, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+receptor-binding+phenotypes+of+influenza+virus+isolates+from+different+hosts+using+synthetic+sialylglycopolymers:+non-egg-adapted+human+H1+and+H3+influenza+A+and+influenza+B+viruses+share+a+common+high+binding+affinity+for+6'-sialyl(N-acetyllactosamine).">Specification of receptor-binding phenotypes of influenza virus isolates from different hosts using synthetic sialylglycopolymers: non-egg-adapted human H1 and H3 influenza A and influenza B viruses share a common high binding affinity for 6'-sialyl(N-acetyllactosamine).</a> Virology. 232 (2), 345-350 (1997).</li><li>Rogers, G. N., D'Souza, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+binding+properties+of+human+and+animal+H1+influenza+virus+isolates.">Receptor binding properties of human and animal H1 influenza virus isolates.</a> Virology. 173 (1), 317-322 (1989).</li><li>Rogers, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+amino+acid+substitutions+in+influenza+haemagglutinin+change+receptor+binding+specificity.">Single amino acid substitutions in influenza haemagglutinin change receptor binding specificity.</a> Nature. 304 (5921), 76-78 (1983).</li><li>Paulson, J. C., Rogers, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resialylated+erythrocytes+for+assessment+of+the+specificity+of+sialyloligosaccharide+binding+proteins.">Resialylated erythrocytes for assessment of the specificity of sialyloligosaccharide binding proteins.</a> Methods Enzymol. 138, 162-168 (1987).</li><li>Paulson, J. C., Sadler, J. E., Hill, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+specific+myxovirus+receptors+to+asialoerythrocytes+by+incorporation+of+sialic+acid+with+pure+sialyltransferases.">Restoration of specific myxovirus receptors to asialoerythrocytes by incorporation of sialic acid with pure sialyltransferases.</a> J Biol Chem. 254 (6), 2120-2124 (1979).</li><li>Chutinimitkul, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assessment+of+attachment+pattern+and+replication+efficiency+of+H5N1+influenza+A+viruses+with+altered+receptor+specificity.">In vitro assessment of attachment pattern and replication efficiency of H5N1 influenza A viruses with altered receptor specificity.</a> J Virol. 84 (13), 6825-6833 (2010).</li><li>Glaser, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+amino+acid+substitution+in+1918+influenza+virus+hemagglutinin+changes+receptor+binding+specificity.">A single amino acid substitution in 1918 influenza virus hemagglutinin changes receptor binding specificity.</a> J Virol. 79 (17), 11533-11536 (2005).</li><li>Herfst, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airborne+transmission+of+influenza+A/H5N1+virus+between+ferrets.">Airborne transmission of influenza A/H5N1 virus between ferrets.</a> Science. 336 (6088), 1534-1541 (2012).</li><li>Nobusawa, E., Ishihara, H., Morishita, T., Sato, K., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Change+in+receptor-binding+specificity+of+recent+human+influenza+A+viruses+(H3N2):+a+single+amino+acid+change+in+hemagglutinin+altered+its+recognition+of+sialyloligosaccharides.">Change in receptor-binding specificity of recent human influenza A viruses (H3N2): a single amino acid change in hemagglutinin altered its recognition of sialyloligosaccharides.</a> Virology. 278 (2), 587-596 (2000).</li><li>Gambaryan, A. S., Matrosovich, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+solid-phase+enzyme-linked+assay+for+influenza+virus+receptor-binding+activity.">A solid-phase enzyme-linked assay for influenza virus receptor-binding activity.</a> J Virol Methods. 39 (1-2), 111-123 (1992).</li><li>Totani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoenzymatic+synthesis+and+application+of+glycopolymers+containing+multivalent+sialyloligosaccharides+with+a+poly(L-glutamic+acid)+backbone+for+inhibition+of+infection+by+influenza+viruses.">Chemoenzymatic synthesis and application of glycopolymers containing multivalent sialyloligosaccharides with a poly(L-glutamic acid) backbone for inhibition of infection by influenza viruses.</a> Glycobiology. 13 (5), 315-326 (2003).</li><li>Gambaryan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+specificity+of+influenza+viruses+from+birds+and+mammals:+new+data+on+involvement+of+the+inner+fragments+of+the+carbohydrate+chain.">Receptor specificity of influenza viruses from birds and mammals: new data on involvement of the inner fragments of the carbohydrate chain.</a> Virology. 334 (2), 276-283 (2005).</li><li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+specificity+of+influenza+A+viruses+correlates+with+the+agglutination+of+erythrocytes+from+different+animal+species.">Receptor specificity of influenza A viruses correlates with the agglutination of erythrocytes from different animal species.</a> Virology. 227 (2), 493-499 (1997).</li><li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquisition+of+human-type+receptor+binding+specificity+by+new+H5N1+influenza+virus+sublineages+during+their+emergence+in+birds+in+Egypt.">Acquisition of human-type receptor binding specificity by new H5N1 influenza virus sublineages during their emergence in birds in Egypt.</a> PLoS Pathog. 7 (5), e1002068 (2011).</li><li>Chandrasekaran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycan+topology+determines+human+adaptation+of+avian+H5N1+virus+hemagglutinin.">Glycan topology determines human adaptation of avian H5N1 virus hemagglutinin.</a> Nat Biotechnol. 26 (1), 107-113 (2008).</li><li>Blixt, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printed+covalent+glycan+array+for+ligand+profiling+of+diverse+glycan+binding+proteins.">Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (49), 17033-17038 (2004).</li><li>Childs, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-binding+specificity+of+pandemic+influenza+A+(H1N1)+2009+virus+determined+by+carbohydrate+microarray.">Receptor-binding specificity of pandemic influenza A (H1N1) 2009 virus determined by carbohydrate microarray.</a> Nat Biotechnol. 27 (9), 797-799 (2009).</li><li>Nycholat, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+Sialylated+Poly-N-acetyllactosamine+Chains+on+N-+and+O-Linked+Glycans+by+Human+and+Avian+Influenza+A+Virus+Hemagglutinins.">Recognition of Sialylated Poly-N-acetyllactosamine Chains on N- and O-Linked Glycans by Human and Avian Influenza A Virus Hemagglutinins.</a> Angew Chem Int Ed Engl. , (2012).</li><li>Rillahan, C. D., Paulson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycan+microarrays+for+decoding+the+glycome.">Glycan microarrays for decoding the glycome.</a> Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).</li><li>Song, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sialylated+glycan+microarray+reveals+novel+interactions+of+modified+sialic+acids+with+proteins+and+viruses.">A sialylated glycan microarray reveals novel interactions of modified sialic acids with proteins and viruses.</a> J Biol Chem. 286 (36), 31610-31622 (2011).</li><li>Gulati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+H3N2+Influenza+Viruses+Isolated+from+1968+To+2012+Show+Varying+Preference+for+Receptor+Substructures+with+No+Apparent+Consequences+for+Disease+or+Spread.">Human H3N2 Influenza Viruses Isolated from 1968 To 2012 Show Varying Preference for Receptor Substructures with No Apparent Consequences for Disease or Spread.</a> PLoS One. 8 (6), (2013).</li><li>Stevens, J., Blixt, O., Paulson, J. C., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycan+microarray+technologies:+tools+to+survey+host+specificity+of+influenza+viruses.">Glycan microarray technologies: tools to survey host specificity of influenza viruses.</a> Nat Rev Microbiol. 4 (11), 857-864 (2006).</li><li>de Vries, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+hemagglutinin+protein+of+the+new+pandemic+H1N1+influenza+virus:+maintaining+optimal+receptor+binding+by+compensatory+substitutions.">Evolution of the hemagglutinin protein of the new pandemic H1N1 influenza virus: maintaining optimal receptor binding by compensatory substitutions.</a> J Virol. 87 (24), 13868-13877 (2013).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+receptor+binding+preferences+of+recombinant+human+A(H3N2)+virus+hemagglutinins.">Structure and receptor binding preferences of recombinant human A(H3N2) virus hemagglutinins.</a> Virology. 477, 18-31 (2015).</li><li>de Vries, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influenza+A+virus+hemagglutinin+glycosylation+state+affects+receptor-binding+specificity.">The influenza A virus hemagglutinin glycosylation state affects receptor-binding specificity.</a> Virology. 403 (1), 17-25 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

הערכה סגולית הקולטן IAV היא צעד חשוב בניתוח פוטנציאל מגיפת וירוסי עופות. הכרת חומצת sialic ידי הנגיף קשור לכמה מאפיינים ביולוגיים כגון קשירה ושחרור מהתא. ידיעה אשר מוטציות-חומצת אמינו נחוצות וירוסי עופות להשיג α2-6 מחייבים ולחצות את מחסום המינים מאפשר מוכן לקראת מגפה. מבחנים כמה משמשים כדי לקבוע סגוליות הקולטן; יש עם זאת, כל החסרונות שלהם, כולל להיטות מדידה בלבד ולא סגולי ולהיפך. כאן אנו מתארים כלי רומן מיניאטורי מבוססים על שימוש נרחב ומקובל ELISA, אשר משתמש שברי מסוף צמוד PAA של גליקנים מורכבים יותר. השימוש מוגדר היטב 4 לקטינים, 2 של מפעל ו -2 של שפעת A ממוצא וירוס, אנו מראים כי אנחנו שומרים על סגוליות להיטות יחסית. כאשר אנו מחשבים את כמות ההקטנה של כימיקלים biologiCal שמוצג miniaturizing ELISA על גבי שבב מערך glycan, נגיע הבדלים גדולים להפליא. ראשית, ביולוגיות; אנו משתמשים נפח assay פחות 10x ולהשתמש 6 תרכובות בדיקה ב 6 משכפל; זה יכול להיות מחושב כדי להיות שווה ערך של 36x שורות 96-גם הצלחות. התוצאה היא כי אנו משתמשים 360x ביולוגיים פחות. צעדים קריטיים כוללות הדפסה נכונה את הסיכון מרקע כלכלי גבוה באמצעות סוכנים מחייב glycan unpurified או נוגדנים גילוי עניים. התרכובות המשמשות assay זה, אם כי עדיין זמין, אינן עשוי בקלות בסינתזת האנזימטית הכימותרפיה. שימוש בטכנולוגיה microarray-דפוס, כל נקודה היא רק 2 NL, לעומת 100 μl לכל גם צלחת microtiter. הדפסת שקופיות יחיד המכיל 48 בארות 6 תרכובות, ב 6 משכפל, שאנו צורכים כ 1,152 NL. הליך הציפוי אותו בתוצאות צלחות 96-היטב ציפוי סך של 1,842 בארות עם 100 μl של מתחם באותו הריכוז. לכן, הדפסה tהוא מתחם לעומת assay הצלחת, אנו משיגים הפחתה מובהקת 1,500x. לכן, בסך הכל, ביולוגיות מופחתות 360 פי וצריכת glycan ב -1,500 פי. באמצעות מטפלי נוזלי רובוטית, אנו צופים כי מרבית הפעולות יכולות להיות אוטומטיות, המאפשרות assay כולו לשמש כמסך תפוקה גבוהה. למרות microarrays ההדפסה וניתוחי תמונה הבאים דורשים מכונות וכלים מיוחדים, מכשירים אלה אינם נדירים נוכחים באוניברסיטות רבות ומכונים. הדפסה ישירה ואינו דורש שינויים כימיים. לכן, אנו מאמינים כי, עם כמות מינימאלית זו של תרכובות וטכניקת הדפסה פשוטה, assay זה יכול להיות כללי יותר ישים. כפי שהיא מקטינה את נפח הדגירה, העלויות של נוגדנים וביולוגיה יקרה, טכניקה זו תהפוך את זה אפשרי עבור מעבדות עם משאבים מוגבלים כדי להעריך סגולי של IAV או חלבונים מחייבים glycan אחרים עם איכות גבוהה תוך השמירה על עלות נמוכה יותרים.

עופות מים ברים הם המאגר הטבעי של IAV, אבל IAV הוא מסוגל לחצות את מחסום המינים כדי עופות ויונקים, כולל בני אדם. IAVS עופות להכיר חומצות sialic α2-3 צמוד (קולטנים מסוג העופות), ואילו וירוסי אדם להיקשר α2-6 חומצות sialic צמודות (קולטנים מסוג האדם). כדי להיות מסוגל לשכפל ביעילות ולהעביר בין בני האדם IAV עופות צריך להיקשר לקולטנים מסוג האדם 1. IAVS מחולקים לפי סרולוגיה המאפיינת את antigenicity של hemagglutinin שלהם (HA) נורמינידאז גליקופרוטאינים המעטפה (NA). HA נקשר חומצות sialic, ואילו NA הוא האנזים להרוס קולטן בקצה השני של מחזור החיים של נגיפי ודבק sialic חומצה 2. כל הווירוסים מדביקים האדם, כולל H1N1, H2N2 ו H3N2, יש מוצא עופות 3. בשנים של העשורים האחרונים עופות כדי crossovers אדם התרחש, עם H5N1, H7N7, H7N9 ו להיות הכי ידוע; HoweVer, תת אחרים נגועים בני האדם יותר באופן ספוראדי (H6N1, H7N1, H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4. למרבה המזל, נראה כי אף אחד הווירוסים הללו הצליחו להסתגל באופן מלא לקולטנים חומצת sialic אדם מהסוג צמוד α2-6 5-8. הסתגלות של וירוסים zoonotic העופות או אחרים כדי להתאים שכפול והעברת ב המארחים אדם יכול להיות בעל השפעה הרסנית על בריאות האדם. לכן, ידע מוקדם של כמה וירוסים אלה מתפתחים להיקשר לקולטנים אדם מהסוג יעזרו מעקב חובק-עולם של נגיפי שפעת מתעוררים. קביעת העדפת קולטן הובררה ראשונה באמצעות אריתרוציטים של מינים שונים ונשארת assay מועדף בקרב כל חוקרי שפעת 9-12. ההפגנה כי וירוסים העופות להכיר חומצה sialic α2-3 ווירוסים האדם α2-6 מקושר חומצה sialic התבססה במקור על assay באמצעות hemagglutination של אריתרוציטים מהונדסים enzymatically להכיל כל אחד linkages 13,14. למרות ההודעה היא hemagglutination, assay תקן וירולוגים, מבני glycan הבסיסיים אינם מוגדרים, הצמדת המסוף בלבד. בנוסף, הזמינות המוגבלת של sialyltransferases, המשמש מחדש sialylate התאים, מצמצמת את השימוש של assay זה 15-18. בהמשך לכך, שיטות אחרות של בקביעת העדפות מחייב קולטן הוכנסו באמצעות מבנים glycan sialylated צמוד פולי-acrylamide (PAA) או פולי-גלוטמט (PGA) מבנים מבוססי מבחני צלחת 19,20. כמה וריאציות אפשריות ציפוי גם את גליקנים או וירוסי צלחות microtiter, שכל אחת מהן התוצאה היא assay ELISA מהסוג איתנה, אמינות מאוד רגישה 21-23. לחלופין, גליקנים צמודים ביוטין יכולים להחליף PAA / PGA וניתן מצומדות כדי צלחות streptavidin מצופה 2,24. למרות שהחלק סר ספציפי עשויים להידרש, ELISAs הם גליקנים תקן וכמה צמוד PAA הם בקלות commercially ושאינם זמינים מסחרית (קונסורציום glycomics פונקציונלית (http://www.functionalglycomics.org)). טכנולוגיות microarray glycan צמחו כמו כלי רב ערך כדי לקבוע סגוליות הקולטן, כפי הם הבחינו גליקנים שונים מרובים, והיקשרות מגוון רחב של מבנים שונים ניתן להעריך בתוך assay יחיד 25-29. עקידת IAV במבנים אלו מספקת הבנה טובה יותר של מבנים glycan כי IAV מזהה מועדף 30-33. microarrays glycan דורש כמויות קטנות של נפח דגימה לבצע assay מחייב ורק משתמש בכמויות זעירות של glycan לכל נקודה (2 nl). עם זאת, מערכים אלו משמשים בדרך כלל רק להעריך סגוליים של קולטנים גליקנים. ניתוח של וירוסים מרובים, או חלבוני hemagglutinin, בטווחי ריכוז מרובים יכול להיות מונע בשל מספר השקופיות הנדרשות. יתר על כן, עד כה, לא assay להיטות ביחס פותח באמצעות ar glycanטכניקות ray. כדי לשלב את דרישת המדגם הנמוכה המוענקת על ידי טכניקות microarray glycan ואת הרגישות של גליקנים צמודים PAA מבחנים מבוססים ELISA, בקשנו לפתח מערך glycan רב גם שיאפשר ניתוח תפוקה גבוהה עם רזולוציה דומה או טובה יותר לעומת אל assay ELISA המבוסס המסורתי. במקביל, רצינו לצמצם את כמות ביולוגיות וכימיקלי כתב נצרכו. התוצאה הסופית היא assay להיטות מיניאטורי, שפותחה במיוחד עבור ניטור סגולי IAV והוא ישים באותה מידה להעריך חלבונים מחייבים glycan אחרים. באמצעות שקופיות זכוכית מתחלקות 48-בארות מייקרו ידי מסכת טפלון, 6 גליקנים שונים הם הבחינו ב 6 משכפל לכל טוב. פלטפורמת microarray מקנה המגמות אותו קולטן כריכה לראות בפורמט מאקרו ELISA עם מספר יתרונות. אלה כוללים (I) הדפסה של המתחם ב 6 משכפל, באמצעות מדגם מינימלי, לעומת ציפוי של כמה שורות אניצלחת נה, באמצעות 100 μl לכל היטב; (II) תרכובות שונות מרובות נתחו במקביל באר יחיד, לרבות בקרות; (III) ירידה מסיבית נפח דגירה; (IV) טווח דינמי גדול יותר באמצעות הודעת ניאון. שקופית יחידה ניתן לחשב להיות שווה ערך ל 18x 96-גם הצלחות. עם הפרוטוקול הבא, מסוגל במעבדה כל בפברוק וניתוח הבחין microarrays אמור להיות מסוגל לייצר פורמט ELISA מיניאטורי זה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NEXTERION&#174; Slide H MPX-48&#160;</td>
			<td>Schott</td>
			<td>1091525</td>
			<td>Microwell slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProScanArray Plus&#160;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>confocal microarray scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Innoscan 1100AL Scanner/Mapix Software</td>
			<td>Innopsys</td>
			<td>-</td>
			<td>confocal microarray scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroGrid II&#160;</td>
			<td>Digilab</td>
			<td>-</td>
			<td>microaray printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNA</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>B-1305&#160;</td>
			<td>Plant Lectin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECA</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>B-1145&#160;</td>
			<td>Plant Lectin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Strep Antibody</td>
			<td>IBA</td>
			<td>2-1509-001&#160;</td>
			<td>Anitbody for HA binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Alexa-647</td>
			<td>Life</td>
			<td>A-21235</td>
			<td>Anitbody for HA binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287&#160;</td>
			<td>detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-basic Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>255793</td>
			<td>printing buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mono-basic Sodium phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>229903&#160;</td>
			<td>printing buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-l-lysine solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920&#160;</td>
			<td>pre-spotting slide component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221465</td>
			<td>pre-spotting slide component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>493546</td>
			<td>pre-spotting slide component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td>incubation/washing buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMP4B pins</td>
			<td>Telechem</td>
			<td>SMP4B</td>
			<td>printing pin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed Nitrogen (Grade5)</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>UN1066</td>
			<td>general dusting/drying tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6768-500G</td>
			<td>Slide blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9508-500ML</td>
			<td>Slide blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atto 488</td>
			<td>AttoTec</td>
			<td>AD 488-91</td>
			<td>Gridmarker on array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAA-LNLN</td>
			<td>Consortium for Functional Glycomics</td>
			<td>PA368</td>
			<td>Spotted glycans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAA-3SLNLN</td>
			<td>Consortium for Functional Glycomics</td>
			<td>PA362</td>
			<td>Spotted glycans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAA-6SLNLN</td>
			<td>Consortium for Functional Glycomics</td>
			<td>PA343</td>
			<td>Spotted glycans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LNLN</td>
			<td>Consortium for Functional Glycomics</td>
			<td>Te98</td>
			<td>Spotted glycans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3SLNLN</td>
			<td>Consortium for Functional Glycomics</td>
			<td>Te175</td>
			<td>Spotted glycans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6SLNLN</td>
			<td>Consortium for Functional Glycomics</td>
			<td>Te176</td>
			<td>Spotted glycans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well microtiter plate</td>
			<td>Matrix TechCorp</td>
			<td>4361</td>
			<td>Printing plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR lab marker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52877-150</td>
			<td>Slide Numbering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton slide staining dish</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z103969-1EA</td>
			<td>Blocking and Drying</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a miniaturized glycan microarray assay for assessing avidity and specificity of influenza a virus hemagglutinins

שפעת וירוס (IAV) hemagglutinins להכיר חומצות sialic על פני התא קולטנים תפקודית כדי לזכות הכניסה לתאי. עופות מים ברים הם המאגר הטבעי של IAV, אבל IAV יכול לחצות את מחסום המינים כדי עופות, חזירים, סוסים ובני אדם. וירוסים העופות להכיר חומצה sialic מחוברת גלקטוז הלפני אחרון על ידי הצמדה α2-3 (קולטנים מסוג העופות) ואילו וירוסים האדם מעדיפים להכיר חומצה sialic עם הצמדה α2-6 (קולטנים מטיפוס אנושי). כדי לפקח אם וירוסים העופות מסתגלים קולטנים מסוג אדם, מספר שיטות שניתן להשתמש בהם. microarrays glycan עם ספריות מגוונות של sialosides הסינתטי משמש יותר ויותר להעריך סגוליות הקולטן. עם זאת, הטכניקה הזו לא נעשה שימוש למדידת avidities. מדידת הלהיטות בדרך כלל מושגת על ידי הערכת עקידת hemagglutinin בדילול סדרתי או וירוס גליקנים שנספחו 96-גם צלחות פוליפרופילן קונבנציונליות. ב assay זה, גליקנים עם α2-3 או α2-6 חומצות sialic הם מצמידים את ביוטין שנספחו צלחות streptavidin, או הם מצמידים את polyacrylamide (PAA) אשר לספוג ישירות פלסטיק. יש לנו מיניאטורי משמעותי assay זה על ידי הדפסה ישירות sialosides PAA צמודי עמיתיהם PAA הלא צמוד שלהם בשקופיות זכוכית מיקרו היטב. הגדרה זו, עם 48 מערכים בשקופית אחת, מאפשרת מבחני סימולטני של 6 glycan מחייב חלבונים ב -8 דילולים, חוקר 6 גליקנים שונים, כולל שני פקדים שאינם sialylated. זה שווה 18x 96-גם צלחות ב assay הצלחת המסורתית. פורמט המערך glycan פוחת צריכת תרכובות וביולוגיה ובכך משפר את יעילות.

הדפסה, סריקה &amp; Data מנתח כדי להבטיח הדפסה נכונה, זה חיוני כדי לקבל את היישור הנכון של הרשת הבחינה בתוך מסכת הטפלון, המתווה כל מערך בשקופית. במהלך ההדפסה, בשל האופי של ציפוי טפלון, כתמים שלא ניתן לראות בעין בלתי מזוינת בשקופיות MPX. תשומת לב מוקדשת ואז הופעת הכתמים מראש בשקופיות פולי- L- ליזין המצופות. מייד לאחר הדפסה, כל שקופית צריכה להיבדק על ידי עין לנוכחות של כל מתחם הבחין כי הוא גלוי בשל המלחים של למאגר המיובש במקום. מערכים נבדקים על יישור נכון של כתמים בגבולות הטפלון המספר נכון של תכונות הבחינו. שקופיות נסרקות תהליך חוזר ונשנה של התחתון לשלטון סריקה גבוה כדי למנוע הלבנת תמונה המאפשר השוואה של בפוהלהיטות ממנה להנמיך חלבוני מחייב להיטות, אשר יש יותר ויותר אותות תפוקה נמוכים, בהתאמה. בעקבות סריקה, עוצמת הניאון של כל נקודה ונקודה בתמונות הפלט נמדדת באמצעות תכנית הדמיה. מערך כל יכסה עם קובץ לרשת התואמת את מספר התכונות מודפסות על פני שטח המערך (1D איור - G). באמצעות צבעי ניאון מודפסים, הגבולות של גליקנים מודפסים מוגדרים ומסכה כי היא משולבת עם הזהות של המדגם מודפס lassoes כל נקודה. מסכת ההדמיה לאסו תתעד את כל ההיבטים של מקום ההדמיה (גודל, עוצמת אות, קואורדינטות ברשת, וכו &#39;) ופלט המידע הזה לקובץ טקסט מופרד באמצעות טאבים. באמצעות תוכנת לווח (גיליון אלקטרוני), הדגימות מסודרות על ידי זהות ואת עוצמת האות הממוצעת מינוס רקע בממוצע לכל 4 מתוך 6 הנקודות עבור כל דגימה, משמיטה את האות הגבוה ביותר והנמוך ביותר כמו חריגים. גרף קו של אות ממוצעת ממוצעתרקע מינוס זמם נגד השמונה ריכוזי החלבון להחיל את המערך ומכיל שורה אחת עבור כל דגימה. גרף הפלט הסופי מוחלק באמצעות חישוב רגרסיה שאינו ליניארי (איור 1 ט). Glycan מחייב חלבונים The-Array PAA משמש כדי להעריך סגוליות מחייב לקולטן של שפעת A hemagglutinins וירוס. מאפיין נוסף של המערך שלנו, לא נוכח assay הצלחת המקביל, הוא ההכללה של בקרות שאינן sialylated באותה מייקרו-היטב. כדי להעריך כי תרכובות מודפסות נוכחים לאחר הדפסה, צמח נפוץ לקטינים עם סגוליות ידועות שמשו. ECA נקשר גלקטוז מסוף מקושר β1-4 כדי N- אצטיל-גלוקוזמין (Galβ1-4GlcNAc או LacNAc) ולא לאגד אם גלקטוז המסוף כתרים עם חומצה sialic. ECA רק מזהה את גליקנים הלא sialylated על arr glycan מיניאטורי שלנואיים (איור 2 א). העדר מחייב לכל מדגימות glycan sialylated הוא גם מעיד כי אלה הם כתרים מלאים עם חומצת sialic סופנית. לקבלת α2-6 חומצה sialic צמוד, SNA שימש כביקורת לקטינים (איור 2 ב). כצפוי, SNA נקשר רק α2-6 מקושרות חומצות sialic, אבל עם הבדלים ראויים לציון ב זיקה צמודה PAA חזרות di-LacNAc הלא צמודות PAA. פער זה משקף את הרגישות של גליקנים צמודים PAA ומאפשר אפלית חלבונים שעשויים להיקשר עם להיטות נמוכה. לקבלת α2-3 חומצה sialic צמוד, גידול hemagglutinin H5 נגזר A / וייטנאם / 1203/04 וירוס כי ידוע להכיר α2-3 חומצות sialic מקושר היה בשימוש רק 6. הפרופיל המחייב של H5 HA אכן מראה וספציפי α2-3 חומצות sialic צמודות, עם להיטות גבוהה עבור מבני PAA-הצמודים (איור 2 ג). לבסוף, hemagglutinin H1 מן הזן אנושי עונתי H1N1 שמש כי, כצפוי, רקכבול α2-6 המכיל מבני sialic חומצה צמודים (2D איור). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53847/53847fig1.jpg" /> איור 1: הדפסה, סריקה ותמונה מנתח (א) 6SLNLN PAA מצומדות מוצג כמבנה glycan נציג כי הוא מודפס על שקופיות הזכוכית.. (ב) קבוצה מתחיל חלבון glycan מחייב על מערך glycan רב גם מוצג עם נפח 8 μl שיוצר אגל על פני שטח המערך. (ג) לאחר דגירה של החלבונים המחייבים glycan על המערך והסריקה בתוך סורק שקופיות פלורסנט confocal, תמונה מייצגת מתקבלת. (D) התמונה תכסה עם שני וערב, באמצעות סמני רשת עבור יישור תקין, ניתן לנתח את הנקודות היחידות. (E) תקריב של סט שלם של 8 מערכים, שבה חלבון מחייב glycan יחידנותח באמצעות שמונה 1: 1 דילולים. (F) מערך יחיד, בתוך באר אחת מיוצגת; המערך יהיה demarked ידי סמני הרשת בפינה הימנית העליונה (3 נקודות) ואת השמאלית תחתונה (2 נקודות), חלבון מחייב glycan זה נקשר תרכובת אחת על המערך בתור לשכפל של שישה נראה בבירור. (G), הגריד מוצג עם lassos המקיפה מקומות מסוימים ספציפיים. (H) הדמית תוכנת מחשבת ערכי אות מקובץ תמונת פלטי קובץ נתונים מופרדים באמצעות טאבים. (I) ניתן נספרים הנתונים בגיליון או תוכנת stastical כדי ליצור גרף פלט נציג. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53847/53847fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53847/53847fig2.jpg" /> איור 2: פלט של לקטינים צמח (ECA, SNA) ו IAV המהgglutinins עם ספציפיות שונות (H5 מ- A / וייטנאם / 1203/04, H1 מ- A / קנטאקי / 07). (א) ECA נקשר LacNAc מסוף או Galb1-4GlcNAc ספציפי מזהה נוכחות של תרכובות אי-sialylated, לשמש שולטת עבור hemagglutinins IAV. (ב) SNA מכיר רק גליקנים ועליו חומצה sialic α2-6 סופנית. (ג) hemagglutinin רקומביננטי של H5N1 (A / וייטנאם / 1203/04) זן נקשר α2-3 חומצות sialic ומספק פרופיל מחייב קולטן מסוג העופות. (ד) hemagglutinin רקומביננטי של H1N1 עונתית האדם (A / קנטאקי / 07) נקשר לקולטנים מסוג האנושי בלבד. עוצמת האות פלורסנט נמדדה על כל מקום, ולהתכוון עוצמת מינוס מתכוון רקע משתמש מחושב תוכנת גיליונות אלקטרוניים. עבור כל glycan, עוצמת האות הממוצעת מחושבת 6 משכפל כתמים. האותות הגבוהים והנמוכים של 6 משכפל יוסרו הנותרים 4 העתקtes משמש לחישוב האות הממוצע, סטיית תקן (SD), ומדידת סטיית התקן (SEM). הגרפים מייצגים את רקע מינוס אות הממוצע בממוצע לכל ברי מדגם וטעייה הם ערך SEM. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53847/53847fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins at JoVE.com

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

Assay Microarray מיניאטורי glycan להערכת הלהיטות וספציפיות של Hemagglutinins וירוס שפעת A

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

a-miniaturized-glycan-microarray-assay-for-assessing-avidity

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.9K Views.  The Scripps Research Institute. Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

Video: A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

באמצעות הדמיה Bioluminescent לחקור סינרגיזם בין Streptococcus pneumoniae ו שפעת וירוס עכברים תינוקות

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

באמצעות assay הפאן ויראלי microarray (Virochip) אל מסך דוגמאות קליניות עבור פתוגנים ויראליים

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5 For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus have been demonstrated.6-11 The identification and subtyping of influenza on DNA microarrays has applications in both public health and the clinic for early detection, rapid intervention, and minimizing the impact of an influenza pandemic. Traditional fluorescence is currently the most commonly used microarray detection method. However, as microarray technology progresses towards clinical use,1 replacing expensive instrumentation with low cost detection technology exhibiting similar performance characteristics to fluorescence will make microarray assays more attractive and cost-effective.
The ampliPHOX colorimetric detection technology is intended for research applications, and has a limit of detection within one order of magnitude of traditional fluorescence11, with a main advantage being an approximate ten-fold lower instrument cost compared to the confocal microarray scanners required for fluorescence microarray detection. Another advantage is the compact size of the instrument which allows for portability and flexibility, unlike traditional fluorescence instruments. Because the polymerization technology is not as inherently linear as fluorescence detection, however, it is best suited for lower density microarray applications in which a yes/no answer for the presence of a certain sequence is desired, such as for pathogen detection arrays. Currently the maximum spot density compatible with ampliPHOX detection is &tilde;1800 spots/array. Because of the spot density limitations, higher density microarrays are not suitable for ampliPHOX detection.
Here, we present ampliPHOX colorimetric detection technology as a method of signal amplification on a low density microarray developed for the detection and characterization of influenza viruses (FluChip). Although this protocol uses the FluChip (a DNA microarray) as one specific application of ampliPHOX detection, any microarray incorporating biotinylated target can be labeled and detected in a similar manner. The microarray design and biotinylation of the target to be captured are the responsibility of the user. Once the biotinylated target has been captured on the array, ampliPHOX detection can be performed by first tagging the array with a streptavidin-label conjugate (ampliTAG). Upon light exposure using the ampliPHOX Reader instrument, polymerization of a monomer solution (ampliPHY) occurs only in regions containing ampliTAG-labeled targets. The polymer formed can be subsequently stained with a non-toxic solution to improve visual contrast, followed by imaging and analysis using a simple software package (ampliVIEW). The entire FluChip assay from un-extracted sample to result can be performed in about 6 hours, and the ampliPHOX detection steps described above can be completed in about 30 min.

ampliPHOX colorimetric detection technology is presented as an inexpensive alternative to fluorescence detection for microarrays. Based on photopolymerization, ampliPHOX produces solid polymer spots visible to the naked eye in just a few minutes. Results are then imaged and automatically interpreted with a simple yet powerful software package.

ampliPHOX איתור Colorimetric על ה-DNA microarray לשפעת

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

ניתוח כמותי של השפעת כל סוג Hemagglutinins ויראלי ו Neuraminidases באמצעות נוגדנים יוניברסל מבחני כתם פשוט חריץ

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

שיתוף immunoprecipitation של חלבון העכבר MX1 עם nucleoprotein וירוס השפעת

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

האף מגבונים לשפעת זיהוי וירוסים ובידוד מחזירים

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

במבחנה פירוק של וירוס שפעת capsids ידי צנטריפוגה שיפוע

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

קרינה המבוססת Assay Neuraminidase העיכוב להעריך את הרגישות של שפעת וירוסים אל Neuraminidase המונע המחלקה של תרופות אנטי-ויראליות

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.