הפרוטוקול שלנו הוא הראשון המאפשר מדידה דינמית של נוזל פני השטח של דרכי הנשימה, או PH ASL, בזמן אמת תחת מנוחה ואחרי טיפול אגוניסט או מעכב. שיטה זו מסייעת לזהות תעלות יון ומשגרים המעורבים בוויסות pH חוץ-תאי ונוכלים להיות מיושמים על מערכות תאים אחרות שבהן זה חשוב, כגון סרטן. עכשיו בהשוואה לשיטות שפורסמו בעבר, טכניקה חדשה זו היא פשוטה יחסית לביצוע.
זה לא דורש ציוד מיוחד. והוא יכול לעשות מדידות pH ASL בו זמנית בתרבויות מרובות תחת ממשק נוזלי אוויר, או תנאי סרט דק. חשוב לציין, טכניקה חדשה זו יש פוטנציאל להעריך את ההשפעות של טיפולים חדשים, לא רק עבור סיסטיק פיברוזיס, אלא גם עבור מחלות דרכים כרוניות אחרות, כגון אסטמה ו COPD.
לאחר לפחות 28 ימים של תרבות, לשטוף את פני השטח apical של תרבות התא האפיתל של דרכי הנשימה האנושית עם 150 microliters של ביקרבונט המכיל פתרון חיץ קרבס במשך 20 דקות על החממה תרבות התא. בסוף הדגירה, השתמש צינור זכוכית סטרילי עם קצה צינור P200 סטרילי מקושר משאבת שאיפה, כדי לשאפת בזהירות את לשטוף מבלי לשבש את האפיתל. צריך להיות מעט נוזל שנותר על פני השטח apical ככל האפשר כדי לשחזר את ממשק נוזלי האוויר.
ואז להחזיר את התאים לאנקובטור תרבות התא במשך 30 דקות. לביצוע מדידת רקע, הפעל את קורא הלוחות ואת המחשב. לאחר פתיחת לוח המחוונים, לחץ על ספארק 10M והגדר את בקרת הטמפרטורה ל- 37 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן פתחו את בקרת הגז והגדירו את הפחמן הדו-חמצני ל-5% כאשר הטמפרטורה והגז הגיעו ליעדם, פתחו את מגירת קורא הלוחות והכניסו לקורא קלטת לחות מלאה בשישה מיליליטר מים מזוקקים. ודא כי המכסה והתחתית של צלחת תרבות התא נקיים והניחו את הצלחת על קלטת הלחות, הניחו את המכסה בחזרה וסגרו את המגירה. פתחו את עורך שיטת הניצוץ, בחרו בתבנית הלוח המתאימה ובחרו את בארות ההטרחה שיש לפיקוח במהלך הניסוי.
הוסיפו לוח בקרה של טמפרטורה ופחמן דו-חמצני והגדירו את הלוחות ל-37 מעלות צלזיוס ו-5% בהתאמה. ואז לתקתק את ההמתנה לטמפרטורה / תיבות גז. הוסיפו חלונית לולאה קינטית ובחרו את משך הזמן כסוג הלולאה.
הגדר את משך הזמן לחמש דקות והגדר את סוג מרווח הזמן של הניסוי ללא מוגדר, כדי לקבל קריאה רציפה. בתוך הלולאה הקינטית, השתמשו בפונקציית הגרירה והשחרור כדי להוסיף שני לוחות עוצמת פלואורסצנטיות שיקבעו בנפרד לצבעים הפלואורסצנטיים הרגישים ל- pH ולצבעים פלואורסצנטיים חסרי רגישות ל- pH. הגדר את אורך הגל של העירור וההפחתה ל- 560 ו- 590 ננומטר בהתאמה עבור הצבע הרגיש ל- pH.
ו-495 ו-520 ננומטר בהתאמה לצבע חסר הרגישות של ה-pH. הגדר את מספר ההבזקים ל-30 ואת מיקום ה-z ל-33, 200 עבור כל פלואורופור. הגדר את הקריאה המרובים לכל באר להגדרת המשתמש, כשלוש על שלוש אחר עיגול עם גבול של 4, 750 מיקרומטר.
לחץ על התחל ליזום את קריאת מדידת הרקע ולחץ על אישור, כדי לאשר כי המכסה של קלטת הלחות הוא במקום. בסוף המדידה, להעביר את הלוחית מקורא הלוח לארון בטיחות של תרבות הרקמה ולהוסיף שלושה microliters של פתרון צבע פלואורסצנטי מוכן טרי מזוגות אל פני השטח apical של התאים. ואז להחזיר את הצלחת לאנקובטור תרבות התא בן לילה.
למדידת הקינטיקה, פתחו את קובץ השיטה המשמש למידות הרקע. לאחר הגדרת כל הפרמטרים, פתח את מגירה קורא הלוחות והכנס את קלטת הלחות. מניחים את הצלחת הנקייה בקלטת הלחות עם הכיסוי שלה ולחץ להתחיל ליזום את קריאות פלואורסצנטיות.
לאחר מכן לחץ על אישור, כדי לאשר כי המכסה של קלטת הלחות הוא במקום. לאחר מינימום של 12 מחזורים, לחץ על השהיה כדי להפריע לניסוי ולהסיר את הצלחת כדי להחיל בזלת כל תרופות או אגוניסטים על הדגימות המתאימות. להחזיר את הצלחת לקלטת הלחות על המגש ולמקם מחדש את מכסה קלטת הלחות, לפני הלחיצה להמשיך, כדי להקליט עוד יותר את ה- pH ASL ולפקח על ההשפעה של הטיפול.
עבור כיול pH situ, להסיר את הצלחת מקורא הלוח ולשאוף את הפתרון basolateral. הוסף 750 מיקרוליטרים של פתרון עקומה סטנדרטית עם אגירה גבוהה לתא הבזלת ומיקרוליטר אחד של פתרון לפני השטח של apical. כבה את הפחמן הדו-חמצני על קורא הלוחות והחזר את הצלחת לקלטת הלחות.
לאחר מכן הגדר את קורא הלוחות עם אותם פרמטרים כפי שהוכח, אך ללא פחמן דו חמצני, ולהתחיל את קריאות הפלואורסצנטיות כל חמש דקות במשך שעה עד שעה וחצי. עבור ניתוח נתונים, בחר את כל הנתונים הממוצעים עבור כל דוגמה, או תנאי עבור שני אורכי הגל בקובץ הרקע והעתק והדבק את הנתונים בקובץ חדש. לאחר מכן לחשב את הרקע הממוצע עבור כל באר וכל אורך גל.
לאחר העתקה והדבקה של הכיול והנתונים הקינטיים באותו אופן, הפחת את הרקע מכל נקודת נתונים עבור כל אורך גל. עבור כל נקודת זמן וכל מדגם, חשב את היחס בין רגישות ל- pH לבין הפלואורסצנטיות חסרת הרגישות של ה- pH. עבור כל נקודת זמן, צור עקומה סטנדרטית מהיחסים והתווה את ערכי ה- pH הידועים על ציר ה- x ואת היחסים בציר ה- y.
קבע את נקודת הזמן שבה היחסים יציבים, התאם לקו רגרסיה ליניארי והשג את המשוואה עבור קו זה. לאחר מכן, חשב את ה- pH עבור כל נקודת זמן והתווה את ה- pH בציר ה- y ואת השעה בציר ה- x. בניסוי ראשוני מייצג זה ללא תאים באותו pH ואותו ריכוז, יחסי הפליטה הרגישים ל- pH וחסרי הרגישות ל- pH היו שונים בהתאם לנפח הצבע.
בנוסף, באותו pH ואותו נפח, ריכוזי צבע שונים סיפקו ערכי יחס שונים, המציין כי שינויים בנפח או ריכוז הצבע משפיעים על הערך המוחלט של ה- pH המחושב מיחס הפליטה. בנוסף, הזמן הנדרש עבור שקיעת טמפרטורה הוא כ 15 עד 20 דקות ללא קשר לנפח צבע או ריכוז. ערכי ה- pH של ASL המתקבלים מעקומה סטנדרטית גלובלית אחת מדגימים הבדל משמעותי בין תרבויות שאינן סיסטיק פיברוזיס וסיסטיק פיברוזיס.
בעוד, ה- PH של ASL אינו שונה באופן משמעותי בין סיסטיק פיברוזיס לבין תאי אפיתל אנושיים שאינם סיסטיק פיברוזיס כאשר ה- pH מחושב מעקומות סטנדרטיות עצמאיות. לכן, חשוב ליצור עקומות כיול עצמאיות עבור כל ניסוי ובתוך כל ניסוי, עבור כל מדגם תורם, כמו כאשר עקומות הכיול ממוצעות יחד, ערכי יחס pH רגישים יותר, pH-רגישות נמצאים בתרבויות סיסטיק פיברוזיס המציין pH חומצי יותר. כצפוי, התוספת של forskolin basolateral מגדילה באופן משמעותי את ה- pH של ASL בתרבויות שאינן סיסטיק פיברוזיס בלבד.
כמו תאים אלה נשמרו במצב סטרילי, הם יכולים להיות שטף, האכיל מחדש והשתמשו כמה ימים מאוחר יותר לניסויים עתידיים. כל הדגימות האנושיות הביולוגיות צריכות להיחשב כמסוכנות. אז הקפד להשתמש ברמה המתאימה של כליאה וציוד מגן אישי בהתאם לדגימות שלך.
חשוב לבצע את מדידות הרקע וכיול ה-pH עבור כל קבוצת דגימות על מנת להפחית את השונות בין תורמים ולשפר את הדיוק.
