המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים את התפתחותם של נוירוספרות מתאי עצב מעורבים בהיפוקמפוס ראשי וקליפת המוח המבודדים מעובר עכברוש E14-E16 Sprague Dawley, על מנת להציע פלטפורמה חזקה וזולה לחקר ההשפעה של מוביל נוירותרפיסטיים שונים. כפי שאתה יודע, המוח הזה הוא רשת מורכבת של נוירונים הקשורים למספר גדול של תאים תומכים. כדי להבין את תפקוד המוח, לעתים קרובות רוב המחקר הוא מחדש יזם מניסויים במבחנה, אשר כרוך מסחרי זמין שושלת עצבית נגזר קווי תאים.
עם זאת, קווי תא זה הם קווי תאים משתנים הסובלים וריאציות גנוטיפיות פנוטיפיות. כדי לטפל בבעיות אלה, תרבות הנוירונים העיקרית היא הגישה המתאימה. כאן, המחישנו פרוטוקול פשוט וחסכוני לתרבות נוירונים ראשוניים ובנינו פלטפורמת סינון חזקה לטיפולים עצביים שונים.
היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שרק על ידי אפנון צפיפות ציפוי התא, אנו יכולים להציג שתי פלטפורמות תרבות נוירונים מנוגדות שבהן צפיפות נמוכה מובילה לתרבות נוירונים ראשונית ממושכת, וצפיפות גבוהה מייצרת נוירוספרות ספונטניות. קח שתי צלחות 24 בארות. אחד לצפיפות גבוהה, ועוד עבור ציפוי בצפיפות נמוכה.
מעבירים 12 מ"מ של כיסויי זכוכית סטרילית בצלחות 24 בארות. יוצקים 300 microliters של פתרון PDL בכל אחת מה בארות באופן שהוא מכסה באופן מלא את פני השטח של כיסוי כולו. הכן פתרון PDL בריכוז של 0.1 מ"ג /מ"ל במים deionized.
עוטפים את הצלחות בנייר אלומיניום למניעת ייבוש, ולשמור אותו באינקובטור CO2 למשך הלילה. למחרת, לפני הציפוי, שאפו את פתרון ה-PDL. לשטוף כראוי עם מים סטריליים במשך פעמיים עד שלוש פעמים.
לאחר מכן מוסיפים ציפוי מדיה, ומחזירים את הצלחות לאנקובטור עד ציפוי. להקריב E14-E16 מתוזמן בהריון Sprague-Dawley עכברוש, לעשות חתך בצורת V באזור הבטן באמצעות מטחנים סטריליים וזוג מספריים קהה סוף. הסר את כל העוברים בזהירות למקם אותם על צלחת פטרי עם פתרון HBSS קר.
מוציאים את העוברים מהסקים העובריים ושוטפים אותם בזהירות בצלחת פטרי נפרדת ב- HBSS טרי וקר. לערוף את הראש בעזרת מספריים סטריליים. מעבירים את הראשים בצלחות פטרי סטריליות 90 מ"מ עם HBSS קר.
מתחת למיקרוסקופ הסטריאו, החזק את הראש מאזור האף עם המדפים הסטריליים משונן, והסר את המוח על ידי חיתוך העור והגולגולת פתוחים. הסר את כל קרום המוח מההמיספרות ואת עמוד האמצע על ידי החזקת גזע המוח. בזהירות להסיר את ההמיספרות שלמות, דומה כובעי פטריות המכיל את ההיפוקמפוס ואת קליפת המוח.
לאסוף את ההמיספרות המכילות קליפת המוח והיפוקמפוס שלם בצינור חרוט 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של מדיה דיסוציאציה. אפשר לרקמות שנאספו להתיישב, ושוכך את מדיום הדיסוציאציה, והשאיר בו חמישה עד עשרה אחוזים מהמדיום. שוב, להוסיף 10 מ"ל של מדיום דיסוציאציה טרי אליו, ולחזור על שלב זה פעמיים.
הוסף 4.5 מ"ל של דיסוציאציה בינונית ו- 0.5 מ"ל של פתרון טריפסין-EDTA. שמור אותו באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות לעיכול להמשיך. שאפו את המדיום ושטפו עם 10 מ"ל של דיסוציאציה בינונית וציפוי בינוני, ברציפות.
תן להם 2.5 מ"ל של ציפוי בינוני. שומרים צלחת סטרילית 90 מ"מ מעל הכיסוי ההפוך של המנה ויוצקים אותה בבסיס של צלחת סטרילית 90 מ"מ. titrate את הרקמות מתעכל בבסיס הפינתי של המנה, באמצעות 1000 טיפ פיפטה microliter, כדי לתפוס את הנפח לפחות.
להעביר את ההשעיה התא המתקבלת דרך מסננת תא 70 מיקרומטר, למעט כל גושים של רקמה. קבע את הצפיפות של תאים בני קיימא באמצעות אי-הכללת צבע כחול trypan, וספיר את מספר התאים ב מונה תאים אוטומטי. לדלל את מספר התאים המתקבלים באופן כדי צלחת 1.5 לתוך 10 לעוצמה של 5 תאים לכל מ"ל עבור ציפוי בצפיפות גבוהה, ו 20, 000 תאים לכל mL עבור ציפוי בצפיפות נמוכה בשני צינורות נפרדים המכילים 30 מ"ל של ציפוי בינוני.
שאפו את הציפוי שנוסף בעבר בינוני וצלחת 500 מיקרוליטרים של תאים מפוזרים במדיום ציפוי בכל באר. לאחר מכן, להחזיר את הצלחות לאנקובטור במשך ארבע שעות. ארבע שעות לאחר ציפוי, לבדוק את התאים לדבקות מתחת למיקרוסקופ.
לאחר ארבע שעות של ציפוי, הן בצלחות בצפיפות גבוהה והן בצפיפות נמוכה, הנוירונים מראים דבקות טובה בצלחות. החלף את המדיום בכל באר ב-500 מיקרוליטרים של מדיום תחזוקה טרי, והמדגר אותו באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס. אנחנו צריכים לתרבת את הנוירונים האלה מצופים בצפיפות גבוהה ונמוכה.
בעוד הנוירונים מצופים בצפיפות נמוכה יכולים לשמש לתרבויות ממושכות, עד 30 יום, על ידי שינוי מדיום התחזוקה פעמיים בשבוע, הנוירונים מצופים בצפיפות גבוהה מתחילים ליצור באופן ספונטני נוירוספרות, אשר הגיע יום לאחר ששמרנו על לוחית התקשרות אולטרה נמוכה. לאחר 24 שעות של ציפוי, הן נוירונים מצופים בצפיפות גבוהה ונמוכה נצפו כדי להציג מורפולוגיה בריאה. תמונת ניגודיות פאזה של נוירונים מצופים בצפיפות נמוכה, מתורבתים במשך כשבעה ימים, מוצגת כאן.
הנוירונים מציגים מורפולוגיה בריאה, ו ניתן לשמור אותם עד 30 יום עם ניתוב וחיבורים נמרצים יותר. תרשים הבר כאן מראה סביב 90 אחוז הכדאיות של נוירונים מצופים בצפיפות נמוכה גם לאחר 30 ימים של תרבות, כפי שנקבע על ידי המשגיח MTT. הנוירונים העיקריים כאן התאפיינו בכשל חיסוני עם Tuj 1, סמן של נוירונים מובחנים, וטאו, סמן של אקסונים עצביים.
הטוהר של הנוירונים מאושר על ידי היעדר כתמים סמנים שאינם עצביים GFAP עבור אסטרוציטים ו O4 עבור oligodendrocytes. בכל מחקרי האפיון, הגרעינים הוכתמים בהויכסט 33258. כאן, תאים זרעים בצפיפות נמוכה כבר מוכתמים עם סמן אסטרוציטי GFAP ו סמן עצבי Tuj 1 כדי לבדוק את טוהר התרבות עד שבעה ימים.
הוא ציין כי פרוטוקול זה תומך בצמיחה המועדפת של נוירונים על פני אסטרוציטים כפי שצוין באמצעות ניתוח כמותי. הגרעינים הוכתמים בהויכסט 33258. באופן דומה, בתאי הזרעים בצפיפות גבוהה, האסטרוציטים כבר מוכתמים GFAP ותאי עצב על ידי Tuj 1.
כאן, בניתוח כמותי, סביב 17 אחוז אסטרוציטים נצפו לעומת 83 אחוז נוירונים. הגרעינים הוכתמים בהויכסט 33258. לאחר שבעה ימים, נוצר באופן ספונטני נוירוספרות מרובות נוירונים בצפיפות גבוהה נצפו.
בסביבות היום השמיני עד העשירי של התרבות, בנוירונים מצופים בצפיפות גבוהה, הנוירוספרות מתחילות ליצור תחזיות וגשרים גדולים המורכבים מהרחבות רדיאליות דמויי גליה. החצים השחורים מצביעים על הגשר בין שני נוירוספרות שזה עתה נוצרו. בדיקה של תאים חיים ומתים בוצעה על הנוירוספרות במשך 15 יום.
בכתמי Calcein AM צפופים, ללא כתמי יודיד פרופידיום לחלוטין, מציין כמעט 100 אחוז כדאיות של הנוירוספרות בתרבות. גרף הקו כאן מצביע על התרחבות בגודל של הנוירוספרות עם המעבר של מספר הימים. תמונה מוכתמת יתר על מדי של נוירוספרה מצביעה על אוכלוסייה עשירה של תאי גוף עצביים באמצעות ביטוי מוגבר של סמני NPC נסטין ו Tuj 1.
הנוירוספרות כאן מראות כמויות גבוהות של אסטרוציטים המסומנים על ידי הביטוי החזק של GFAP, מלווה בביטוי גבוה עוד יותר של סמן עצבי Tuj 1. הגרעינים הוכתמים בהויכסט 33258. אז אני חושב שהפרוטוקול שלנו הוא די מרגש ומעניין, בהתחשב בעובדה כי מתוך אסטרטגיה אחת אנו מסוגלים לקבל שתי פלטפורמות: אחד 2-D ואחד 3-D.
וזו תהיה פלטפורמה נהדרת להקרנת מסלולים נוירותרפיים שונים. אז אני מניחה שזה ממש מועיל לכל חוקרי המוח. היבט חשוב נוסף הוא שהנוירוספרות שאנו בוחרים בה עשירות מאוד בתאי ניוון עצביים, ה- NPCs.
והם יכולים לשמש כדי להבדיל אותם לתוך נוירונים ושושלת לא עצבית. אז, אני מרגיש שאם, באמת, אנשים יכולים לשלוט בטכניקה זו על ידי לקיחת עזרה מהסרטון הזה, זה יהיה באמת באמת שימושי לכולם. תודה.
