השיטות המוצגות כאן מאפשרות כימות נגעי DNA הנגרמים על ידי סטרס חמצוני, ותורמים להבנת מנגנונים פתופיזיולוגיים שעשויים להיות יעד למניעה וטיפול במחלות. סלקטיביות ורגישות הם היתרונות העיקריים. סלקטיביות היא יתרון חיוני בעת עבודה עם דגימות ביולוגיות מורכבות.
HPLC יחד עם ספקטרומטריית מסה דו-מושבית התפתחו כתקן הזהב לסוג זה של כימות עם מטריסות ביולוגיות. סטרס חמצוני הוא אירוע נפוץ לתהליכים פתופיזיולוגיים שונים. רמות גבוהות של אדיאדוקט אתנו זוהו ברקמות או בשתן של חולים עם מחלות דלקתיות.
נגעי הדנ"א מספקים גם מידע על אירועים אנדוגניים המופעלים על ידי חשיפה למזהמים. אם נגעי ה- DNA גדלים, החשיפה עשויה להיות ברמה המגדילה את הסיכון להתפתחות סרטן, למשל. הנגעים ניתן לכמת ב- DNA מכל מערכת הסלולר ולחילופין בשתן, פלזמה, מדיום תרבות רוק עם התאמות בהכנת מדגם.
כדי להתחיל, להשתמש צלחת תרבות להציב על הקרח כבסיס לחתוך חתיכת רקמה עם אזמל. לשקול גרם אחד של הרקמה בכל צינור כתרים 50 מיליליטר לשימוש מיידי. שמור את הרקמה הנותרת על קרח יבש לפני אחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס.
לכל צינור, להוסיף 10 מיליליטר של פתרון תריס התא המסחרי המכיל 0.5 מילימולר deferoxamine, ולשמור על קרח. הגדר את הומוגניזר הרקמה למהירות נמוכה, סביב 60 עד 90 סל"ד. הומוגניזציה של הרקמות על הקרח במשך כמה דקות עד הפתרון הוא ללא שברי רקמות.
לאחר מכן, להוסיף 150 microliters של פתרון proteinase K לכל מדגם הומוגני. לנער את הצינורות על ידי היפוך, ולשמור אותם בטמפרטורת החדר לילה. בבוקר, להוסיף 40 microliters של ריבונוקלאז פתרון, לנער על ידי היפוך, ולשמור את הצינורות בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.
הוסיפו חמישה מיליליטר של תוסף משקעים מסחריים לחלבון, מערבולת במרץ וצנטריפוגה במהירות של 2,000 פעמים גרם, ארבע מעלות צלזיוס, למשך 10 דקות. מעבירים את העל-טבעיים לצינורות מכוסים 50 מיליליטר המכילים 10 מיליליטר של isopropanol קר. היפוך הצינורות בעדינות מספר פעמים עד להתבוננות בדנ"א מזרז.
השתמש פיפטה פסטר סגור בסוף כדי לאסוף את ה-DNA זירז. העבר את הדנ"א שנאסף לצינורות המכילים ארבעה מיליליטר של חיץ טריס 10 מילימולאר ודפרוקסאמין מילימולר אחד ב- pH שבע כדי להתמוסס. לאחר הדנ"א מומס לחלוטין בצינורות, להוסיף ארבעה מיליליטר של פתרון כלורופורם המכיל 4% אלכוהול isoamyl לכל צינור.
להפוך את הצינורות 10 פעמים עבור הומוגניזציה, צנטריפוגה ב 2, 000 פעמים g, ארבע מעלות צלזיוס, במשך 10 דקות, ולהעביר את השלבים העליונים צינורות חדשים. חזור על שטיפה של השלב העליון עם פתרון כלורופורם פעמיים נוספות. לאחר מכן, להוסיף שמונה מיליליטר של אתנול מוחלט ו 0.4 מיליליטר של פתרון נתרן כלורי חמש טוחן כדי לזרז את ה-DNA.
שוב, לאסוף את ה-DNA זירז, ולהעביר אותו לשלושה מיליליטר של 70% אתנול. חזור על הכביסה עם 70% אתנול עוד פעם אחת. להשליך את פתרון האתנול בזהירות, ולהפוך את הצינורות המכילים את ה-DNA זירז על נייר סופג כדי להסיר פתרון עודף.
לאחר הכנת דגימות הידרוליזה DNA עם תקן isotopic 15N5 של 1, N6-אתנו-deoxyadenosine ו 15N5 תקן isotopic של 1, N2-אתנו-deoxyguanosine על פי כתב היד, להעביר 10 microliters של כל דגימה לתוך צינורות לכימות של deoxynucleosides נורמלי על ידי HPLC-UV. נושא נפח שיורית מיצוי בשלב מוצק. כדי לבצע HPLC, יש לסולק תחילה עמודת C18 המחוברת למחסנית C18 SecurityGuard עם שיפוע של 0.1% עבור חומצה מתנול.
הגדר את התוכנית שיפוע לרוץ מאפס ל 25 דקות עם אפס עד 18% מתנול, מ 25 עד 27 דקות עם 18 עד 0% מתנול, אז מ 27 עד 37 דקות עם 0% מתנול בקצב זרימה של מיליליטר אחד לדקה ו 30 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להזריק נפח בין שניים לשישה microliters עבור כל מדגם שמורות לכמית deoxynucleosides נורמלי. הגדר את גלאי אבא ב 260 ננומטר לשילוב של פסגות deoxyguanosine ו deoxyadenosine.
כדי לבצע מיצוי בשלב מוצק עבור ניתוחים של 1, N6-אתנו-deoxyadenosine ו 1, N2-אתנו-deoxyguanosine, תחילה לטעון את המחסניות עם סדרה של פתרונות בנפח של מיליליטר אחד. הוסיפו 100% מתנול, מים שעברו דה-מיונז, דגימת דנ"א שעבר הידרוליז, מים שעברו דה-מיונז, 10% מתנול, 15% מתנול, ולאחרונה 100% מתנול לאיסוף. לאחר מכן, המשך בהתאם לכתב היד.
לאחר הכנת דגימות הידרוליזה DNA 15N5 תקן isotopic של 8-oxo-deoxyguanosine, להעביר 80 microliters של כל מדגם לתוך בקבוקונים לניתוח במערכת HPLC-ESI-MS/MS. שמור את 20 המיקרוליטרים הנותרים לכימות של deoxyguanosine ב- HPLC-UV, כפי שנעשה בעבר. לניתוח של 8-oxo-deoxyguanosine על HPLC-ESI-MS/MS, ללטף את עמודת C18 A יחד עם מחסנית C18 SecurityGuard עם שיפוע של ממס A ו- B בקצב זרימה של 150 microliters לדקה ו 25 מעלות צלזיוס.
הפעל את המשאבה הבינארית עם אפס עד 15% של ממס B במהלך 25 הדקות הראשונות, 15 עד 80% של ממס B מ 25 עד 28 דקות, 80% של ממס B מ 28 עד 31 דקות, 80 עד 0% של ממס B מ 31 עד 33 דקות, ו 0% של ממס B מ 33 עד 46 דקות. כוון את 16 הדקות הראשונות של עמוד A אלבנט לבזבוז. טור מצב B על ידי משאבה isocratic עם פתרון של 15% מתנול במים המכילים 0.1% חומצה פורמית בקצב זרימה של 150 microliters לדקה.
לאחר שש דקות, לבדוק את הכרומטוגרמה כדי להבטיח את 8-oxo-deoxyguanosine תקן elutes מעמודה A.במהלך מרווח 16-32 דקות, לעבור את השסתום למצב המאפשר חיבור בין עמודה A ועמודה B.סגור את השסתום ב 32 דקות כדי לחמק 8-oxo-deoxyguanosine מהעמודה השנייה ולקבל שיא כרומטוגרפי חד. לניתוח של 1, N6-אתנו-deoxyadenosine ו 1, N2-אתנו-deoxyguanosine, elute עמוד C18 יחד עם מחסנית C18 SecurityGuard עם שיפוע של ממס A ו- B בקצב זרימה של 130 microliters לדקה ו 25 מעלות צלזיוס. הפעל את המשאבה הבינארית עם 0% ממס B במשך 10 הדקות הראשונות, אפס עד 20% מהממס B למשך 10 עד 39 דקות, 20 עד 75% מהממס B מ-39 עד 41 דקות, 75% מהממס ב' מ-41 עד 46 דקות, 75 עד 0% מהממס ב' מ-46 עד 47 דקות ו-0% ממס ב' מ-47 עד 60 דקות.
השתמש שסתום מיתוג כדי לכוון את 35 הדקות הראשונות של eluent לפסולת ואת שבר 35 עד 42 דקות למקור ESI. ודא שתקני המודעות חמקו מהעמודה במרווח הזמן שנקבע. לשלב את הפסגות של 8-oxo-deoxyguanosine 15N5 תקן isotopic של 8-oxo-deoxyguanosine, 1, N6-אתנו-deoxyadenosine, 15N5 תקן isotopic של 1, N6-אתנו-deoxyadenosine, 1, N2-אתנו-deoxyguanosine, ו 15N5 תקן isotopic של 1, N2-אתנו-deoxyguanosine מ HPLC-ESI-MS/ MSS
חשב את יחסי השטח עבור עקומות הכיול והדגימות. להקים את עקומות הכיול, ולחשב את כמויות הנגעים בכל מדגם מוזרק. שלב את הפסגות של deoxyguanosine ו deoxyadenosine מניתוח HPLC-UV.
השתמש באזורים כדי להקים את עקומות הכיול, ולחשב את כמויות deoxyguanosine ו deoxyadenosine בבעלי חיים בכל מדגם מוזרק. לחשב את שברי טוחנות עבור 8-oxo-deoxyguanosine מעל deoxyguanosine, 1, N6-אתנו-deoxyadenosine מעל deoxyadenosine, ו 1, N2-אתנו-deoxyguanosine מעל deoxyguanosine, אשר נותנים את מספר נגעים לכל מיליון deoxyguanosine נורמלי או deyaoxdenosine. כרומטוגרמה מייצגת של הדנ"א המטוהר המתקבל על ידי HPLC-UV מראה את נוכחותם של ארבעת deoxynucleosides נורמלי, ללא ריבונוקלוזידים RNA, המדגים את טוהר ה- DNA.
כרומטוגרמות מייצגות מ- HPLC-ESI-MS/MS של 8-oxo-deoxyguanosine, 1, N6-אתנו-deoxyadenosine, ו 1, N2-אתנו-deoxyguanosine בדגימות DNA רקמת עכברים מוצגים. הכרומטוגרמה המתקבלת עם זיהוי UV מראה את ארבעת deoxynucleosides נורמלי eluting מהטור הראשון עד כ 10 דקות, עם הפרדה טובה מ 8-oxo-deoxyguanosine, ביטול הפרעות לא רצויות. דבר חשוב לזכור עבור כימות מדויק הוא תמיד את אותן כמויות של סטנדרטים פנימיים בנפח ההזרקה עקומות כיול ודגימות.
השיטות המוצגות כאן עשויות להיות מותאמות לכמות של deoxynucleosides שונה אחרים. הרחבת הרצועה של deoxynucleosides שונה מאפשר הבנה טובה יותר של המנגנונים הפתופיזיולוגיים הבסיסיים. אנו יכולים לחקור את תפקידו של נזק חמצוני במצבים שונים כגון חשיפה לשנאת קסנוביוטיקה, סוכרת וטרנספורמציה ממאירית של התא, ולכן לסייע בפיתוח אסטרטגיות מניעה וטיפול.
