התווינו הליך לגילוי וכימות של חומצה איופונוקסית בסרום נמייה. התוצאות מראות כי חומצה iophenoxic עשוי לשמש סמן ביולוגי כדי לאמת ספיגת בטא במין. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת כימות של אנלוגים חומצה iophenoxic בחלקים לכל מיליארד רמות, באמצעות פשוט לבצע טכניקת משקעים חלבון.
עבור שלב A נייד, לשלב מיליליטר אחד של חומצה פורמית עם ליטר אחד של מים טהורים במיוחד. עבור שלב B נייד, לשלב מיליליטר אחד של חומצה פורמית עם ליטר אחד של אצטוניטריל. עבור diluent, לשלב מיליליטר אחד של חומצה trifluoroacetic עם 200 מיליליטר של אצטוניטריל.
לאחר מכן, לשקול כ 10 מיליגרם של מתיל-IPA על מיקרו איזון, ולהקליט את המסה פלוס או מינוס 0001 מיליגרם. מעבירים באופן כמותי את המתיל-IPA לבקבוק נפח מסוג A בנפח 10 מיליליטר, תוך שימוש בארבעה עד חמישה מיליליטר של אצטוניטריל. Sonicate במשך דקה אחת כדי להמיס את כל המוצקים ולאחר מכן להביא נפח עם אצטוניטריל.
מעבירים כשמונה מיליליטר של כל מלאי לשמונה בקבוקוני זכוכית ענבר מיליליטר עם כובעים מצופים PTFE ולאחסן את הדגימות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להעביר את המלאי הנותר לפסולת מסוכנת. עבור מניית 25X שבע מניות מתיל-IPA להכין מלאי של מתיל-IPA ואצטוניטריל בכ 200 מיקרוגרם למיליליטר.
מעבירים מיליליטר אחד של המניה לבקבוק חמישה מיליליטר ומדללים לנפח עם אצטוניטריל. לאחר מכן, להעביר את המלאי לבקבוקון זכוכית ענבר שמונה מיליליטר עם כובע מצופה PTFE ולאחסן בטמפרטורת החדר. באמצעות pipettor חוזר, להכין את שש מניות מתיל-IPA 25X נוספות המתוארות בפרוטוקול הטקסט בשמונה בקבוקוני זכוכית ענבר מיליליטר עם כובעים מצופים PTFE ולאחסן בטמפרטורת החדר.
עבור מלאי פונדקאית 25X, להעביר 0.1 מיליליטר של מלאי אתיל-IPA מרוכז לבקבוק נפח מחלקה 10 מיליליטר באמצעות מזרק זכוכית 100 microliter ולאחר מכן לדלל לנפח עם אצטוניטריל. מעבירים כשמונה מיליליטר של המלאי הפונדקאי לבקבוקון זכוכית ענבר 8 מיליליטר עם כובע מצופה PTFE ומאחסנים בטמפרטורת החדר. העבר את המלאי הנותר לפסולת מסוכנת.
לאחר מכן, הכינו מניות 4X המכילות גם מתיל-IPA וגם אתיל-IPA בבקבוקוני סמפלר אוטומטיים מזכוכית 10 מיליליטר, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לדוגמה, כדי להכין מלאי 4X7, הוסף 0.2 מיליליטר של מלאי 25X שבע מניות מתיל-IPA לבקבוקון שני מיליליטר באמצעות pipettor חוזר עם קצה קיבולת 0.5 מיליליטר. הוסף 0.2 מיליליטר של מלאי אתיל-IPA פונדקאי 25X באמצעות pipettor חוזר עם קצה קיבולת 0.5 מיליליטר.
הוסף 0.85 מיליליטר של אצטוניטריל באמצעות צינור חוזר עם קצה קיבולת מיליליטר אחד. מכסים את הבקבוקון בצורה מאובטחת והפוך חמש פעמים כדי לערבב. לאחר מכן, הכן את העקומה הסטנדרטית בשני בקבוקונים אוטומטיים מיליליטר של סמפלר אוטומטי כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
לדוגמה, כדי להכין שבעה סטנדרטיים, הוסף 0.2 מיליליטר של מלאי 4X7 לבקבוקון שני מיליליטר, באמצעות צינור חוזר עם קצה קיבולת של 0.5 מיליליטר. הוסף 0.6 מיליליטר של מים מיוננים טוהר אולטרה באמצעות pipettor חוזר עם קצה קיבולת מיליליטר אחד. מכסים את הבקבוקונים בצורה מאובטחת והפוך חמש פעמים כדי לערבב.
עבור כל מדגם, להכין צינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר המכיל 200 עד 300 מיליגרם של נתרן כלורי ולסדר את הצינורות במתלה פלסטיק 80 עמדה. עבור כל מדגם, סמן צינור מיקרו צנטריפוגה מיקרו אחד 1.5 מיליליטר כמו A וצינור מיקרו צנטריפוגה שני כמו B.Arrange הצינורות במתלה פלסטיק 80 עמדה. מניחים את החומרים והציוד הבאים הדרושים להפקת סרום בארונות ביה-בטיחות מדרגה 2: צינורות המיקרו צנטריפוגה, מערבל מערבולת, צינור חוזר עם 0.5 מיליליטר וחמישה טיפים קיבולת מיליליטר, 100 עד 1000 פיפטה תזוזת אוויר microliter עם 1000 טיפים microliter, מיכלים עם כ 100 מיליליטר כל אחד מים מיוננים diluent ו טוהר אולטרה, מיכל פסולת biohazard.
לאחר מכן, הסר דגימות סרום מאחסון קפוא וחם לטמפרטורת החדר בארון biosafety. מערבולת מערבבת כל דגימת סרום לפני הדגימה. באמצעות pipettor חוזר עם קצה קיבולת 0.5 מיליליטר, לחלק 05 מיליליטר של סרום נמייה לתוך צינור A ולהוסיף 05 מיליליטר של מלאי פונדקאית 25X.
לאחר מכן להוסיף 0.95 מיליליטר של diluent לצינור A באמצעות pipettor חוזר עם קצה קיבולת חמישה מיליליטר. מכסים את הצינורות בצורה מאובטחת ומערבולת מערבבים במשך 10 עד 15 שניות. לאחר מכן, הוסף את סרום נמיית הבקרה לצינור A.Fortify כל אחת מדגימות 4QC עם me-IPA באמצעות pipettor חוזר עם קצה קיבולת 0.5 מיליליטר.
הוסף מלאי פונדקאי 25X לדגימות QC. לאחר מכן, הוסף את הדילואנט לדגימות QC. מכסים את הצינורות ואת תערובת המערבולת.
מחלקים את הנתרן כלורי ששוקל מראש לצינור A ומערבולת מערבבים שלוש פעמים במשך שמונה עד 12 שניות. לאחר מכן, נגב את המשטחים החיצוניים של ארון התקשורת הבקבוקי המכיל צינור A באמצעות 70% isopropanol. לאחר הסרת הדגימות מן הארון biosafety, צינור צנטריפוגה A ב 1200 פעמים G במשך דקה אחת כדי להפריד את שלבי aqueous ו acetonitrile.
פיפטה 0.8 מיליליטר של שלב האצטוניטריל העליון לצינור B, באמצעות פיפטה תזוזת אוויר 100 עד 1000 מיקרוליטר. מעבירים את הפתרון הנותר בצינור A לפסולת מסוכנת ומשליכים את הצינור הריק במיכל פסולת ביולוגית. עכשיו, להסיר אצטוניטריל ו trifluoroacetic מצינור B עם זרימה עדינה של גז חנקן באמבט מים 45 מעלות צלזיוס.
מוסיפים 0.25 מיליליטר של אצטוניטריל לצינור B באמצעות צינור חוזר ומערבולת לערבב במשך ארבע עד חמש שניות. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 1200 פעמים G במשך שתיים עד ארבע שניות כדי לאסוף את הנוזל בתחתית הצינור. לאחר הצנטריפוגה, להוסיף 0.75 מיליליטר של מים deionized טהור במיוחד צינור B באמצעות pipettor חוזר עם קצה קיבולת חמישה מיליליטר תערובת מערבולת במשך ארבע עד חמש שניות.
צנטריפוגה ב 1200 פעמים G לדקה אחת כדי להבהיר את המדגם. לאחר מכן, להעביר 0.75 מיליליטר של supernatant לבקבוקון סמפלר אוטומטי באמצעות פיפטה תזוזת אוויר 1000 מיקרוליטר ולהשליך את טיפים פיפטה במיכל פסולת biohazard. תכסה כל בקבוקון סמפלר אוטומטי בצורה מאובטחת לניתוח LC-MS/MS.
מעבירים את הפתרון הנותר בצינור B לפסולת מסוכנת ומשליכים את הצינור הריק במיכל פסולת ביולוגית. קבע את תצורת ה- LC-MS/MS עם כל הפרמטרים המתוארים בפרוטוקול הטקסט. לחץ על LC-MS/MS ואפשר לעמודה להגיע ל- 70 מעלות צלזיוס לפני הגדרת קצב הזרימה ל- 0.8 מיליליטר לדקה.
הגדר רצף בתוכנת רכישת הנתונים כדי להזריק את העקומה הסטנדרטית לפני ואחרי כל אצווה המורכבת מדגימות בקרת איכות ודגימות לא ידועות. הזרק את כל התקנים והדגימות והרכוש כרומטוגרמות MR ion באמצעות פרמטרים המפורטים בפרוטוקול הטקסט. לאחר השלמת הרצף, כבה את ה- LC-MS/MS והשליך את כל בקבוקוני הדגימה האוטומטית בפסולת מסוכנת.
כרומטוגרמת היונים של סרום נמיית הבקרה ממחישה את זמן השמירה של אתיל-IPA ואת היעדר מתיל-IPA בזמן השמירה המצוין. כרומטוגרמת היונים של דגימת בקרת האיכות ממחישה את ההפרדה הבסיסית של מתיל-IPA מהאתיל-IPA, כמו גם את מעברי הכימות והמזהה עבור מתיל-IPA. כרומטוגרמת היונים של המדגם הייצוגי מהמחקר מראה ריכוז סרום שנצפה של 33.5 מיקרוגרם למיקרוליטר של מתיל-IPA.
תוצאות הדיוק והדיוק של סרום נמיית בקרה המבוצר במתיל-IPA מוצגות כאן. אחוזי ההחלמה נעו בין 96.9% ל-109% החריגה היחסית בשלוש רמות הביצורים הייתה 3.4%-1.7% ו-2.3% בהתאמה. תוצאות הדיוק והדיוק עבור סרום נמייה שליטה מבוצר עם אתיל-IPA מוצגים כאן.
אחוזי ההחלמה נעו בין 89.5% ל-115% סטיית התקן היחסית בחמש רמות הביצורים הייתה 4.3%1.5%2.3%-5.6% ו-1.1% בהתאמה. כל הנמיות הציעו אתיל-IPA ופיתיונות מתיל-IPA צרכו לפחות 25% מהפיתיון בתוך אילוץ הזמן של 24 שעות, והיתה להם רמות ניתנות לכימות של אתיל-IPA ומתיל-IPA בסרה שלהם, בהתאמה. השירות הפוטנציאלי של השיטה יכול להיות מוגברת על ידי קביעת התצורה של LC-MS כדי לאסוף נתונים עבור אנלוגים אחרים חומצה iophenoxic, כגון פרופיל וחומצה iophenoxic butyl.
עודדנו את העובדים להתייעץ עם ההמלצות האחרונות של הוועדה המייעצת על נוהלי חיסון, או ועדת האבטחה הביולוגית המוסדית שלהם להנחיה האם יש צורך בחיסון נגד כלבת. סעיפים 2.3 עד 2.6 של פרוטוקול זה מעורבים עבודה עם סרום לא מזוהה צריך להתבצע בקבינט biosafety בכיתה 2.
