שיטה זו מספקת חלופה יעילה לגישה האנלוגית הקונבנציונלית בהשגת יתר של חומצות אמינו. טכניקה זו עולה על השיטה המסורתית המבוססת על אנלוגיה על-ידי מתן דיוק, רגישות ותפוקה גבוהה בו-זמנית. שיטה זו שופכת אור חדש על הבנת חוזקות ייצור יתר של חומצות אמינו ותרגום של קודונים נדירים, תיאורטית, יכול להיות מיושם על כל מיקרואורגניזמים.
פרוטוקול זה מסתמך בעיקר על פעולות ניסיוניות מולקולריות בסיסיות שקל לעקוב אחריהן, אך עשויות לדרוש ניסויים מרובים על מנת להשיג את הבחירה המתאימה של מחרוזות מאמץ. הדגמה חזותית של טכניקה זו מציעה הערכה ישירה על הביצועים של הבחירה מערכת הקרנה בזיהוי יצרני חומצות אמינו. כדי להתחיל בהליך זה, מוסיפים את הווקטור שברי הסמן, על הקרח, ביחס טוחנת של אחד עד שבע נקודות חמישה מיקרוליטרים של תערובת הרכבה לנפח כולל של עשרה מיקרוליטרים.
דגירה ב 50 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. הפוך חמישה מיקרוליטרים של מוצר ההרכבה ל-50 מיקרוליטרים של תאי רכיבים ב-42 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. לשחזר את התאים במרק סופר אופטימלי עם מדיום דיכוי קטבוליט ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.
לאחר מכן, צלחת אותם על LB אגר בינוני דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת, השתמש בערכה מסחרית מועדפת כדי לבודד את הפלסמיד. ראשית, להפוך 50 microliters של התאים המוסמכים עם מיקרוליטר אחד של פלסמיד שנושא את קאנר מסוג פראי.
להפוך קבוצה שנייה של תאים מוכשרים עם פלסמיד המכיל KanR RC 29 עם כל קודונים לאוצין הוחלף על ידי CTA קודון נדיר. לוח ודגירה של תרבות התא כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, להעביר את המושבות כי מחסה גן סמן הבחירה מסוג פראי הנגזרת נדירה-קודון עשיר בנפרד לתוך חמישה מיליליטר של חמש פעמים מדולל LB בינוני המכיל kanamycin בריכוז של 50 מיקרוגרם למיליליטר.
הדגירה את הדגימות בשייקר ב 37 מעלות צלזיוס תוך רועד ב 250 סל"ד. לאחר מכן, להעביר 200 microliters של כל אחת מתרבות התא לתוך צלחת 96 גם ב triplicate בנקודות זמן מוגדרות. השתמש בקורא לוחות כדי למדוד את OD600.
לחסן את הכתמים מחסה הגן סמן KanR RC 29 בשתי קבוצות של חמישה מיליליטר של 0.2 x LB בינוני המכיל kanamycin, עם או בלי אספקה של L-לאוצין. הוסף L-לאוצין לאחד המדיה לריכוז סופי של גרם אחד לליטר. הדגירה את הדגימות בשייקר ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 250 סל"ד ולמדוד את OD600 עבור כל תרבות בנקודות זמן מוגדרות.
כדי להתחיל, להפוך 50 microliters של זן האב המשמש mutagenesis עם microliter אחד של פלסמיד שנושאת GFP מסוג פראי או PPG מסוג פראי. לוח ודגירה של תרבות התאים כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, להעביר את המושבות בנפרד לחמישה מיליליטר של מדיום LB מדולל כראוי.
דגירה הדגימות בשייקר ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות ב 250 סל"ד. עבור סמני פלואורסצנטיות, להעביר 200 microliters של תרבות התא לתוך 96 צלחת אחורית תחתונה ברורה היטב ב triplicate בנקודות זמן מוגדרות. למדוד את OD600 ב פלואורסצנטיות ולחשב את עוצמת הפלואורסצנטיות.
עבור סמנים כרומוגניים, למדוד את התפתחות הצבע של תרבות התא. בצע את בדיקת ההזנה כפי שתואר בעבר ולמדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות או את התפתחות הצבע בנקודות זמן מוגדרות. ראשית, להפוך 50 microliters של תאים מוטנטים עם microliter אחד של פלסמיד נושאת את סמן הבחירה KanR RC 29, או סמני ההקרנה GFP RC או PPG RC. לאחר מכן, צנטריפוגה תרבות התא ב 4000 פעמים G במשך חמש דקות.
לבחירה, השלך את העל-טבעי והוסף חמישה מיליליטר של מדיום 0.2 x LB המכיל קנאמיצין לתאים הנושאים את סמן הבחירה. דגירה המדגם לילה בשייקר ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת, צלחת תרבות הלילה על 0.2 x LB אגר בינוני המכיל קאנאמיצין ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות.
להקרנה, צלחת המספר המתאים של תאים מחסה סמן ההקרנה על מדיום אגר LB המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שמונה שעות. לאחר מכן, לחסן את המדיום LB המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה עם כל מושבה אחת מהצלחת.
הדגירה את הדגימות בשייקר ב 37 מעלות צלזיוס תוך רועד ב 250 סל"ד. למדוד את OD600 ואת הפלואורסצנטיות ולחשב את עוצמת הפלואורסצנטיות אם GFP RC משמש. למדוד את התפתחות הצבע של תרבות התא אם PPG RC משמש.
כדי לאמת את המוצריות של חומצות האמינו של הזנים המועמדים, הכינו את תרבות הזרעים על ידי חיסון חמישה מיליליטר של מדיום LB עם כל אחד מהזנים המועמדים ותנו לתאים לגדול בן לילה בשייקר ב-250 סל"ד וב-37 מעלות צלזיוס. למחרת, לקצור את התאים ממיליליטר אחד של תרבות התא על ידי צנטריפוגה ב 4000 פעמים G במשך שתי דקות. השליכו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את הצבעים במיליליטר אחד של מים סטריליים.
לחסן 20 מיליליטר של M9 בינוני המכיל ארבעה אחוז גלוקוז עם 200 microliters של ההשעיה התא דגירה בשייקר 250 מיליליטר ב 250 סל"ד ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. למחרת, צנטריפוגה מיליליטר אחד של מדיום התרבות ב 4000 פעמים G במשך חמש דקות. מעבירים 200 מיקרוליטרים של העל-טבעי לצינור נקי של 1.5 מיליליטר.
הכן פתרונות סטנדרטיים L-לאוצין בריכוזים המוצגים כאן. במכסה המנוע של האדים, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של טריאתילאמין מילימולארי אחד ו-100 מיקרוליטרים של פניל דיסותיוצ'ינאט טוחן אחד הן לעל-טבעי והן לסטנדרטים. מערבבים את הפתרונות בעדינות ומדרגרים אותם בטמפרטורת החדר למשך שעה.
לאחר מכן, להוסיף 400 microliters של n-hexane לאותו צינור ומערבולת זה במשך עשר שניות. השלב התחתון מכיל את נגזרות חומצות האמינו והוא משמש לניתוח HPLC. סנן את השלב התחתון באמצעות 0.2 ממברנות פוליטרא-פוליאואורואתילן מיקרוליטר.
לאחר מכן, הפעל מיקרוליטר אחד של המדגם על HPLC אולטרה מצויד בעמודה C18 עם קצב זרימה של 0.42 מיליליטר לדקה ו בטמפרטורת עמודה של 40 מעלות צלזיוס. השתמש בגלאי מערך דיודה כדי לזהות את חומצות האמינו הממוקדות ב-254 ננומטר ולחשב את הריכוזים שלהן על ידי מיפוי אזורי השיא מתחת לעקומה הסטנדרטית. במחקר זה, חומצות אמינו overproducers מזוהים באמצעות סמנים נדירים עשירים codon כדי להשיג בו זמנית דיוק, רגישות, ותפוקה גבוהה.
עבור מערכת הבחירה, יש לראות ירידה חדה ב- OD600 עבור זנים המטפחים את גן עמידות לאנטיביוטיקה נדיר עשיר בקודון בהשוואה לזן המטפח את סוג הבר. העיכוב של קודון נדיר על ביטויי חלבון מתרחש בעיקר בתנאים מורעבים. לאחר האכלה נוספת של חומצת האמינו המתאימה, OD600 עבור המתח מחסה את הגן נדיר codon עשיר עמידות לאנטיביוטיקה עולה באופן משמעותי.
עבור מערכת ההקרנה, עוצמת הפלואורסצנטיות במספר התאים הפלואורסצנטיים נמוכה משמעותית עבור הזן המבטא את החלבון הפלואורסצנטי מהגן הנדיר העשיר בקודון מאשר מהגן הפראי. האכלה של חומצת האמינו המתאימה תחזיר ביטויי חלבון מהגנים הנדירים העשירים בקודון. בעת שימוש בחלבון הסגול, הצבע שפותח מה-PPG הנדיר העשיר בקודון קל יותר מזה של הגן הפראי.
מדיום LB לא מזוהה מאפשר ביטוי איטי של PPG נדיר עשיר codon ללא L-לאוצין האכלה בחלבון הסגול לידי ביטוי הופך גלוי פעם התאים הם גלולה. עם זאת, זה לא מסתיר את העובדה כי ביטוי גנים מן PPG נדיר עשיר codon משופרת על ידי האכלה של L-לאוצין. האסטרטגיה הנדירה המבוססת על קודון יכולה לזהות את מייצרי יתר של חומצות האמינו הממוקדות מספריית המוטציות, ומוטנטים אלה צריכים לייצר כמויות גבוהות יותר של חומצות האמינו הממוקדות מאשר זני האב.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב להתאים תדירות קודון נדירה כדי להשיג אפליה ברורה ב- OD או בצבע בין תאים המכילים את סמני סוג הבר והנגזרות הנדירות העשירות בקודון. ניתוח Transcriptome ואת רצף הגנום יכול להיות מיושם על הזנים שנבחרו כדי לחקור את המנגנון הקשורים לייצור חומצות אמינו. באמצעות טכניקה זו, חומצות אמינו overproducers יכול להיות מזוהה ביעילות וניתוח של המידע הגנטי שלהם יציע תובנות חדשות לתוך המנגנונים שלהם מאחורי חומצות אמינו overproductions.
נגזרת חומצות אמינו עלולה להזיק. הקפידו ללבוש כפפות ובגדי מגן ולבצע את השלבים הבאים ברדס אדים.
