פרוטוקול זה מספק טכניקה קפדנית לשחזור עבור מיצוי ובידוד של גירויים חוץ תאיים קטנים מדגימות רקמה שלמה עבור ניתוחים במורד הזרם לשעבר vivo. עם בין הרמות הגבוהות ביותר של טוהר כיום בר השגה, שיטה זו מקלה על מורפולוגי ישיר, immunophenotypic, ואפיון עמוק של גירויים ביניים המופרשים לתוך דגימות רקמה שונות, כולל גידולים. כאן, אנו מדגימים את הבידוד של כלי רכב חשמליים רקמה מדגימות גידול במוח ובריאות.
עם זאת, טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על מחקרים באמצעות מגוון, שפיר, או דגימות גידול אחרות גם כן. כדי להתחיל, להכין 10 מיליליטר של חיץ דיסוציאציה ב Hibernate-E בינוני עבור כל 0.4 כדי 1.0 גרם של רקמה. מוסיפים רקמה טרייה או קפואה שלמה למאגר בצינור של 50 מיליליטר, וגוררים באמבט מים חמים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
לאחר מכן, מוסיפים מעכבי פרוטאז ופוספטאז לריכוז 1x הסופי במאגר הדיסוציאציה. יוצקים את הפתרון עם הרקמה לתוך התאמה רופפת downs homogenizer. השתמש כ 30 משיכות איטיות לכל מדגם כדי לנטרל בעדינות את הרקמה.
לאחר מכן, להעביר את הרקמה דיסוציאציה פתרון חיץ לצינור חרוט 50 מיליליטר. צנטריפוגה ב 500x גרם וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות כדי גלולה את התאים ואת הסיבים הנותרים או שברי רקמה מגוונים. מעבירים את העל-טבעי לצינור חרוט נקי של 50 מיליליטר, ולצנטריפוגה ב-2,000x גרם וב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לסלק ולהשליך את הפסולת התאית הגדולה.
מעבירים את העל-טבעי הזה לצינור חרוט נקי של 50 מיליליטר, ולצנטריפוגה ב-10, 000x g וב-4 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות כדי לסלק וריצים גדולים יותר או גופים אפופטיים קטנים. Decant supernatant דרך מסנן מיקרומטר 0.45 לתוך צינור אולטרה צנטריפוגה נקי 12 מיליליטר. לאחר מכן, ultracentrifuge את המדגם ב 100, 000x g ו ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעתיים, כדי גלולה כלי רכב חשמליים קטנים.
Decant את supernatant ולהשאיר את צינורות ultracentrifugation הפוך במשך חמש עד 10 דקות, הקשה לעתים קרובות כדי להסיר כל נוזל שיורית בצידי הצינורות. לאחר מכן, לחץ מחדש את גלולת EV ב 1.5 מיליליטר של 0.25 חיץ סוכרוז טוחנת. מכסים את הצינורות עם Parafilm, ולאחר מכן מערבולת כלי רכב חשמליים לפתרון.
רוק צינורות אולטרהצנטריפוגה במשך 10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר. ואז מערבולת פעם נוספת. בקצרה צנטריפוגה הצינורות במהירות פחות מ 1, 000x g כדי לשחזר את המתלה הנוזלי בתחתית הצינור.
במידת הצורך, לאחסן את ההשעיה בארבע מעלות צלזיוס לילה. ראשית, להוסיף 1.5 מיליליטר של 60% יודיקסנול 1.5 מיליליטר של מאגר טריס סוכרוז המכיל את כלי רכב חשמליים כדי ליצור פתרון סופי המכיל 30%יודיקסנול. פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לערבב את הפתרון ביסודיות.
העבר פתרון זה לתחתית צינור אולטרה-מרכז 5.5 מיליליטר. לאחר מכן, מערבבים את מניית יודיקסנול 60% עם מים טהורים במיוחד כדי להכין לפחות 1.5 מיליליטר של 20% ופתרון יודיקסנול של 10%. באמצעות מזרק ומחט 18 מד, למדוד 1.3 מיליליטר של פתרון 20% iodixanol בזהירות שכבה אותו על גבי שיפוע התחתון.
שמור על שפוע המחט במגע עם החלק הפנימי של הצינור, ממש מעל המניסקוס ולהוסיף את הפתרון טיפה חכם, כדי למנוע ערבוב השכבות בממשק הצפיפות. לאחר מכן, שכבה 1.2 מיליליטר של פתרון 10%iodixanol על גבי 20% שכבה, באמצעות אותה טכניקה. בזהירות לאזן ולהעמיס את צינורות אולטרה צנטריפוגה לתוך דליי רוטור.
הגדר את מהירויות ההאצה וההאטה של רוטור דלי נדנדה לתעריפים המינימליים, וצנטריפוגה ב 268, 000x g ו ב 4 מעלות צלזיוס במשך 50 דקות. בעוד המדגם הוא להיות צנטריפוגה, תווית 10 1.5 צינורות microcentrifuge מיליליטר עבור כל מדגם שיתאים שברים אחד עד 10 של שיפוע הצפיפות. לאחר השלמת הצנטריפוגה, מוציאים בעדינות את הצינורות מדליי הרוטור ומציבים אותם במחזיק יציב.
פיפטה 10 שברים סדרתיים של 490 מיקרוליטרים מהחלק העליון של המילוי לתוך הצינורות המתאימים. באמצעות מד שבירה, למדוד את האינדקסים שבירה של שברים. לאחר מכן, להעביר כל שבר לצינור נקי 12 מיליליטר אולטרהצנטריות.
הוסף חמישה מיליליטר של 1x PBS לכל צינור פיפטה למעלה ולמטה לאט לערבב. מוסיפים שישה מיליליטר נוספים של PBS 1x לראש הצינור, ומערבבים בזהירות שוב. Ultracentrifuge הצינורות ב 100, 000x גרם וב ארבע מעלות צלזיוס כדי לסלק מחדש את הווסיקלים הקטנים.
דקאנט את supernatant והקש על הצינורות יבשים לפני lysing את הווסיקים לניתוח חלבון או reresuspending כלי רכב חשמליים לניתוח מורפולוגי. כדי lyse כלי רכב חשמליים לניתוח חלבון, להוסיף 40 microliters של חיץ תזה חזקה המכיל מעכב פרוטאז כדורי EV. מניחים פרפילם מעל כל צינור, ומערבולת במרץ.
לאחר מכן, לטלטל את הצינורות במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר ומערבולת שוב. בקצרה צנטריפוגה המדגם ב 1, 000x g במשך 30 עד 60 שניות כדי לשחזר את נפח המדגם כולו. מעבירים כל דגימה לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר, ומאחסנים אותו בטמפרטורה שבין 20 ל-80 מעלות צלזיוס עד שהם מוכנים לעיבוד נוסף.
כדי להכין את lysates מטוהרים לניתוח immunoblot, להוסיף מאגר מדגם 5x Laemmli לדגימות לריכוז סופי של 1x. מרתיחים את המדגם ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש עד 10 דקות. לאחר מכן, טען נפח שווה של שברים אחד עד 10 לתוך ג'ל דף 10%SDS.
לטעון מסה שווה של הומוגנית רקמות. בצע אלקטרופורזה וניתוח כתם מערבי כדי לאשר חלבוני EV lysates מטוהרים ולהשוות שפע EV יחסי בשברים. במחקר זה, צמחים חוץ תאיים מופצים ומטוהרים מרקמות שלמות.
לאחר אולטרהצנטריפוגה של 10 עד 30% שיפוע יודיקסנול, ניתן לראות אוכלוסייה של כלי רכב חשמליים קלים נודדים עד שבר שני, בעוד אוכלוסייה של כלי רכב חשמליים צפופים ניתן לראות נודד עד שבר חמש, בהתאם לסוג הרקמה. immunoblots נציג של שברים הדרגתיים להפגין הפרדה יעילה וטיהור של גידול קטן נגזר כלי רכב חשמליים בשבריר חמש. יש לציין, דגימות גידול ריאות מופיעים מועשרים כלי רכב חשמליים צפופים לעומת כלי רכב חשמליים קלים שנקטפו בעבר מרקמה מוחית שלמה.
ניתוח מעקב חלקיקי ננו מייצג ומיקרוסקופ אלקטרונים של וריסקים שמקורם ברקמות בווסיקל השולט המכיל שבר מדגימים את ההעשרה והשימור של וריסקים שלמים. עולה בקנה אחד עם הגודל והמבנה הידועים של כלי רכב חשמליים קטנים. כלי רכב חשמליים Interstitial מייצגים מטרות מבטיחות לפיתוח בדיקות סמן ביולוגי אבחון או פרוגנוסטיות חדשניות.
טכניקה זו מספקת לחוקרים כלים לחילוץ וטיהור של וויסיקים עבור השירות במורד הזרם. לאחר החילוץ של כלי רכב חשמליים של רקמות שלמות או lysed, אפיון רחב של ווסיקים כולל ניתוחים פרוטומיים, גנומיים וליפידומיים עשוי להתבצע. בנוסף, ניתן להשתמש בדוגמאות לגישות ממוקדות יותר.
סיקלים מבודדים ישירות מדגימות רקמה יכולים לספק תובנה נוספת על מנגנוני המחלה, כולל בראשית הגידול, ועשויים לספק כלים אבחוניים או פרוגנוסטיים חשובים בעתיד.
