דג המערות מגדל כציור קיר פנטסטי של בעלי חיים כדי להבין את האבולוציה ואת התהליכים הביו-רפואיים. אנו מנהלים כעת חקירה ביו-רפואית על ידי שימוש בתכונה זו כמקבילה לתסמינים אנושיים. כאן נראה את סוללת ההתנהגויות ואת מערכת הניתוח שניתן להשתמש בה הן למחקרים אבולוציוניים והן למחקרים ביו-רפואיים.
כדי לתייג רטט מושך והתנהגות, מוט זכוכית רוטט מוכנס לתוך קערת זכוכית המכילה דג אחד בחושך. דגים מסתגלים ארבעה ימים לפני ההתאקלמות במים מותנים עם מחזור כהה של 12, 12 אור. יום לפני יום ההתאקלמות לאחר שלושה ימים של התאקלמות, החליפו מים בתא ההתנזרות במים מתוקים ומותנים.
ביום הבדיקה, דגים נמנעים ממזון עד לאחר השלמת הבדיקה, כי הפסקת תשנה את תגובתם לתנודות. הכינו מנגנון פולט רטט על ידי כוונון ל-40 הרץ. הגדר את פרמטרי ההקלטה, תנאי המלאי וקובץ היעד המתאימים.
מניחים צילינדר על במת ההקלטה, מואר באור אחורי אינפרא אדום בחדר חשוך, ומאפשרים לדגים להתאקלם במשך שלוש דקות לאחר שהוצבו על הבמה. לאחר התאקלמות של שלוש דקות בחושך, להקליט שלוש דקות ו -30 שניות של וידאו. בתחילת ההקלטה, הכנס את מוט הזכוכית הרוטט בקוטר 7.5 מילימטר לתוך עמוד המים, כ-5 ס"מ לעומק.
הימנעו מרעש או תנודות בעת מיקום מוט הזכוכית הרוטט במים, מכיווןים יכולים לחוש רעשים ותנודות קלות. הקפד לסיים הליך זה בתוך 30 שניות מהתחלת הקלטת הווידאו כדי להבטיח שיותר משלוש דקות של התנהגות מוקלטות. הפעל קובץ אצווה על-ידי לחיצה כפולה avs_creator.
עטלף כדי להמיר את וידאו AVI דחוס לפורמט קריא עבור ImageJ. ניתן לטעין את המאקרו פשוט על-ידי גרירה ושחרור לתוך מעטפת ממשק משתמש גרפי. מאקרו זה יהפוך מקשי קיצור מסוימים לזמינים עבור הניתוח הבא.
בספריית העבודה, צור תיקיה חדשה ותן לה Process_ImageJ. תיקיה זו תשמש באופן אוטומטי לאחסון קבצי פלט מהניתוח הבא. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על קובץ הווידאו AVS כדי לנתח ולבחור טעינה מהירה.
לאחר שקובץ AVS נטען ככונן חיצוני, פתח את קובץ AVI ב- ImageJ. כדי לקבוע את קנה המידה של מדידת המרחק, בחר את קוטר תא ההתמדה על-ידי ציור קו ישר לאורך התא באמצעות כלי בחירת הקו הישר ולאחר מכן הגדר את קנה המידה על-ידי לחיצה על נתח, הגדר פונקציית קנה מידה. במקרה שלנו, אנחנו קלט 9.4 ס"מ.
סמן את תיבת הרדיו הכללית כדי לתקנן את קנה המידה בכל ניתוח הווידאו הבא. העתיקו את אזור תא ההצבה בעזרת הכלי בחירה אליפטית, ולחצו לחיצה ימנית ובחרו תמונה כפולה. בשלב זה, ציין את טווח המסגרות שיש לשמור לניתוח נוסף.
נקה מחוץ לתא ההתבהרה והמר את התמונה לתמונה בינארית על-ידי פגיעה במקשה החמה שבע על סרגל המספרים. לאחר שהרקע יתנקה, תתבקש להוסיף נקודה שחורה במרכז כדי לציין את מיקום מוט הזכוכית הרוטט באמצעות כלי הבחירה הסגלגל שכבר מוגדר לשחור עם פונקציית המילוי. לחץ על אישור והמאקרו יבקש ממך לעבור להתאמת הסף.
התאם את הסף כך שניתן יהיה לראות את הדג לאורך כל סרטון הווידאו ולאחר מכן בחר החל. הפעל את יישום ה- Plug-in של Tracker על-ידי פגיעה במקשה החמה שמונה בסגת המספרים. הגדר את גודל הפיקסל המינימלי ל- 100, כשתתבקש לעשות זאת.
תהליך זה ייצור את המרחק בין מוט הזכוכית הרוטט לבין הדג למסגרת במשך כל שלוש הדקות של הסרטון הבינארי. כדי לשמור קובץ מעקב, לחץ על מקש קיצור 9 ב סרגל המספרים. פעולה זו תייצא באופן אוטומטי ערימה בינארית של תמונות של הווידאו כולו וקובץ XLS עם קואורדינטות ונתונים מרחק, במקרה שיש צורך ניתוח מחדש.
פעולה זו גם תסגור את כל הקבצים המשויכים לווידאו הנוכחי. כעת ניתן לנתח את הקבצים שנוצרו בהתאם לשאלת המחקר הספציפית. להתאקלם חמישה דגים ניסיוניים במשך ארבעה ימים או יותר בכל תא של עיצוב מותאם אישית 10 ליטר אקווריום הקלטה אקרילי מלא מים מותנים.
כל תא נפרד מופרד עם לוח אקריליק שחור. כל מיכל חייב להיות מכוסה כדי למנוע מדגים לקפוץ לתא אחר. הגדר טיימר צריכת חשמל ניתן לתיכנת כדי להפעיל באופן אוטומטי את תאורת LED לבנה למשך 12 שעות ולכבות למשך 12 שעות כל יום במהלך תקופת ההתאקלמות.
זה יהיה entrain השעון הביולוגי של דגים אם הדג רגישים entrainment. על מנת לספק אור לבן מפוזר יותר, אנו משתמשים בלוח אקריליק לבן שטוח אטום בממד דומה למיכל 10 ליטר כמפזר להעביר אור עבור כל מיכל. במהלך תקופה זו, לספק פעם ביום האכלה עם שרימפס מלח חי ולספק aeration באמצעות מסנן ספוג בכל אקווריום.
שימו לב, ודאו שהדגים ניזונים בזמן עקבי. לדוגמה, פעם אחת ביום בבוקר. יום לפני יום ההתאקלמות, שלושה ימים או יותר של ההתאקלמות, מחליפים מים בתא ההתרשמות במים מתוקים ומותנים.
הגדר את הקלטת הפרמטרים בתוכנת VirtualDub. הסרטון יוקלט ב-15 פריימים לשנייה בזמן החשיפה הקבוע. וידאו דחוס ב- Codec X264VFW כדי להשיג כ 700 פעמים דחיסה.
ביום ההקלטה, להאכיל כל דג עם שרימפס מלח חי. הסר את כל מסנן הספוג והתחל להקליט. הפעל את נורית האינפרא-אדום בשלב ההקלטה.
על ידי התבוננות בתמונה חיה VirtualDub על המסך, התאם את המיקום של כל אקווריום כדי לוודא שהם פונים כראוי למצלמת ה- USB. התחל הקלטה של 24 שעות בבוקר. לדוגמה, זמן ההתחלה הוא 9 .m.
ושזמן הסיום הוא 9 .m למחרת. התחל ללכוד את הווידאו ולאבטח את המיקום כדי למנוע הפרעה.
מדי פעם בדוק אם ההקלטה פועלת. לאחר הקלטה של 24 שעות, ודא שהסרטון נשמר כראוי. העבר את הווידאו לתחנת העבודה של המחשב כדי לעקוב אחר התנהגות הדג.
לאחר העברת הווידאו לתיקיה המתאימה, בצע במהירות בדיקת איכות של הווידאו כדי לוודא שהוא באיכות טובה. זה כולל התבוננות בתאורה, בדיקה אם יש דג אחד בכל קטע, ואם יש תנועות זרות שעלולות לגרום לטעות. מכאן, SwisTrack תוכנה חופשית משמש למעקב אחר בעלי חיים.
היתרון של תוכנה זו הוא שהתוכנה יכולה לעקוב אחר בעלי חיים מרובים בבת אחת ולהחסיר תמונת רקע באמצעות מסגרת שרירותית שאנו מזהים. החסרונות הם שמעקב עלול לקפוץ בין זירות המכילות דג אחר. ייתכן שתדמית הרקע אינה מתאימה למסגרות המאוחרות יותר, ו-SwisTrack מקצה באופן אקראי מזהה מעקב לדגים בודדים, ולכן יש צורך לשחזר את מזהה הדג על-ידי התוויית המיקום הפיזי הממוצע של כל דג.
כדי להתגבר על נושאים אלה, נעשה שימוש בשלוש גישות. שימוש במסכות בינאריות, אחת למעקב אחר זירות זוגיות, ואחד למעקב אחר זירות אי-זוגיות. השימוש באוטומציית Win כדי לעדכן באופן אוטומטי תמונות רקע כל שלוש דקות והשימוש בתסריטים של Perl כדי לשחזר את מזהי הדגים.
הצעד הראשון של הניתוח הוא להפוך את המסכות הבינאריות לזירות מוזרות ואפילו. לאחר בדיקת איכות הווידאו, בחר מסגרת מייצגת בתוכנה לעריכת וידאו ולהשתמש בה כדי ליצור שתי מסכות בינאריות, אחת זוגית ואחד לזירות אי-זוגיות. מטרת המסכות הבינאריות הללו היא להימנע ממגעים מוטעים בין זירות סמוכות.
לאחר יצירת מסיכות בינאריות, פתחו את קובצי הפרמטרים SwisTrack הקובעים את נתיבי הקבצים ופרמטרים עבור תהליך המעקב. הכן קובץ פרמטר אחד בכל אחת מתיקיות הקבצים הזוגית והמוזרה עבור מעקב הווידאו. בקובץ זה, הקלד את הנתיב למיקומי הקבצים של קבצי הווידאו והמסיכה.
לאחר הכנת קבצי הפרמטרים, פתח את קובץ ההפעלה Win-automation המאפס באופן אוטומטי את הרקע כל שלוש דקות. עם קובץ הפעלה זה, SwisTrack יפעל באופן אוטומטי, ולאחר מכן לפתוח את קובץ הפרמטר בכל תיקיה זוגית או אי זוגית בתוכנת מעקב זו. הפעל את תוכנת המעקב כדי לעקוב אחר תנועת הדגים.
בתוך 9, 000 מסגרות המעקב הראשונות, ודאו שהדגים נמצאים במעקב נכון על ידי התבוננות ברכיב המעקב הקרוב ביותר של השכנים. לאחר יצירת מעקב תקין, חזור לטבלת רכיב חיסור הרקע הסתגלותי ולחץ על מקש קיצור R במקלדת כדי להפעיל את Win-automation להפחתת רקע אדפטיבי רציפה. לאחר כחמש שעות, קבצי טקסט נוצרים עבור כל דג, המכיל קואורדינטות X ו- Y עבור כל מסגרת של הווידאו.
כדי להמשיך בניתוח, הקצה את שלושת קבצי ה- Script של Perl לתיקיה הכוללת הן תיקיות זוגיות והן תיקיות אי-זוגיות. כדי להמיר אורך בפיקסלים לס"מ, יש לדעת את יחס הס"מ לפיקסל. הקלד יחס זה במיקום המתאים של קובץ ה- Script Perl בשם 1.fillupGaps.pl.
הפעל 1.fillupGaps. pl פרל סקריפט באמצעות אמולטור יוניקס עבור Windows. תחילה, השתמש בפקודה CD כדי לעבור לספריה העובדת הנוכחית ולאחר מכן הקלד Perl 1.fillupGaps.
pl כדי להפעיל את התסריט Perl. שני קבצי ה- Script האחרים ייקראו באופן אוטומטי בסדר רציף. שלושת הסקריפטים האלה מקצים כל קובץ מעקב לכל מקטע באקווריום, ולכן ניתן להשתמש בהם כדי לנתח את ההתנהגות של כל דג.
התייעץ עם קובץ הטקסט Summary_Sleep שנוצר לאחר הפעלת קבצי ה- Script כדי לבדוק שוב שמספר המסגרות שהושמטו מהניתוח נמוך באופן בר-ביצוע. חסרים פחות מ- 15% מהמסגרות נחשב מקובל. העתק והדבק נתוני מעקב בקובץ גיליון אלקטרוני באמצעות מאקרו מקומי.
מאקרו זה יבנה מחדש את הנתונים שנותחו למספר רמות תהליך שלבים, כגון ממוצע משך השינה וסכום מרחק השחייה. על מנת להכתים את הקו הצולב של הדגים, יש להמיס את תמיסת מלאי DASPEI במים מותנים לריכוז סופי של חמישה מיקרוגרם למיליליטר, ולאחר מכן לטבול את הדג בתמיסה בטמפרטורת החדר בסביבה חשוכה למשך 45 דקות. לאחר 45 דקות, לשחזר את הדגים מתספורת DASPEI לטבול אותו במים קרים כקרח מותנה עם MES משולש שתיים.
לאחר הדג הוא הרדמה עמוקה, הר את הדגים בצלחת פטרי ולהתבונן בו תחת מיקרוסקופ יעיל. הקפד לקחת סדרה סטטיסטית כדי לכלול את כל התוכניות של הדגים בפוקוס ולאסוף הכל בתמונה אחת. לניתוח תמונה, הוסף תיקיה חדשה Process_ImageJ את קובץ המאקרו לתיקיה המכילה את התמונות שיש לנתח.
פתח את תוכנת ImageJ ולאחר מכן פתח מאקרו על-ידי גרירת קובץ המאקרו אל ImageJ. הפעל מאקרו על-ידי לחיצה על פקודות מאקרו, הפעל מאקרו. אם התמונה אינה נפתחת באופן אוטומטי, לחץ על מאקרו, איסוף קבצים.
לאחר מכן המאקרו יתסוף באופן אוטומטי קובץ תמונה לניתוח. עבור כימות neuromast מראה את האזור של עניין על ידי לחיצה על מצולע 2, ולצייר את האזור על התמונה. שמונה, חמש לאזור עניין כפול.
השתמש בכלי צבע כדי להסיר או להוסיף נקודה נוספת או חסרה בתמונה הקודמת ולאחר מכן שמונה, שש. ברגע שאתה שמונה, שש, שני חלונות חדשים יופיעו. חלון המציג ערכה של נקודות נוירומאסט ממוספרות וחלון עם שולחן עם נוירו-מיסט כולל מכומת.
הכה שבעה כדי לשמור את שני הקבצים. לאחר שתלחץ על אישור, קבצים אלה יאוחסנו וקובץ תמונה חדש ייפתח לניתוח נוסף. אחד את ספירת הנוירו-מיסט על-ידי הפעלת מאקרו.
התוצאות הבאות הן תוצאות מייצגות של מה ניתן לצפות עבור שני morphs של דגים בתנאים מבוקרים. ארבע הדמויות הללו מראות תוצאות מייצגות של תנודות בהתנהגות המשיכה. A ו- B הם הנופים המובילים של שביל השחייה של A, דג פני השטח, ו- B דג מערה.
קווים אדומים הם העקבות של הקואורדינטות שנוצרו על ידי מעקב ImageJ על פני שלוש דקות של הקלטה. C ו- D מציגים השוואה של התוצאות מ- C, דג פני שטח ו- D, דג מערה, שחולצו על-ידי מאקרו הגיליון האלקטרוני מקבצי TXT. ציר ה-Y הוא מספר הפעמים שהדג התקרב למוט הרוטט.
כל נקודה מייצגת תצפית ניסיונית אחת במהלך ההתקף ההתנהגותי של דג אחד. שימו לב כי דגי פני השטח אינם מראים עלייה בגישות בכל תדר, בעוד דגי מערות מראים מקסימום משיכה סביב 35 עד 40 הרץ. שני איורים אלה מציגים תוצאות מייצגות ממסיונות התנהגות שינה שחולצו על-ידי פקודות המאקרו של הגיליון האלקטרוני מקבצי TXT.
A ו- B מדגימים שניים מהמדדים המסוכמים באופן אוטומטי על-ידי קובץ המאקרו. איור א' מציג את מרחק השחייה בשעות היום והלילה עבור דגי שטח ודגי מערות, בעוד ש-B מציג משך שינה עבור שני מורפים. במקרה זה, דג המערות הראה היפראקטיביות ופחות שינה בהשוואה לדגים פני השטח.
נתונים אלה מציגים תוצאות של ניתוח תמונת DASPEI שחולץ על-ידי מאקרו הגיליון האלקטרוני מקבצי TXT. A ו- B מדגימים את הקשר בין מספר נוירומאסט לעומת התנהגות משיכה רטט וגודל neuromast לעומת ההתנהגות של דגי מערות, דגי פני השטח, וצאצאי F1. כל נקודה מייצגת כל דג.
הערה, מספר neuromast הוא בקורלציה חיובית עם התנהגות משיכה רטט, מה שמרמז כי neuromast עשוי לווסת התנהגות זו. גודל נוירומאסט תומך גם במסקנה זו. C ו- D הן תמונות לדוגמה של נוירומאסט מוכתם DASPEI של C, דג פני השטח, ו- D, דג מערה.
כל נקודה פלואורסצנטית בתמונות היא נוירומאסט אחד, אשר לקח את DASPEI. שימו לב, השפע הגדול יותר של נוירומסטים על דגי מערות. הראינו סדרה של ניתוחי התנהגות עבור פעילות שחייה ושינה מבוססת קו קו.
מערכת המעקב אחר בעלי חיים יכולה גם להיות מותאמת להתנהגויות אחרות, כגון התנהגויות סטריאוטיפיות שחוזרות על עצמן, אינטראקציות חברתיות, והתנהגותיות.
