שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האפיגנומיקה על ידי הדגמת כיצד לתכנן וליישם כלי מבוסס רצף כדי להעריך את ההשפעה של גורמים סביבתיים על מתילציה DNA. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יכולה לספק שיטה מקיפה וכמותית יותר להערכת רמות מתילציה של DNA בהשוואה לפלטפורמות מבוססות מערך. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב לקראת זיהוי של שינויים מתילציה DNA בשל סוגים שונים של תהליכים פיזיולוגיים בכל אורגניזם שנתוני הרצף שלהם זמינים.
למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך ההשפעה של מתח על מתילציה DNA, זה יכול להיות מיושם גם על גורמים סביבתיים אחרים או תנאים פיזיולוגיים, כגון חשיפה רעילים סביבתיים בתזונה עתירת שומן ותנאים כגון סוכרת ומחלות לב וכלי דם. לאחר גירוז DNA ואימות הגודל באמצעות bioanalyzer, להוסיף 180 microliters של חרוזים מגנטיים מחייב DNA לכל מדגם, דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. גלולה את חרוזים על צלחת מגנטית, ולהסיר את supernatant.
תן שימוש חוזר לכדור ב-200 מיקרוליטרים של 70%אתנול. לאחר מכן, להשתמש בצלחת מגנטית כדי גלולה את חרוזים, ולהסיר אתנול רב ככל האפשר. יבש את חרוזים בבלוק חום ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש עד חמש דקות.
לאחר מכן, תן שימוש חוזר את גלולה ב 44 microliters של מים ללא גרעין, ולאסוף כ 42 microliters של supernatant. לאחר קשירה של המתאמים ואימות קשירה באמצעות bioanalyzer, להעביר את הדגימות צינורות microcentrifuge מחייב DNA נמוך. לאחר מכן, השתמש ברכז ואקום מחומם כדי להפחית את נפח המדגם מתחת ל-3.4 מיקרוליטר.
לאחר מכן, להוסיף 5.6 microliters של מתיל-Seq בלוק לערבב לכל מדגם, ודגירה אותם במחזור תרמי. הכן שילוב הכלאה של ספריית לכידה בהתאם לפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, הוסיפו 20 מיקרוליטרים של מיקס ההכלאה של ספריית הלכידה לכל מדגם, והדגירה ב-65 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.
לקראת סוף תקופת הדגירה, הכינו חרוזים מגנטיים סטרפטבידין על ידי הוספת 50 מיקרוליטרים של חרוזים מגנטיים סטרפטבידין לכל מדגם לצינור רצועה חדש בן שמונה בארות. לשטוף את חרוזים עם 200 microliters של מאגר כריכת מתיל-Seq. מניחים את צינור הרצועה על צלחת מגנטית, ומסירים את העל-טבעי מהחרוזים.
לאחר מכן, תן שימוש חוזר בחרוזים ב-200 מיקרוליטרים של מאגר כריכת מתיל-סק. מוסיפים את הדגימות לחדדי סטרפטבידין השטופים, ודגירה אותם בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות על מערבל מסתובב. בעוד הדגימות לערבב, aliquot 200 microliters של מתיל-Seq לשטוף Buffer שתיים לתוך בארות טריליקט של צלחת 96 היטב מראש חם ל 65 מעלות צלזיוס.
לאחר הדגימות דגירה, גלולה חרוזים מגנטיים עם צלחת מגנטית ולהסיר את supernatant. לאחר מכן, תן שימוש חוזר בחרוזים ב-200 מיקרוליטרים של מאגר כביסה של מתיל-סק 1. דוגרים את החמרוזים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, ולהשתמש בצלחת מגנטית כדי להסיר את העל-טבעי.
לאחר מכן, תן שימוש חוזר גלולת חרוזים ב 200 microliters של מאגר לשטוף מחומם מראש 2. לאחר מכן, הדגירה את חרוזים במחזור תרמי לפני השימוש בצלחת מגנטית כדי גלולה את חרוזים. הוסיפו 20 מיקרוליטרים של חיץ אלוטיון מתיל-סק לחדדים השטופים, והאדמו אותם בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
השתמש בצלחת מגנטית כדי גלולה את חרוזים, ולהעביר את supernatant לצינור רצועה חדש. ראשית, להוסיף 130 microliters של reagent המרה ביסולפית כדי supernatant שנאסף בעבר. חלק את התגובות של 150 מיקרוליטר באופן שווה לשתי בארות.
לאחר מכן, הדגירה את התגובות במחזור תרמי. השתמש 600 microliters של מאגר כריכה כדי לאגד את הדגימות לעמודי ספין, ולשטוף את העמודים עם 100 microliters של מאגר לשטוף. לאחר מכן, צנטריפוגה העמודות, ולזרוק את הזרימה דרך.
לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטרים של מאגר דסולפוניזציה לעמודות. הדגירה את העמודים במשך 15 עד 20 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את העמודים פעמיים עם 200 microliters של חופר לשטוף.
לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטרים של מאגר אלוטיון לעמודה. דגירה בטמפרטורת החדר, וצנטריפוגה. הכן את שילוב תבנית הבסיס לתגובת PCR בהתאם לפרוטוקול הטקסט.
לאחר מכן, הוסיפו 82 מיקרוליטרים של תערובת האב לכל דגימה, והדגירה את הדגימות במחזור התרמי. ראשית, להכין את PCR מאסטר לערבב 2 על הקרח על פי פרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, לכל מדגם, להוסיף 25.5 microliters של PCR מאסטר לערבב שני וחמישה microliters של פריימרים אינדקס מסחרי, ותדגיר את הדגימות במחזור תרמי.
להעריך את ריכוז ה-DNA של הדגימות עם רייגנטים גילוי DNA רגישות גבוהה על bioanalyzer. ספריות מתיל-Seq נשלחות לאחר מכן לרצף ברצף הדור הבא. לאחר המרת ביסולפיט ודגימות אימות הגברה של PCR, הכינו תערובת ראשית עם חיץ כריכה, מים וחרוזי ספרוז מצופים סטרפטוודין.
לאחר מכן, הוסיפו 75 מיקרוליטרים של תערובת האב וחמישה מיקרוליטרים של מוצר PCR מקונן לצלחת של 96 בארות, ונערו את הצלחת על שייקר צלחת במשך 15 עד 60 דקות. בזמן שהצלחת רועדת, מוסיפים 12 מיקרוליטרים של פריימר ל הבאר של צלחת בדיקה פירוזקווינקינג. לאחר הרעידות, מניחים כלי ואקום באבוס מלא במים, ואז מניחים את הכלי בצלחת עם תגובות מחייבות.
לאחר מכן, הטביעו את כלי הוואקום באבוסים מלאים למחצה המכילים 70% אתנול, נתרן הידרוקסידי ומאגר טריס-אצטט. נתק את הוואקום, והצב את כלי הוואקום בצלחת ההסקה של HS כדי להעביר את חרוזים. מניחים את הצלחת על בלוק חום, ודגירה ב 80 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות.
לבסוף, לאפשר את הצלחת להתקרר במשך חמש דקות לפני תחילת תוכנית pyro. בפרוטוקול זה, ניתוח של ספריות מתיל-Seq סיפק רשימה מדורגת של אזורים מתילציה דיפרנציאלית, או DMRs, בין בעלי חיים לחוצים ובלתי מעורערים לבין חלקה גרפית של DMRs. אימות באמצעות pyrosequencing ביסולפי הראה כי בעלי החיים הדגיש כל הציגו רמות מתילציה גבוהות יותר על פני כל CpGs מאשר בעלי החיים unstressed.
רמות מתילציה ב- CpG 10 הושוו גם לרמות ה- CORT הממוצעות של שלושה שבועות עבור כל בעל חיים. התוצאות מצביעות על כך שיש מתאם צנוע בין הנתונים האנדוקרינית ומתילציה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשוות את הגידול בגודל ה- DNA הממוצע בין גיזום DNA לבין שלבי רצועות מתאם ולהבטיח כמות ספריה מספקת לפני רצף.
בעקבות הליך זה, גישות דומות אחרות ניתן ליישם על מנת לענות על שאלות חדשניות, כגון ההשפעה של רעילים סביבתיים על נוירו-פיתוח עכברוש. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סיפקה לחוקרים בתחום האפיגנטיקה לחקור שינויים במתילציה של דנ"א כלל-גנומי בכל אורגניזמים שאינם מודלים או מודלים שבהם רצפים גנומיים זמינים. אל תשכחו שעבודה עם האנזימים הרגישים לטמפרטורה דורשת אחסון על קרח בזמן השימוש והאחסון במקפיא של מינוס 20 מעלות.
גם קדזי ה-RNA המשמשים ללכידת מטרה דורשים הפשרה ואחסון על קרח בזמן השימוש והאחסון לטווח ארוך במקפיא במינוס 80 מעלות.
