שיטה זו, CARIC, יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום שלאחר שעתוק של בילוי גנים על ידי מתן מפקד מקיף של חלבונים מחייבי RNA. היתרון העיקרי של CARIC הוא היכולת שלה ללכוד חלבונים הקשורים לסוגים שונים של RNAs כגון mRNAs ו- RNAs שאינם קידוד. שיטה זו יכולה לשמש בסוגים שונים ואת האורגניזם כדי ללמוד את האינטראקציה חלבון RNA בעבודה.
ראשית, תאי HeLa תרבותיים ב- DMEM בתוספת ב 37 מעלות צלזיוס באטמוספרה של חמישה אחוזים CO2. כאשר התאים מגיעים כ 80 אחוז confluence להחליף את מדיום התרבות על כל מנה עם 15 מיליליטר של מראש, בינוני טרי. הוסף 15 microliters של 100 מילימולר האיחוד האירופי לכל מנה לריכוז סופי של מילימולר אחד.
לדגימות בקרת UV ניסיוניות וללא UV הוסיפו 7.5 מיקרוליטרים של 100 מילימולרים ארבעה SU לכל מנה. מכסים את הכלים בנייר כסף ותרבות התאים במשך 16 שעות באמצעות התנאים הקודמים. לאחר מכן, להוסיף מחצית הסכום הקודם של האיחוד האירופי ו / או ארבעה SU לצלחות המתאימות ולהמשיך culturing במשך שעתיים נוספות.
כדי להתחיל בקישור צולב vivo, להסיר את מדיום התרבות ולשטוף כל מנה שלוש פעמים עם PBS באמצעות חמישה מיליליטר של PBS לכל לשטוף. הסר את שאריות PBS ככל האפשר. עבור ניסיוני ולא ארבע דגימות בקרת SU, מניחים את הכלים על קרח עם המכסה הוסר.
השתמש UV cross-linker כדי להקרין את התאים עם אור UV ב 365 ננומטר ב שני ז'ול סנטימטר בריבוע. עבור דגימות בקרת UV ללא, מניחים את הכלים על קרח ולהגן עליהם מפני אור. לאחר מכן, מוסיפים מיליליטר אחד של מאגר פרה-סיסה לכל מנה.
השתמש מרים תא גומי כדי לגרד את התאים ולאסוף את ההשעיה prelysis בצינור 15 מיליליטר. הוסף חיץ prelysis לצינור המכיל את ההשעיה משתי מנות התאמת הנפח הכולל לשישה מיליליטר. לאחר מכן הוסף אמצעי אחסון שווה של מאגר lysis R.
מעבירים את ליסט התא דרך מזרק עם מחט צרה מספר פעמים עד שהליסט ברור והומוגני. הדגירה lysate בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב עדין במשך שעה אחת. לאחר זה לדלל את lysate ב 20 כרכים של חיץ דילול ולחלק אותו 15 שברים מיליליטר ב 15 צינורות untrafiltration מיליליטר, ניתוק מולקולרי של 10 קילודלטונים.
באמצעות מסובב דלי מתנדנד, לסובב את הצינורות ב 4000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך כ 15 דקות עד כל שבר מרוכז לנפח פחות ממיליליטר אחד. מוסיפים 14 מיליליטר של חיץ דילול לכל שבר ליט מרוכז וחוזרים על תהליך הריכוז. לאחר מכן לשלב את השברים ולרכז אותם לנפח של שישה מיליליטר באמצעות תהליך הריכוז שתואר קודם לכן.
תחילה הכינו את ערבוב התגובות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מוסיפים את תערובת התגובה לשישה מיליליטר של ליט מנוקה מראש ומערבבים היטב. מוסיפים 162.5 מיקרוליטרים להפחתת רהגנט ומערבבים היטב.
דגירה בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולית ב 800 סל"ד במשך שעתיים. לאחר מכן מרווה את התגובה על ידי הוספת EDTA מילימולר ודגירה על שייקר מסלולית בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר מכן, לפצל את תערובת התגובה בין שני צינורות 50 מיליליטר, כל אחד מכיל ארבעה כרכים של מתנול מקורר מראש דגירה שלילית 30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
צנטריפוגה ב 4000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. השליכו את העל-טבעי והוסיפו בין מיליליטר אחד לשני מיליליטר של מתנול מקורר מראש לכדור. Pipet למעלה ולמטה כדי לשבור את גלולה לוודא כי גלולה בסופו של דבר מושעה לחלוטין ללא נתחים גלויים.
חזור על תהליך הצנטריפוגה וההפוגה פעמיים. לאחר מכן, בזהירות למשוך את מתנול שיורית ככל האפשר לוודא לא להפריע גלולה. הוסף 10 מיליליטר של חיץ התחדשות צינור למעלה ולמטה כדי להמיס את גלולה.
צנטריפוגה ב 4000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר מכן להעביר את supernatant לצינור חדש הקפד לאסוף 20 microliters של המדגם לבקרת איכות. מעבירים את הדגימה המנוקה והמשוחזרת לתרוזות הסטרפטבידין המוכנות.
דגירה בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב עדין לילה. סובב את חרוזים ב 4000 פעמים G במשך חמש דקות. העבר את supernatant לצינור חדש הקפד לאסוף 20 microliters של המדגם לבקרת איכות.
לשטוף את חרוזים עם 10 מיליליטר של חיץ לשטוף A.Incubate עם סיבוב עדין ב 12 סל"ד ו בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. ואז לסובב את חרוזים ב 4000 פעמים G במשך חמש דקות. הסר את העל-טבעי וחזור שוב על תהליך הכביסה והצנטריפוגה.
חזור על תהליך שטיפה זה עבור מאגר שטיפה B ושטיפת מאגר C כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, לשטוף את חרוזים עם 10 מיליליטר של 50 מילימולר טריס הידרוכלוריד. לסובב את חרוזים למטה ב 4000 פעמים G במשך חמש דקות.
הסר את העל-טבעי ופצל את חרוזים באופן שווה בין שני צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5. כדי להתחיל לחמק RNPs שנתפסו, להוסיף 400 microliters של מאגר אלוטין ביוטין מוכן 400 microliters של נדנוד, חרוזים מיושבים. דגירה על שייקר מסלולית ב 1500 סל"ד בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
ואז דגירה על שייקר מסלולית עם בלוק חום ב 1500 סל"ד ו 65 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. צנטריפוגה את חרוזים ב 7800 פעמים G במשך דקה אחת ולאסוף את RNP חמק. מוסיפים 400 מיקרוליטרים של מאגר אלוטין ביוטין טרי לחרוזים.
חזור על תהליך הדגירה והצנטריפוגה כדי לאסוף אלוט שני ולשלב את שני elutes בצינור אחד 15 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף שלושה אמצעי אחסון של מאגר דילול ל- RNP המשולב כדי להקטין את הריכוז של SDS. באמצעות צינור סינון אולטרה 0.5 מיליליטר, לרכז את המדגם על 40 microliters כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט.
הוסף 0.5 מיקרוגרם למיקרוליטר RNase A ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים כדי לשחרר RBPs מ RNase מקושר. לאסוף שני microliters של RBPs לבקרת איכות. בעת מיטוב פרוטוקולי CARIC, שלבי בקרת האיכות הם קריטיים.
בקרת איכות מייצגת של הדגימות המסותוויות בלחיצה מתבצעת באמצעות ניתוחי פלואורסצנטיות בג'ל. רק המדגם המסומן כפליים מראה רצועת מריחה חזקה במשקל מולקולרי גבוה המייצגת את האות של RNPs מקושרים. אות ה- RNP מבוטל על-ידי השמטת ארבעת ה- SU או האיחוד האירופי. זה יכול גם להיות בוטל על ידי עיכול עם RNase A.In במקרים מסוימים רצועה מרוחה חזקה נצפתה לא ארבע מדגם בקרת SU.
רצועה זו מייצגת את RNase לא מקושרים שכותרתו אשר יהיה להשפיל במהלך innaturation החום ברוב המקרים. בקרת איכות של זיקה סקר dataficiency מוערך באמצעות ניתוח כתם מערבי אשר מראה את אותות ביוטין בדגימות הן לפני נסיגה ולאחר נסיגה. ניתוח כתמי כסף של RBPs שנתפסו מגלה כי עבור תאי HeLa, יעילות הלכידה הכוללת הכללית היא בין 0.05 ל -0.1 אחוזים מחלבוני הקלט.
בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור כי RNase רגישים ריבונוקלזות. שמור על הסביבה הניסיונית נקייה ככל האפשר כדי להפחית את degredation של RNase. בעקבות הליך זה, זיהוי חלבון almake באמצעות ספקטרומטריית מסה יכול להיות preformed כדי לחשוף את החלבונים ברזל תוחמים.
לאחר פיתוחה, טכניקת CARIC תסלול את הדרך להבנה מקיפה יותר של תקנת OT שעתוק הדואר בעבודה.
