שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי הגדרת מסלול מטבולי בתאי לוקמיה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת מדידה של חילוף החומרים של תאי לוקמיה ראשוניים בזמן אמת בתאים חיים. התחל בדילול דגימת מח עצם המתקבלת מחולה לוקמיה ב- PBS ביחס של אחד לאחד.
בזהירות, שכבה שישה מיליליטר של דגימת מח עצם מדוללת מעל שישה מיליליטר של מדיום שיפוע צפיפות מוכן טרי בצינור חרוט 15 מיליליטר ולהפריד את התאים על ידי צנטריפוגה הדרגתית צפיפות. השתמש צינור פסטר להעביר בזהירות את שכבת הממשק של תאים mononuclear לצינור חרוט חדש 50 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של PBS עבור לשטוף צנטריפוגה. לאחר מכן, תן שימוש חוזר את גלולת התא המונונוקלארי בשני מיליליטר של PBS סטרילי לספירה.
לדלל את התאים לשלוש פעמים 10 לשבעה תאים לריכוז מיליליטר. ולהוסיף מיליליטר אחד של תאים לכל אחד משני flasks T75 המכיל 20 מיליליטר של מדיום RPMI עבור דגירה 16 עד 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2. בינתיים כדי להכין את הצלחות לניתוח שטף חוץ תאי, להוסיף 12.5 microliters של פתרון דבק התא לתוך כל באר של שניים, שמונה גם צלחות מנתח שטף חוץ תאיים.
לאחר 20 דקות, שאפו את דבק התא ושטפו כל באר פעמיים עם 200 מיקרוליטרים של מים סטריליים לכל שטיפה. לאחר הכביסה השנייה, משאירים את הצלחות במכסה המנוע עד שה בארות יבשות. ות מניחים את מחסנית החיישנים הפוכה על ספסל המעבדה.
הפרד את לוחית השירות ואת מחסנית החיישן של מנתח השטף. ולמלא כל באר של צלחת השירות עם 200 microliters של כיול וכל חייט סביב החלק החיצוני של בארות עם 400 microliters של כיול. החזירו את מחסנית החיישן לצלחת השירות המכילה כעת את הכיול והצבו את מכלול המחסנית באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס ללא CO2 למשך הלילה.
ואז להפעיל את מנתח שטף חוץ תאי ולתת לו חם ל 37 מעלות צלזיוס לילה. למחרת בבוקר, להעביר את התאים מהבקבוק ל50 צינורות חרוט מיליליטר לצנטריפוגה. ולתלות מחדש את כדורי במיליליטר אחד של המדיום הניסיוני המתאים לספירה.
תן שימוש חוזר בתאים במהירות של פי 4 מ-10 לששת התאים ב-400 מיקרוליטרים של ריכוז בינוני ניסיוני. ולהוסיף 50 microliters של תאים לתוך בארות B דרך G של צלחת מנתח שטף. ו-180 מיקרוליטרים של המדיום הניסיוני לתוך בארות A ו-H כ בארות בקרת הרקע.
לאחר צנטריפוגה לאט ובזהירות להוסיף 130 microliters של המדיום הניסיוני בארות B דרך G.ו חזותית לאשר דבקות יציבה של התאים לתחתית של כל באר מתחת למיקרוסקופ. ואז להחזיר את צלחת ניתוח שטף לח 37 מעלות צלזיוס אינקובטור ללא CO2 במשך 30 דקות. 20 דקות לפני סוף הדגירה, לטעון את התרכובות לתוך יציאות מזרק המתאים של המחסנית על פי פרוטוקול הניסוי כפי שצוין בטבלה.
לאחר מכן הגדר את תוכנית ניתוח השטף החוץ-תאית המתאימה. הפעל את התוכנית והחלף את לוח הכיול בצלחת ההתבקש כאשר תתבקש לעשות זאת. במבחן מאמץ גליקוליזה, רק מדיום בסיסי משמש כך התאים נמנעים חומרים מזינים.
הפרמטר הראשון המתקבל הוא חומציות בזלית אשר אמור לשקף את כמות הגלוקוז המאוחסנת בתאים. לאחר הזריקה הראשונה, קצב החומציות החוץ תאית גדל ככל שהתאים מנצלים את הגלוקוז יכולים לתסיס את הגלוקוז ללקטאט. האוליגומיצין A בזריקה השנייה מעכב סינתאז ATP ובכך מנחה את התאים לייצר ATP בעיקר על ידי גליקוליזה הגורמת לעלייה נוספת של קצב החומציות החוץ תאית.
בעוד הזרקת 2-Deoxy-D-גלוקוז מעכב לחלוטין גליקוליזה ואת שיעור חומציות חוץ תאית יורד. במבחן הלחץ של מיטו התא, מדיום בתוספת גלוטמין וגלוקוז משמש כך התאים אינם משוללים את כל החומרים המזינים. פרמטר הנשימה הבסיסית משקף את מצב חילוף החומרים הבסיסי שלהם.
לאחר הזריקה הראשונה עם אוליגומיצין A, התאים מעכבים נשימה מיטוכונדרית ועוקבים לגליקוליזה המיוצגת כירידה בקצב צריכת החמצן. הזריקות השניה והשלישית של FCCP עם זאת, uncouple ייצור ATP מן הנשימה, כך התאים צורכים כעת חמצן בקצב מקסימלי. וקצב צריכת החמצן עולה לערך הגבוה ביותר שלו.
הזריקה האחרונה של רוטנון ואנטימיצין תערובת מעכבת לחלוטין את הנשימה המיטוכונדרית ומפחיתה את קצב צריכת החמצן לכמעט אפס. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להעריך את אחוז הפיצוצים המדגם כדי להבטיח כי הפרמטרים המטבוליים של לוקמיה רק נמדדים. בעת יישום שיטה זו, יש להחיל מיטוב זהיר על תנאי טיפוח ונורמליזציה של נתונים.
