שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי המנגנונים והאנרגטיות של הובלת חלבונים על פני קרום כלורופלסט, כמו גם את המיקום של חלבונים בתוך plastids. היתרון העיקרי של טכניקה זו עבור מיקוד חלבון thylakoid הוא שזה מאפשר שליטה מלאה של הסביבה של התילקואיד במהלך ההובלה, כולל טמפרטורה, pH, תנאים יוניים, ריכוזי מבשר. התחל על ידי השריית כ 55 גרם של אפונה ב 400 מיליליטר של מים מזוקקים במשך שלוש שעות.
זורעים את האפונה הספוגה במגש פלסטיק באדמה, מכוסים בשכבה דקה של ורמיקוליט, וגדלים במשך תשעה עד 15 ימים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. ביום של בידוד כלורופלסט, להכין שיפוע צפיפות רציפה על ידי צנטריפוגה תערובת של 15 מיליליטר של פרקול ו 15 מיליליטר של חיץ 2xGB ב 15 מיליליטר פוליקרבונט צינור צנטריפוגה במהירות גבוהה ב 30, 900 gs ברוטור זווית קבוע במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס עם הבלם כבוי. ואז לקצור כ 25 גרם של תשעה עד 15 יום יורה אפונה.
הוסיפו אותם למאגר 1xGB קר של 95 מיליליטר בבלנדר צונן, עם להבים מחודדים. ולהומוגניזציה. מסננים תערובת זו דרך מינימום של שתי שכבות של בד גבינה, להציב משפך על מקור צונן.
צנטריפוגה הסינון באמצעות צינור צנטריפוגה פוליקרבונט 15 מיליליטר ברוטור דלי מתנדנד ב 3, 000 גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את העל-טבעי ולהשתמש במברשת צבע כדי לעכל בעדינות את גלולת הכדור במיליליטר אחד של 1xGB. לאחר מכן השתמש פיפטה יציבת זכוכית בזהירות שכבת השעיית המסך על גבי מעבר צבע פרקול.
צנטריפוגה אותו רוטור דלי מתנדנד ב 8, 000 גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס עם הבלם כבוי. באמצעות פיפטה יציבה שוב בזהירות להעביר את הלהקה הירוקה התחתונה המכילה כלורופלסטים שלמים לתוך צינור פוליקרבונט טרי 50 מיליליטר ולהוסיף 30 מיליליטר של חיץ 1xIB. צנטריפוגה הצינור ברוטור דלי מתנדנד ב 1, 800 גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר השלכת supernatant, בעדינות resuspend את גלולה במיליליטר אחד של 1xIB עם מברשת צבע. לשטוף 30 מיליליטר של 1xIB וצנטריפוגה שוב באותם תנאים. תן מחדש את גלולה לאחר הצנטריפוגה הסופית במיליליטר אחד של 1xIB.
כדי לקבוע את ריכוז הכלורופיל, יש לערבב 10 מיקרוליטרים של כלורופלסטים המתווסכים במלואם עם חמישה מיליליטר של 80% אצטון. מסננים דרך נייר מסנן בעובי 180 מיקרומטר עם גודל נקבוביות של 11 מיקרומטר ולאחר מכן קובעים את ריכוז הכלורופיל לפי ספקטרופוטומטר. מדללים את תערובת הכלורופלסט למיליגרם אחד למיליליטר באמצעות 1xIB קר.
כדי להתחיל לבודד את thylakoids כאשר תמצית סטרומה אין צורך, כגון cpTat תחבורה, צנטריפוגה שלם chloroplasts ב 1.5 צינורות מיליליטר רוטור דלי מתנדנד ב 1, 000 gs בארבע מעלות צלזיוס במשך שש דקות. לאחר מכן, להשליך את supernatant ולתלות מחדש את גלולה במאגר תיזה היפוטונית כדי להשיג מיליגרם אחד למיליליטר עם micropipette. דגירה על קרח בחושך עם ערבוב מדי פעם במשך 10 דקות.
כדי לשחזר thylokoids, צנטריפוגה רוטור דלי מתנדנד ב 3, 200 gs בארבע מעלות צלזיוס במשך שמונה דקות. לשטוף את thylokoids פעמיים על ידי resuspending את גלולה עם אחד עד שני מיליליטר של חיץ תמוגה ולאחר מכן צנטריפוגה באותם תנאים. לאחר הצנטריפוגה הסופית, תן שימוש חוזר את גלולה, במיליליטר אחד של חיץ 1xIB ולקבוע את ריכוז כלורופיל thylokoids מבודד באמצעות ספקטרופוטומטר כפי שהוכח בעבר.
עבור מסלולים הדורשים התאוששות תמצית סטרומה כגון CPSec1 ו CPSRP eliquate 600 microliters של כלורופלסטים מבודדים רוטור דלי מתנדנד צנטריפוגה ב 1, 000 gs במשך שש דקות בארבע מעלות צלזיוס. עבור תזה כלורופלסט, אנו להשעות את גלולה עם 600 microliters של חיץ תזה היפוטונית. דגירה על קרח בחושך במשך 10 דקות עם ערבוב מדי פעם.
ואז צנטריפוגה הצינורות ברוטור דלי מתנדנד ב 3, 200 גרם במשך שמונה דקות בארבע מעלות צלזיוס. כדי להציל את הסטרומה, להעביר את ירוק בהיר על טבעי צהוב צינור מיקרו צנטריפוגה חדש ולהוסיף נפח שווה של חיץ סטרומל גולמי 2x. כדי לשטוף thylokoids, להוסיף שתי כמויות של חיץ תמוגה צנטריפוגה ב 3, 200 גרם במשך שמונה דקות בארבע מעלות צלזיוס.
השתמש מחדש את גלולה ב 1xIB כדי להשיג ריכוז כלורופיל של מיליגרם אחד למיליליטר ומניחים בצד על קרח לשימוש מאוחר יותר בהעברה. הסר שאריות קרום מסטרומה גולמית על ידי צנטריפוגה של סטרומה גולמית מדוללת ברוטור זווית קבוע ב 42, 000 gs במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן לאסוף 95% של נפח מכל צינור הקפד לא להפריע גלולה ירוקה צהובה קטנה, תוך שים גם את הנפח נלקח מכל צינור.
כדי להכין את תמצית סטרומה מרוכזת, בריכה supernatants שנאספו. לאחר מכן השתמש 4 מיליליטר 30 קילודלטון מולקולרית משקל חותך concentrator לרכז את תמצית חמש לקפל. כדי להתבצר התחבורה cpTat בצינור 1.5 מיליליטר על קרח לערבב את בלוטת התריס מבודד ריכוז כלורופיל הסופי של 0.33 מיליגרם למיליליטר, חמישה מילימולרים ATP מוכן 1xIB, ושמונה מילימולר DTT מוכן 1xIB.
כדי ליזום את ההובלה, להציג חלבון מצע לתערובת התחבורה. לנהל את התגובה על ידי הארת ההשעיה עם 80 עד 100 microeinsteins למ"ר לשנייה של קרינה פעילה פוטוסינתטית במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. כדי לעצור את תגובת התחבורה, לדלל את ההשעיה שמונה לקפל עם קרח קר 1xIB.
צנטריפוגה ב 3, 200 gs בצנטריפוגה מיקרו במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לשחזר בלוטת התריס. לאחר השלכת supernatant, resuspend את גלולה ב 120 microliters של קרח קר 1xIB. כדי להתבצר CPSec1 או PSRP מסלולים לערבב את הדברים הבאים בצינור 1.5 מיליליטר על קרח.
Thylakoids לריכוז כלורופיל סופי של 0.33 מיליגרם למיליליטר, 0.83 מיליגרם למיליליטר כלורופיל שווה ערך של תמצית סטרומה, וחמישה מילימולרים ATP מוכן 1xIB. מביאים את התגובה עד לנפח הרצוי עם קרח קר 1xIB ודגירה על קרח במשך 10 דקות. כדי ליזום את ההובלה להציג 10% נפח לפי נפח של חלבון מצע לתערובת תחבורה זו.
יש להאיר עם 80 עד 100 מיקרואינשטיין למ"ר לשנייה של קרינה פוטוסינתטית פעילה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. כדי לעצור את התגובה, לדלל את ההשעיה שמונה לקפל עם קרח קר 1xIB. צנטריפוגה ב 3, 200gs בצנטריפוגה מיקרו במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר השלכת supernatant, resuspend את גלולה ב 120 microliters של קרח קר 1xIB. כדי להסיר מצע שיורית שלא הועבר, לעכל חלבון חיצוני על ידי הוספת שישה microliters של שני מיליגרם לכל תרמוליצין מיליליטר ו 10 מילימולאר סידן כלורי ב 1xIB. דגירה זו תגובת פרוטאז על קרח במשך 40 דקות.
יש להנמיך את הפרוטאז על ידי הכפלת הנפח ב-25 מילימולרים של EDTA ב-1xIB. צנטריפוגה ב 3, 200 gs בצנטריפוגה מיקרו במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לשחזר בלוטת התריס. לאחר הסרת supernatant, resuspend התאושש thylokoids ב 120 microliters של חמישה milimolar EDTA ב 1xIB, ולהעביר צינור חדש 1.5 מיליליטר.
לאחר צנטריפוגה שוב ב 3, 200 gs במיקרו צנטריפוגה במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, להשליך את supernatant ולתלות מחדש את גלולה בנפח המתאים של חיץ מדגם laemmli, בתוספת 10 מילימולר EDTA. מניחים את הדגימות באמבט מים רותחים במשך 10 דקות. המשך לנתח את הדוגמאות לפי דף SDS.
הובלת חלבון iOE17 דרך מסלול cpTat הביאה לשינוי גודל של שניים עד שלושה קילודלטונים בין המצע שהוצג לבין הצורה המעובדת הבוגרת. הסיבה לכך היא מחשוף של פפטיד אות n מסוף המציין תחבורה מוצלחת cpTat. טיפול תרמוליסין משאיר רק את הלהקה הבוגרת מועברת בהצלחה ולכן proteus עמיד.
הובלת מבשר OE33 דרך מסלול CPSec1, הביאה לשינוי גודל במצע הבוגר, והגנה פרוטאוס של המצע שהועבר. החדרת מבשר LHCP לתוך קרום בלוטת התריס דרך מסלול cpSRP, מוערך באמצעות עיכול תרמוליצין הוביל לשינוי גודל של 1.5 עד שני קילודלטון. זה הצביע על החדרת קרום מוצלחת, כמו הממברנה מגן הדוד של מוצר השפלה LHCP בוגרת מפני פרוטאוליזה מלאה.
לאחר צפייה בסרטון זה אתה צריך הבנה טובה של איך לבודד thylokoids ו tranportivity assay דרך cpTat תלוי אנרגיה, cpSec 1 ו cpSRP מסלולים. לאחר השליטה בטכניקה זו ניתן לעשות זאת בשלוש עד ארבע שעות כאשר מבוצע כראוי. אמנם לא מאויר בסרטון זה אנחנו בדרך כלל לשמור את האורות תקורה במעבדה בעת בידוד ועובד עם כלורופלסטית פעיל פוטוסינתטית thylakoids.
בעת ניסיון הליך זה חשוב לשמור על כלורופלסט ותילקלואידים מבודדים בארבע מעלות צלזיוס. זכור לעכל מחדש כלורופלסטים בעדינות בהתחלה. הימנעו מלהפריע לשיפוע הפרוקול לאחר שלב הצנטריפוציה הראשון.
בנוסף, ניתן להכין דגימת קלט באחוזים במקביל לתגובות התחבורה ולהפעיל על אותו ג'ל כדי להעריך את הובלת המצע. אל תשכח, כי עבודה עם מצעים רדיואקטיביים דורש טיפול מצפוני PPE הנכון. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מיקוד החלבון לחקור את האנרגטיות, הקינטיקה והמנגנונים הייחודיים השולטים בהובלת חלבונים על פני ממברנות תילאקואידיות.
