שיטה זו מספקת גישה חדשה לטיפול בשאלות מפתח בתחום מחקר כלי הדם הריאתי, כגון הנתיב המולקולרי של מנגנונים של התפשטות אטימלית ביתר לחץ דם ריאתי. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא מספקת ביופסיה תאית דקה של אנדותל כלי הדם ריאתי ללא סיכון נוסף למטופל. הדגימה של ההליך תהיה מיס ריינה פרז, המתאמת הקלינית שלנו, וד"ר פיליפ גאלו, מנהל המעבדה שלי.
לאחר הקטטר הוא נסוג מן נדן, מיד לטבול אותו צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר המכיל 40 מיליליטר של מלוחים סטריליים מצוננים. מערבל את הקטטר מספר פעמים כדי להסיר כל דם, ולשטוף את הקו במידת הצורך כדי להסיר את הדם שנשמר בתוכו. חותכים את הדיסטלי חמישה סנטימטרים של קצה הקטטר, ולאפשר לו ליפול לתוך צינור הצנטריפוגה.
השתמש מדפים כדי להסיר מיד את הקצה, ולהעביר אותו צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר המכיל 15 מיליליטר של מדיום צמיחת תא אנדותל. לאחר מכן, לאטום את הצינור. שים את הצינור על קרח, ולהעביר אותו למעבדה.
או לעבד את המדגם באופן מיידי או לארוז את המדגם על קרח רטוב למשלוח לילה למעבדה שבה העיבוד יתרחש. זה קריטי כי הבלון נשאר שקוע במדיום. אז לוודא שיש שטח ראש מינימלי בצינור 15 מ"ל על ידי מילוי זה לחלוטין עם מדיום צמיחת תא אנדותל.
ראשית, להוסיף חמישה מיליליטר של פתרון ניתוק תאים לצינור צנטריפוגה נקי 15 מיליליטר. שים את הצינור הזה על קרח. באמצעות מזרק מיליליטר אחד, לצייר מיליליטר אחד של מדיה תא אנדותל ממה שנשאר בצינור איסוף ליד המיטה.
בזהירות להכניס את המחט של מזרק מיליליטר אחד לתוך החור הלבן מול חוט המדריך. מניחים את קצה הקטטר לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר המכיל את פתרון ניתוק התא. לנפח את הבלון עם כ 200 microliters של מדיה, נזהר לא לפוצץ אותו.
מניחים את הצינור על קרח, ולתת קטטר לשבת בתסכול ניתוק התא במשך חמש דקות עם הבלון מנופח. לאחר מכן, יוצקים את תכולת הצינור לתוך צלחת 100 מילימטר, לוודא כי הבלון ממוקם בשלולית זו של פתרון ניתוק התא. באמצעות מגרד תאים, לגרד את הבלון המנופח, להתמקד בקטבים של הבלון שבו הוא פוגש את הקטטר.
לאחר מכן, ודא שמגרד התאים יוצר קשר עם כל פני השטח של הבלון לפחות פעמיים, ושטף מעת לעת את מגרד התאים בפתרון ניתוק התא. לנפח את הבלון ולגרד אותו עם תנועת צחצוח. ואז לשטוף את מגרד התא בשלולית של פתרון ניתוק התא.
השלך את קצה הקטטר, המחט ומגרד התאים למיכל פסולת מתאים. יוצקים את פתרון ניתוק התא המכיל את קציר התא לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר. לנער את צינור האיסוף, ויוצקים את המדיה הנותרת ממנו לתוך המדגם שנאסף גם כן.
צנטריפוגה המדגם ב 650 פעמים G, וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. שאף את התקשורת, נזהר לא להפריע או לשוגם את גלולה. תעבירו את גלולה במיליליטר אחד של תספוס תמוגה של תאי דם אדומים מצוננים, והעברו את המתלה הזה לצינור צנטריפוגה של 1.5 מיקרוליטר, וטלטלו בעדינות את הצינור בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
צנטריפוגה הצינור ב 500 פעמים G, וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. ואז שאף את פתרון תותבת תאי הדם האדומים. תן שימוש חוזר לכדור בתתכונה המכילה PBS, חוסם FcR ומיקרוביאדות CD-146 אנטי-אנושיות.
דגירה בארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. מוסיפים מיליליטר אחד של PBS מצונן. צנטריפוגה ב 500 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
שאפו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את גלולת הכדור במיליליטר אחד של PBS מצונן. לאחר מכן, מניחים עמוד LS מגנטי על מתלה מגנטי בטמפרטורת החדר. הקף את העמודה לכותרות על-ידי הוספת מיליליטר אחד של PBS, ומתן אפשרות לאמצעי האחסון כולו לזרום דרכה.
השלך את הזרימה דרך. טען את הדגימה בעמודה המגנטית ומחק את הזרימה. לשטוף את הטור שלוש פעמים באמצעות שלושה מיליליטר של PBS מקורר עבור כל לשטוף.
השלך את כל הזרימה הזו. לאחר מכן הוסיפו שלושה מיליליטר של PBS מצונן לצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר. מוציאים את עמוד המגנט מהמדף ויוצקים את ה-PBS מהצינור לתוך העמוד.
הנח במהירות את העמוד לתוך צינור הצנטריפוגה כדי לתפוס את הזרימה דרך. מיד לצלול עם הבוכנה המסופקת עם העמוד. המדגם מטוהר כעת ומוכן קיבעון, כתמים או תרבות.
במחקר זה, התאים מטוהרים מטיפים לצנתור ברבור-גנץ לאחר צנתור לב ימין. תאים אלה נקשרים לעמודת בחירה של CD-146, ויש להם פרופילי פיזור קדימה וצד שאינם ניתנים להבחנה מתאי אנדותל עורק ריאתי ראשוניים מתורבתים. מכיוון שבלון הקטטר נמצא רק במגע פיזי עם נדן המבוא, קיר כלי הדם הריאה והדם, והתאים מוכחים כבלתי נגזרים מהדם, ההנחה היא שהם נגזרו מקיר כלי הדם הריאה.
בעקבות ההליך תאים שנקטפו ניתן לנתח על ידי מגוון רחב של שיטות, כגון cytometry זרימה, qPCR, רצף, פרוטאומיקס. תפוקת התאים נמוכה מדי עבור כתם מערבי קונבנציונלי, אך ניתן לשקול מתודולוגיות סופגות קלט נמוכות. תאים יכולים להיות מתורבתים, אבל זה מאוד קשה, וזה לא תמיד מצליח בידיים שלנו.
אם יש לנסות את התרבות, חשוב למזער את המרווח בין איסוף קצה הצנתור מהמטופל, לבין שלבי הטיהור וציפוי הסופיים, ובטח שהדגימה נשמרת קרה לאורך כל שלבי הטיפול של השיטה. אל תשכח שהפרוטוקול הזה כרוך בעבודה עם דם ורקמות אנושיים. יש לשמור על אמצעי זהירות אוניברסליים.
בפרט, יש צעד מוקדם בפרוטוקול שכולל החדרת מחט חדה לקצה החתך של קצה הקטטר אשר מזוהם בדם של המטופל. לעולם אל תשכח כי קצה קטטר חייב להיות מוחזק עם hemostats במהלך שלב זה, לא עם האצבעות שלך, על מנת למנוע את הסיכון של מקל מחט.
