Este método proporciona un nuevo enfoque para abordar cuestiones clave en el campo de la investigación vascular pulmonar, como la trayectoria molecular de los mecanismos de proliferación intimal en la hipertensión pulmonar. La principal ventaja de este método es que proporciona una biopsia celular minucioso del endotelio vascular pulmonar sin riesgo adicional para el paciente. Demostrando el procedimiento estarán la Señorita Reina Pérez, nuestra Coordinadora Clínica, y el Dr. Phillip Gallo, el gerente de mi laboratorio.
Después de retirar el catéter de la vaina, sumérgelo inmediatamente en un tubo centrífugo de 50 mililitros que contenga 40 mililitros de solución salina estéril refrigerada. Gire el catéter varias veces para extraer la sangre y enjuague la línea si es necesario para extraer la sangre retenida dentro de ella. Corte el distal cinco centímetros de la punta del catéter y permita que caiga en el tubo de la centrífuga.
Utilice fórceps para extraer inmediatamente la punta y transfiérela a un tubo centrífugo de 15 mililitros que contenga 15 mililitros de medio de crecimiento celular endotelial. A continuación, selle el tubo. Coloque el tubo sobre hielo y transfiételo al laboratorio.
O bien procese la muestra inmediatamente o empaquete la muestra sobre hielo húmedo para su envío nocturno al laboratorio donde se producirá el procesamiento. Es fundamental que el globo permanezca sumergido en el medio. Así que asegúrese de que haya un espacio mínimo para la cabeza en el tubo de 15 ml llenándolo completamente con un medio de crecimiento celular endotelial.
En primer lugar, agregue cinco mililitros de solución de desprendimiento celular a un tubo de centrífuga limpio de 15 mililitros. Coloque este tubo sobre hielo. Con una jeringa de un mililitro, extraiga un mililitro de medios celulares endoteliales de lo que queda en el tubo de recogida del lado de la cama.
Inserte cuidadosamente la aguja de la jeringa de un mililitro en el orificio blanco opuesto al cable guía. Coloque la punta del catéter en el tubo centrífugo de 15 mililitros que contiene la solución de desprendimiento celular. Inflar el globo con aproximadamente 200 microlitros de medios, teniendo cuidado de no reventarlo.
Coloque el tubo sobre hielo y deje que el catéter se siente en la solución de desprendimiento de la célula durante cinco minutos con el globo inflado. Después de esto, verter el contenido del tubo en un plato de 100 milímetros, asegurándose de que el globo se coloca en este charco de solución de desprendimiento celular. Usando un rascador celular, raspa el globo inflado, concéntrate en los polos del globo donde se encuentra con el catéter.
A continuación, asegúrese de que el rascador de células entre en contacto con toda la superficie del globo al menos dos veces y enjuague periódicamente el rascador de células en la solución de desprendimiento de células. Desinflar el globo y rasparlo con un movimiento de cepillado. A continuación, enjuague el rascador de células en el charco de la solución de desprendimiento celular.
Deseche la punta del catéter, la aguja y el rascador de células en un contenedor de residuos apropiado. Vierta la solución de desprendimiento celular que contiene la cosecha celular en un tubo centrífugo de 50 mililitros. Agitar el tubo de recogida, y verter el medio restante de él en la muestra recogida, así.
Centrifugar la muestra a 650 veces G, y cuatro grados celsius durante 10 minutos. Aspirar los medios, teniendo cuidado de no molestar o aspirar el pellet. Resuspender el pellet en un mililitro de solución de lysis de glóbulos rojos refrigerados, y transferir esta suspensión a un tubo centrífugo de 1,5 microlitros, y balancear suavemente el tubo a cuatro grados centígrados durante 10 minutos.
Centrifugar el tubo a 500 veces G, y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, aspirar la solución de lysis de glóbulos rojos. Resuspender el pellet en una solución que contenga PBS, bloqueador fcR y microperas antihumanas CD-146.
Incubar a cuatro grados centígrados durante 15 minutos. Añadir un mililitro de PBS refrigerado. Centrifugar a 500 veces G y cuatro grados centígrados durante cinco minutos.
Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en un mililitro de PBS refrigerado. A continuación, coloque una columna LS magnética en un bastidor magnético a temperatura ambiente. Prepara la columna agregando un mililitro de PBS y permitiendo que todo el volumen fluya a través.
Deseche el flujo a través. Cargue la muestra en la columna magnética y deseche el flujo a través. Lave la columna tres veces con tres mililitros de PBS refrigerado para cada lavado.
Deseche todo este flujo a través. A continuación, agregue tres mililitros de PBS refrigerado a un tubo centrífugo de 15 mililitros. Retire la columna del imán del bastidor y vierta el PBS del tubo en la columna.
Coloque rápidamente la columna en el tubo de centrífuga para atrapar el flujo a través. Sumerja inmediatamente con el émbolo suministrado con la columna. La muestra ahora está purificada y lista para la fijación, la tinción o el cultivo.
En este estudio, las células se purifican a partir de las puntas del catéter Swan-Ganz después del cateterismo cardíaco derecho. Estas células se unen a una columna de selección cd-146, y tienen perfiles de dispersión hacia adelante y lateral que son indistinguibles de las células endoteliales primarias de la arteria pulmonar humana cultivadas. Como el globo del catéter sólo está en contacto físico con la vaina del introductor, la pared del vaso arterial pulmonar y la sangre, y se ha demostrado que las células no derivan de la sangre, se supone que derivan de la pared del vaso de la arteria pulmonar.
Después del procedimiento, las células cosechadas pueden ser analizadas por una variedad de métodos, tales como citometría de flujo, qPCR, secuenciación y proteomix. Los rendimientos celulares son demasiado bajos para la mancha occidental convencional, pero podrían considerarse metodologías de hinchazón de entrada baja. Las células se pueden cultivar, pero esto es muy difícil, y no siempre tiene éxito en nuestras manos.
Si se va a intentar el cultivo, es importante minimizar el intervalo entre la recolección de la punta de cato del paciente, y los pasos finales de purificación y chapado, y asegurar que la muestra se mantenga fría durante todos los pasos de manejo del método. No olvide que este protocolo implica trabajar con sangre y tejidos humanos. Deben observarse las precauciones universales.
En particular, hay un paso temprano en el protocolo que implica insertar una aguja afilada en el extremo de corte de la punta del catéter que está contaminada con la sangre del paciente. Nunca olvide que la punta del catéter debe mantenerse con hemostats durante este paso, no con los dedos, con el fin de evitar el riesgo de un pinchazo de aguja.
