שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתגובה miRNA ליכולת להדגיש שתלים צמחיים כגון איך miRNA מוסדרים תחת לחץ קר שתלי דעת בקבוק אבטיח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי היא שיטה יעילה מאוד לשחזור לעשות הומו הטרוגרפטים. זה לא דורש ציוד ספציפי, זה קל מאוד לבצע, ובדרך כלל תוצאות שיעור הישרדות גבוה מאוד של השתלה.
באמצעות שיטה זו, יכול לספק תובנה לתוך תגובת miRNA ללחץ קר במערכת שתלי הדם בקבוק אבטיח. זה יכול להיות מיושם גם על אורגניזמים מודרניים אחרים לחשיפת המנגנונים של תחבורה miRNA מקומית למרחקים ארוכים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כמו שלבי השתלה קשה ללמוד.
שלב זה דרש מיומנויות מתקדמות והם המפתח להישרדותם של הצמחים המושתלים. כדי להתחיל, להשרות זרעי דלעת בקבוק ב 500 מיליליטר מקור של 58 מעלות צלזיוס מים. מערבבים את הזרעים מדי פעם עד טמפרטורת המים יורדת ל 40 מעלות צלזיוס.
בזמן שהמים מתקררים, מכניסים שלושה קילוגרמים של אדמת כבול לשקית ניילון ומקלים אותה באופן אוטומטי. ברגע שהמים מגיעים לטמפרטורת החדר, שוטפים את הזרעים פעמיים עד שלוש פעמים במים מזוקקים ומנקזים את המים העודפים. אפשר לזרעים לנבוט בשקית גזה ב 28 מעלות צלזיוס בתא הצמיחה הכהה.
לאחר הנביטה, לזרוע את הזרעים לתוך סירי פלסטיק מלא באדמת כבול מעקר. כאשר שתילי דלעת הבקבוק לפתח שני cotyledons שטוח, לחזור על תהליך זה עם זרעי אבטיח. לגדל את דליע הבקבוק שתילי אבטיח בתא צמיחה.
מוסיפים מים השתילים פעם ביום אחר הצהריים. לאחר מכן, חותכים את ההיפוקוטילים של שתילי האבטיח שניים עד שלושה סנטימטרים מתחת לקוטילדון. חותכים את החלק העליון של שתילי דלעות הבקבוק בצד, מיד מעל הקוטילדונים.
לאחר מכן השתמש בקיסם כדי לעשות חור בחלק העליון של שתילי דליע בקבוק גזוז. הכנס את שתילי האבטיח הגזוזים לתוך החור כדי להפוך את הטרוגרפטים. לאחר מכן, להכין הומוגרפטים באמצעות השיטה שתוארה קודם לכן.
ראשית, לעטוף את השתילים מושתלים בשקיות פוליאתילן שקופות כדי לשמור על לחות גבוהה יחסית. לאחר מכן לשמור על שתילים עטופים בתא צמיחה במשך שבעה ימים. לאחר היום השביעי, להסיר את השקיות ולאפשר לצמחים לגדול באותם תנאים במשך שבעה עד 10 ימים.
מחלקים את השתילים לשתי קבוצות, אחת לטיפולים קרים והן לשליטה. להחזיר את שתילי הבקרה לאותם תנאים סביבתיים. מניחים את השתילים המטופלים בקור בתא גדילה שנקבע לשש מעלות צלזיוס עם אותם תנאים כהים בהירים כמו קבוצת הביקורת.
לאחר 48 שעות, להשאיר את הדגימות של scion ו rootstocks מן השתלים. להקפיא את הדגימות מיד בחנקן נוזלי ולאחסן אותם במינוס 70 מעלות צלזיוס. מעבירים את הדגימה הקפואה לצינור מיקרוצנטריפוגה של שני מיליליטר בחנקן נוזלי.
מוסיפים חרוז נירוסטה לכל צינור מדגם ומדגימים את הרקמות לאבקה דקה. עבור כל שילוב השתלה, לקחת כמויות שוות של מדגם הקרקע מ 10 שתילים ומערבבים אותם בצינור צנטריפוגה 10 מיליליטר. הוסף כמות מתאימה של גואנידיום הידרוכלוריד רגנט.
לאחר מכן, מוסיפים DNase ללא RNA 1 עד 150 יחידות למיליליטר ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר מכן לקבוע את כמות RNA הכוללת על מערכת אלקטרופורזה מיקרו-קפילארית. לאחר מכן, הפשר את רייגנטים ומתאמים לנורמליזציה של הספרייה.
לאחר מכן ligate RNase קטן עם חמישה מתאמים ראשוניים ושלושה עיקריים, ולחמק ולטהר אותם. הפוך לתמלל את חמש ראשי ושלושה RNase קטן מגרתיים מגרתיים בעקבות הנחיות היצרן. לאחר מכן, בצע הגברה של PCR בהתאם לפרוטוקול היצרן.
לאחר מכן השתמש במערכת האלקטרופורזה המיקרו-קילרית כדי להבטיח שמספר תקינות ה-RNA גדול משבע. טען מיקרוליטר אחד של ספריית RNA במערכת האלקטרופורזה המיקרו-קפילרית כדי להבטיח שמספר תקינות ה-RNA גדול משבע. לבסוף, רצף ספריות RNA קטנות על מכשיר ריצוף תפוקה גבוהה.
באמצעות פרוטוקול זה, שיעור הישרדות של 98% עבור השתלה ואת פנוטיפים עבור טמפרטורת החדר ותנאי מתח קר הושגו. sRNAs של 24 נוקלאוטידים היוו את המחלקה הגדולה ביותר של sRNAs בכל שילוב השתלות, ללא קשר לטיפול בטמפרטורה. לאחר 48 שעות של טיפול קר, 30 ו 268 microRNAs היו למעלה ולמטה מוסדר, בהתאמה.
בעלים של scion בהטרוגרפטים, לעומת זאת, בעלים של rootstock, 31 ו 12 microRNAs היו למעלה ולמטה מוסדר, בהתאמה. בהומוגרפטים אבטיח אבטיח, 64 ו 83 microRNAs היו למעלה ולמטה מוסדר, בהתאמה. זה הראה כי הטרוגרפטינג גרם לתכנות מחדש עמוק של ביטויי microRNA.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור את הגודל והגיל היחסיים של גבעול הבת ואת scion הוא קריטי להכנת שתל מוצלח. בעקבות הליך זה, שיטות אחרות כמו רצף lncRNA, פרופיל proteomic יכול להתבצע על מנת לחקור את הרגולציה של lncRNA וחלבון ואת מערכת הקידוד במערכת השתלה. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך למחקר בתחום הסובלנות abiotic הצמח לחקור את המנגנון של יתרון השתלת צמחים Cucurbitaceae ומעבר.
אל תשכח כי עבודה עם guanidine הידרוכלוריד יכול להיות מסוכן מאוד אמצעי זהירות מתאים תמיד יש לנקוט עם ביצוע הליך זה.
