يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في استجابة ميرنا لقدرة على الإجهاد في الطعوم النباتية مثل كيفية تنظيم ميرنا تحت الضغط البارد في طعوم زجاجة البطيخ. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه من طريقة فعالة للغاية وقابلة للتكرار لجعل الهومو و غير المتغايرة. فإنه لا يتطلب أي معدات محددة، فمن السهل جدا لأداء، وعادة ما يؤدي إلى معدل البقاء على قيد الحياة عالية جدا من التطعيم.
من خلال هذه الطريقة، يمكن أن توفر نظرة ثاقبة استجابة ميرنا للإجهاد البارد في نظام الكسب غير المشروع زجاجة البطيخ. ويمكن أيضا أن تطبق على الكائنات الحية الحديثة الأخرى للكشف عن آليات النقل ميرنا المحلية والبعيدة المسافة. العرض التوضيحي المرئي لهذا الأسلوب أمر بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم خطوات التطعيم.
هذه الخطوة تتطلب مهارات متقدمة وهي مفتاح البقاء على قيد الحياة من النباتات المطعمة. للبدء، نقع بذور القرع زجاجة في منقار 500 ملليلتر من 58 درجة مئوية من الماء. يُحرّك البذور أحيانًا حتى تنخفض درجة حرارة الماء إلى 40 درجة مئوية.
بينما يبرد الماء، وضع ثلاثة كيلوغرامات من التربة الخث في كيس النايلون و أوتلاف ذلك. بمجرد أن يصل الماء إلى درجة حرارة الغرفة ، شطف البذور مرتين إلى ثلاث مرات في الماء المقطر واستنزاف المياه الزائدة. السماح للبذور لتنبت في كيس الشاش في 28 درجة مئوية في غرفة النمو المظلمة.
بعد الإنبات ، زرع البذور في الأواني البلاستيكية المملوءة بتربة الخث المعقمة. عندما شتلات القرع زجاجة تطوير اثنين كوتيلدونات بالارض، كرر هذه العملية مع بذور البطيخ. تنمو زجاجة القرع وشتلات البطيخ في غرفة النمو.
يضاف الماء إلى الشتلات مرة واحدة في اليوم في فترة ما بعد الظهر. بعد ذلك ، قطع hypocotyls من شتلات البطيخ 2-3 سم تحت كوتيلدون. قطع الجزء العلوي من شتلات القرع زجاجة في الجانب، مباشرة فوق كوتيلمدون.
ثم استخدام مسواك لجعل ثقب في الجزء العلوي من شتلات زجاجة قلص القرع. إدراج شتلات البطيخ قلصت في حفرة لجعل heterografts. بعد ذلك، إعداد homografts باستخدام الأسلوب الموصوفة مسبقاً.
أولاً، لف الشتلات المطعمة في أكياس البولي إيثيلين الشفافة للحفاظ على رطوبة عالية نسبيًا. ثم الحفاظ على الشتلات ملفوفة في غرفة النمو لمدة سبعة أيام. بعد اليوم السابع، قم بإزالة الحقائب والسماح للنباتات بالنمو في ظل نفس الظروف لمدة سبعة إلى 10 أيام.
تقسيم الشتلات إلى مجموعتين، واحدة لعلاجات البرد والأخرى للسيطرة. إعادة شتلات التحكم إلى نفس الظروف البيئية. وضع الشتلات المعالجة الباردة في غرفة النمو تعيين إلى ست درجات مئوية مع نفس الظروف المظلمة الخفيفة كمجموعة التحكم.
بعد 48 ساعة ، اترك عينات من scion و rootstocks من الطعوم. تجميد العينات على الفور في النيتروجين السائل وتخزينها في ناقص 70 درجة مئوية. نقل العينة المجمدة إلى أنبوب ميكروسنتروجي ملليلتر اثنين في النيتروجين السائل.
إضافة حبة الفولاذ المقاوم للصدأ إلى كل أنبوب عينة وتجانس الأنسجة إلى مسحوق ناعم. لكل تركيبة تطعيم، تأخذ كميات متساوية من العينة الأرض من 10 شتلات وخلطها في أنبوب الطرد المركزي 10 ملليلتر. إضافة كمية مناسبة من مبيد هيدروكلوريد غاانيديوم.
بعد ذلك، أضف DNase خالية من الحمض النووي الريبي واحد إلى 150 وحدة لكل ملليلتر في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم تحديد إجمالي كمية الحمض النووي الريبي على نظام الكهرباء والكابري. بعد ذلك، ذاب المكتبة التطبيع الكواشف والمحولات.
ثم ligate RNase الصغيرة مع خمسة رئيس الوزراء وثلاثة محولات رئيس الوزراء، و elute وتنقية لهم. عكس نسخ خمسة رئيس الوزراء وثلاثة رئيس RNase صغيرة ligated التالية المبادئ التوجيهية للشركة المصنعة. بعد ذلك، قم بإجراء تضخيم PCR بعد بروتوكول الشركة المصنعة.
ثم استخدم نظام الكهرباء الدقيقة لضمان أن عدد النزاهة RNA أكبر من سبعة. قم بتحميل ميكرولتر واحد من مكتبة RNA على نظام الكهرباء الكابري الصغير لضمان أن عدد سلامة الحمض النووي الريبي أكبر من سبعة. وأخيراً، تسلسل مكتبات RNA الصغيرة على أداة تسلسل عالية الإنتاجية.
باستخدام هذا البروتوكول، تم الحصول على معدل البقاء على قيد الحياة 98٪ لالطعيم والأنماط الظاهرية لدرجة حرارة الغرفة وظروف الإجهاد البارد. sRNAs من 24 النيوكليوتيدات تشكل أكبر فئة من SRNAs في جميع الجمع تطعيم، بغض النظر عن العلاج درجة الحرارة. بعد 48 ساعة من العلاج البارد ، تم تنظيم 30 و 268 microRNAs ، على التوالي.
في أوراق scion في غير المتغايرة ، على العكس من ذلك ، في أوراق الجذر ، كانت 31 و 12 microRNAs أعلى لأسفل ، على التوالي. في البطيخ البطيخ هومجراففت، 64 و 83 microRNAs كانت أعلى و أسفل المنظمة، على التوالي. وهذا ما أثبت أن التغاير تسبب في إعادة برمجة عميقة لتعابير ميكرورنا.
أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن نتذكر الحجم والعمر النسبيين لسيقان الابنة ، ويعتبر ابن الطفل أمرًا حاسمًا لصنع الكسب غير المشروع الناجح. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل تسلسل اللانكارا، التنميط البروتيومي من أجل التحقيق في تنظيم اللانكرنا والبروتين ونظام الترميز في نظام التطعيم. بعد تطورها، مهدت هذه التقنية الطريق للبحث في مجال تحمل النباتات اللاأحيائية لاستكشاف آلية ميزة تطعيم النباتات في كوكوربيتاسي وخارجها.
لا ننسى أن العمل مع هيدروكلوريد guanidine يمكن أن تكون خطرة للغاية وينبغي دائما اتخاذ الاحتياطات المناسبة مع تنفيذ هذا الإجراء.
