עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01 EB014869.

1. מכינים את התאים עבור הדמיה
הערה: החללית כוח ישיר ( DFP) יכול לשמש עבור כל סוג התא חסיד. כאן, NIH 3T3 העכבר fibroblasts משמשים את שורת התאים מודל עבור פרוטוקול זה.
<ol><li>תאי פיברובלסט 3T3 תרבות NIH בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco) בתוספת 10% התורם שור סרום ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין על 35 מ מ זכוכית התחתונה מגישים עד confluency הרצוי. לשמור על תאים-CO 37 ° C ו-5%2.<ol>
<li>הקפד מעיל כל המנות התחתון 35 מ מ זכוכית עם 5 µg/mL fibronectin (או חלבון ה-ECM דומה), לפני זריעה NIH 3T3 תאים עבור הדמיה. הערה: התאים יש מלא למרוח, חסיד על המנה לניסוי. אין אילוצי במונחים של confluency עבור שיטת  DFP לעבודה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מיד לפני הניסוי, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS ולאחריה שטיפה אחת עם מדיום הגידול מלאה.</li>
	<li>להוסיף 3 מ"ל של מדיום הגידול מלאה המנה קרקעית זכוכית.</li>
</ol>2. מיקרוסקופ ורכישת תמונות
הערה: הפוכה פלורסצנטיות מיקרוסקופ (או שווה ערך) עם micromanipulator מותקן לזרוע בצד, על פי ההמלצות של היצרן. המיקרוסקופ צריך להיות מאובזר גם עם חדר סביבתיים לשמירה על הטמפרטורה ב 37 מעלות צלזיוס ורמת CO2 ב-5%. נדרש גם micromanipulator עם microinjector מחובר המיקרוסקופ. טבילה שמן x 40 / 1.3 נה או 60 x / 1.49 NA (או מטרות שוות ערך) מומלץ לקבל הניסויים. המיקרוסקופ צריך להיות מותקן על שולחן בידוד רטט.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58038/58038fig1.jpg"> איור 1 . דפורמציה גרעיני ומיקוד מיקרוסקופ א דפורמציה מקסימלית גרעיני ורגיעה של דפורמציה גרעינית. לפני חישוב דפורמציה מקסימלית גרעינית, הקצוות האחורי של צורות גרעיני היו קודם בד בבד לתקן את התרגום של גרעין מעוותים. הצורה של הגרעין ברגע של ניתוק עצה micropipette ומצופה על-גבי צורת הגרעין הראשוני לפני שנעלם. ההבדל באזור בין שתי הצורות נמדדה כ Δ1. להרכב גרעיני מרבי מוגדר כδA1 מחולק באזור הגרעין המקורי. באופן דומה, פרמטר השני, ΔA2, עשויה להיות מוגדרת על-ידי השלכת צורת הגרעין מצב יציב הסופי לאחר ניתוק micropipette על-גבי צורת הגרעין המקורי. B. למקד את התא-A המטוס ולאחר מכן הזז את מטוס מוקד עד המטוס B כדי למצוא את הטיפ micropipette. במהלך דימות, micropipette היה לתרגם את הזכות (כיוון החץ הכתום). איור זה השתנה מ קיראן ואח. 15. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58038/58038fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<ol><li>הפעל את microinjector לכל הפרוטוקול של היצרן.</li>
	<li>בעזרת טפטפת שמן של טבילה, להחיל טיפת שמן טבילה על גבי העדשה אובייקטיבי.</li>
	<li>תהדק את המנה בחוזקה לתוך בעל צלחת וטען בעל צלחת לבמה. הערה: התאים חייב להישמר-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 לאורך כל הניסוי.</li>
	<li>להתאים את גובה המטרה להביא את התאים אל המוקד (A המטוס, איור 1B).</li>
	<li>הזז את הבמה מיקרוסקופ כדי למצוא תא עניין.</li>
	<li>לסובב את מוט ההיגוי על micromanipulator כדי לעבור על בעל pipet המיקום העליון. טען את micropipette עצה בקוטר 0.5 מיקרומטר על בעל pipet.<ol>
<li>כדי למנוע הידבקות תאים כדי micropipette, מראש לפנק את הטיפ micropipette עם 0.3 מ"ג/מ"ל PLL-g-יתד פתרון עבור 1 h בטמפרטורת החדר. מבחן הדבקה על ידי נגיעה את micropipette את הגרעין וללא לחץ היניקה, ולאחר מכן תרגום של micropipette הרחק מהגרעין. העדר אדהזיה וריחו מורגש חוסר מוחלט דפורמציה גרעיני ותרגום. הערה: אנא עקוב אחר ייצור הצעות כדי לפתוח את החבילה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להעלות את המטוס מוקד אובייקטיבית מעל המטוס A והעליונה של התא על מטוס B על ידי התאמת הפקד בסדר (איור 1B, ראה שלב 2.4).</li>
	<li>הגדר את micromanipulator מחוספס בפקד. לאט לאט להביא את micropipette אל המטוס B על ידי צופה על הצללית של micropipette, עד micropipette מגיע באופן מלא אל המוקד.</li>
	<li>לאחר קצה micropipette בפוקוס, הגדר את micromanipulator שליטה טובה .</li>
	<li>להוריד את המטרה קו המשווה של התא (א המטוס, איור 1B) ולהוריד את micropipette בסביבות 15 מיקרומטר מעל המטוס א (איור 1B, micropipette מקווקו).</li>
	<li>להגדיר את הלחץ פיצוי (P.c) microinjector ללחץ הרצוי; המתן מספר שניות עד הלחץ עד שהוא יתייצב. הערה: שנקבעה מראש הלחץ האופטימלי תלוי סוג התא והן את מטרותיה של הניסוי. ברוב המקרים, 300 hPa יהיה נקודת התחלה טובה.</li>
	<li>ודא כי micropipette זה לא סתם באמצעות ההגדרה נקיים בלוח micromanipulator ו בודק כדי לוודא בועות אוויר מגיחים הטיפ micropipette.</li>
	<li>הכנס את הטיפ לתוך התא על-ידי הנמכת בהדרגה את micropipette עד הטיפ נוגעת בקלילות על פני הגרעין. הערה: כאשר מורידים את micropipette, הצללית של קצה micropipette יתבהר כפי שהוא מגיע אל המוקד. לפני micropipette נוגע הגרעין, להעלות את המוקד אובייקטיבית, ליישר את הטיפ micropipette עם גרעין (באותו x-y רביע, z-מישור גבוה יותר). להחזיר את הפוקוס בחזרה קו המשווה של הגרעין (A המטוס, איור 1B) ולהוריד בהדרגה את הטיפ micropipette.</li>
	<li>ליצור חותם בין קצה micropipette את קרום גרעיני על ידי ניתוק הצינור אספקת לחץ מן המערכת microinjection, ובכך פותח בסוף הצינור micropipette לאווירה. שלב זה יוצר לחץ שלילי שווה ל- Pc על פני הגרעין.</li>
	<li>לרכוש תמונות עם התוכנה אוסף תמונות מיקרוסקופ. הגדר של אבי-רכישה (וידאו) או nd-רכישה (תמונות) בתוכנה אוסף תמונות. הערה: עבור כל רכישת תוכנת הדמיה, להגדיר הדמיה וידאו בזמן אמת או רכישות תמונות בצילום מואץ עם מרווח זמן קצר.</li>
	<li>לעבור כדי פלורסנט התואם הדמיה ערוץ (קרי, ה-GFP, RFP, וכו) ולהתחיל הדמיה.</li>
	<li>לתרגם את הטיפ micropipette, והגוף של התא (מימין, איור 1B) עד לגרעין לניתוק מן micropipette. הערה: משוך את הקצה לאורך הכיוון-x חיובי (מימין עם שדה הראייה). הקצב מושך יכול להיות מתוכנת, נשלט על-ידי מחשב או הג'ויסטיק ניתן להעביר באופן ידני. לא נמצא כל מתאם בין הוצאת גרעיני דפורמציה15 מציע מענה בעיקר אלסטי לכפות וקצב.</li>
</ol>3. ניתוח נתונים
<ol><li>לבצע ניתוח תמונות עם תוכנות עיבוד תמונה בסיסי זמינים. ניתן לכמת את מידת דפורמציה גרעיני על ידי המתח אורך (Ɛ) או המתח באזור (איור 1 א'). לכמת אורך המתח באמצעות משוואה 1, איפה L ו- L0 מייצג את המרחק של הגרעין-דפורמציה מקסימלית ואת המיקום הראשוני, בהתאמה. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58038/58038eq1.jpg">(משוואת 1)</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+envelope+environment+and+its+cancer+connections.">The nuclear envelope environment and its cancer connections.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).</li><li>Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+structure+in+cancer+cells.">Nuclear structure in cancer cells.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).</li><li>Bank, E. M., Gruenbaum, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+lamina+and+heterochromatin:+a+complex+relationship.">The nuclear lamina and heterochromatin: a complex relationship.</a> Biochemical Society Transactions. 39 (6), 1705-1709 (2011).</li><li>Lammerding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamins+A+and+C+but+not+lamin+B1+regulate+nuclear+mechanics.">Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (35), 25768-25780 (2006).</li><li>Dahl, K. N., Engler, A. J., Pajerowski, J. D., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power-law+rheology+of+isolated+nuclei+with+deformation+mapping+of+nuclear+substructures.">Power-law rheology of isolated nuclei with deformation mapping of nuclear substructures.</a> Biophysical Journal. 89 (4), 2855-2864 (2005).</li><li>Crisp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+the+nucleus+and+cytoplasm:+role+of+the+LINC+complex.">Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex.</a> Journal of Cell Biology. 172 (1), 41-53 (2006).</li><li>Sosa, B. A., Rothballer, A., Kutay, U., Schwartz, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LINC+complexes+form+by+binding+of+three+KASH+peptides+to+domain+interfaces+of+trimeric+SUN+proteins.">LINC complexes form by binding of three KASH peptides to domain interfaces of trimeric SUN proteins.</a> Cell. 149 (5), 1035-1047 (2012).</li><li>Tapley, E. C., Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+the+nucleus+to+the+cytoskeleton+by+SUN-KASH+bridges+across+the+nuclear+envelope.">Connecting the nucleus to the cytoskeleton by SUN-KASH bridges across the nuclear envelope.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 57-62 (2013).</li><li>Arsenovic, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nesprin-2G,+a+Component+of+the+Nuclear+LINC+Complex,+Is+Subject+to+Myosin-Dependent+Tension.">Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension.</a> Biophysical Journal. 110 (1), 34-43 (2016).</li><li>Rowat, A. C., Lammerding, J., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+the+cell+nucleus+and+the+effect+of+emerin+deficiency.">Mechanical properties of the cell nucleus and the effect of emerin deficiency.</a> Biophysical Journal. 91 (12), 4649-4664 (2006).</li><li>Rowat, A. C., Foster, L. J., Nielsen, M. M., Weiss, M., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+elastic+properties+of+the+nuclear+envelope.">Characterization of the elastic properties of the nuclear envelope.</a> Journal of the Royal Society Interface. 2 (2), 63-69 (2005).</li><li>Pagliara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxetic+nuclei+in+embryonic+stem+cells+exiting+pluripotency.">Auxetic nuclei in embryonic stem cells exiting pluripotency.</a> Nature Materials. 13 (6), 638-644 (2014).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+mechanical+characterization+of+the+cell+nucleus+by+atomic+force+microscopy.">In situ mechanical characterization of the cell nucleus by atomic force microscopy.</a> ACS Nanotechnology. 8 (4), 3821-3828 (2014).</li><li>Krause, M., Te Riet, J., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+compressibility+of+tumor+cell+nuclei+by+combined+atomic+force-confocal+microscopy.">Probing the compressibility of tumor cell nuclei by combined atomic force-confocal microscopy.</a> Physical Biology. 10 (6), 065002 (2013).</li><li>Neelam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+force+probe+reveals+the+mechanics+of+nuclear+homeostasis+in+the+mammalian+cell.">Direct force probe reveals the mechanics of nuclear homeostasis in the mammalian cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5720-5725 (2015).</li><li>Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+plasticity+of+the+nucleus+in+stem+cell+differentiation.">Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15619-15624 (2007).</li><li>Lammerding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamin+A/C+deficiency+causes+defective+nuclear+mechanics+and+mechanotransduction.">Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction.</a> Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).</li><li>Chancellor, T. J., Lee, J., Thodeti, C. K., Lele, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actomyosin+tension+exerted+on+the+nucleus+through+nesprin-1+connections+influences+endothelial+cell+adhesion,+migration,+and+cyclic+strain-induced+reorientation.">Actomyosin tension exerted on the nucleus through nesprin-1 connections influences endothelial cell adhesion, migration, and cyclic strain-induced reorientation.</a> Biophysical Journal. 99 (1), 115-123 (2010).</li><li>Neelam, S., Dickinson, R. B., Lele, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+approaches+for+understanding+the+nuclear+force+balance+in+living,+adherent+cells.">New approaches for understanding the nuclear force balance in living, adherent cells.</a> Methods. 94, 27-32 (2016).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

מדידת השילוב מכני של הגרעין עם שלד התא היא אתגר עבור שיטות העדכנית ביותר, כמו השאיפה micropipette16, כי הם דורשים גם גרעינים בודדים (הגרעין איפה decoupled מ שלד התא) או הגרעינים מושעה תאים (היכן כוחות חוץ-תאית, כמו כוחות המתיחה, נעדרים). כוח הוחל את הגרעין על-ידי החלת זן biaxial תאים ו"היסטוריון17,ממברנה18; עם זאת, טכניקה זו מוגבל על ידי העובדה כי הכוח על הגרעין אינו ידוע. כוח אטומי (AFM) מיקרוסקופיה הגששים שימשו כדי להסיט פנימה את הגרעין בתאים שלמים; אלה מציעים יתרון כי הם חושפים תכונות מכאניות של גרעין עוד זה משולב עם שלד התא. כדי להוסיף שיטות ויוו , קיימים עבור אפיון גרעין12,13,14, פיתחנו שיטה פשוטה חזקים כדי לחקור באופן מכני את הגרעין בתא חסיד חי בזמן זה נשאר משולב שלד התא שמסביב. תכונה מרכזית של טכניקה זו היא כי הכוח על הגרעין בדיוק ידוע, מבוקר.
על-ידי החלת את  DFP, אנו מעריכים כי כוחות בקנה מידה ננו-ניוטון מספיקים לעוות ולתרגם את הגרעין בתאים חיים, חסיד. יתר על כן, דרך מחקרים שיטתיים של התרומות של אלמנטים cytoskeletal שונים, מצאנו כי vimentin מבוססי חוטים ביניים הם המרכיב העיקרי של שלד התא הסלולר אחראי stiffening לגרעין התא 15.
מספר האזהרות להחיל עם הניסויים. חשוב לבדוק באופן סדיר את עצת micropipette עבור סתימת או שבירה במהלך הניסויים, כמו שני סתימת micropipette או שבר של הקצה יגרום שינויים לא ידוע לחץ היניקה שהוחלו על התא. כדי לבדוק אם micropipette זה סתם, השתמש בהגדרה נקיים על manipulator הפעילו לחץ מירבי ולבדוק עבור בועות אוויר העולה מן הקצה micropipette. אם הקצה micropipette שבור או סדוק, להחליף את micropipette לפני תחילת הניסוי הבא. בנוסף, חשוב לוודא כי המתח הגרעיני משתנה עם הכוח, הוא אפס-אפס כוח (ראה קיראן. et al. 15)-זה לא נצפית בניסויים, אם זה אפשרי כי אדהזיה שאינם ספציפיים בין הטיפ micropipette פני השטח גרעינית (למרות טיפול עם PLL-יתד) עשוי להיות אחראי דפורמציה גרעינית. מגבלה נוספת של הטכניקה היא כי החדרת micropipette לתוך התא עצמו עלולה לגרום וייתכנו שיבושים המקומי של מבנים cytoskeletal.
זה שימושי לבדוק את מתאמים בין מידת דפורמציה גרעיני/תרגום קצב הטעינה. היעדרות של המתאם ירמוז התנגדות בעיקר אלסטי. ואכן, זה מה שמצאנו יהיה המקרה פיברובלסט גרעינים15. בעוד הכוח על הגרעין ידוע, השיטה אינה מאפשרת חישוב פרמטרים כמו האלסטיות. בעיקר השתמשנו בו כדי לנתח תרומות של מבנים הסלולר למחתרת דפורמציה גרעינית, התרגום בתא. בעוד אנו מדווחים על מימדי צורות גרעיני15,19, זה עשוי להיות שימושי כדי לכמת את צורת הגרעין תחת כוח מלא תלת-ממדי.
לחץ היניקה micropipette ידוע, אבל זה גדול יותר מאשר הלחץ בפועל חלה על תאריך היעד משטח גרעיני זרימה של מים דרך נקבוביות10. עם זאת, אנחנו הראו כי ההתנגדות לזרום דרך נקבוביות הגרעין היא הרבה יותר גדולה דרך micropipette (ראה מידע תמיכה לחישובי ב קיראן. et al. 15) עבור ממברנה סביר permeabilities ו- micropipette מידות. לכן, הלחץ על פני הממברנה החיצונית צריך להיות שווה תחת לחץ היניקה קיומן של זרימה.
לסיכום,  DFP מאפשר למשתמש לכמת תגובת מכני משולב הגרעין-שלד התא תא חסיד כוח ידוע ומבוקר. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לנתח התרומות של ההרכב המולקולרי בגרעין, בציטופלסמה על ההתנהגות מכני של הגרעין בתוך התא.

פתולוגיות כגון סרטן כרוך שינויים גרעיני צורה, מבנה1,2, אשר באופן כללי מלוות של "ריכוך" של גרעין3,4. התנגדות גרעיני דפורמציה מכאנית בדרך כלל התאפיין החלת כוח מבודדים גרעינים5.
הגרעין בתאים מחובר מולקולרי שלד התא על ידי מקשר של Nucleoskeleton שלד התא (לינק) מורכב6,7,8,9. כתוצאה מכך, הגרעין מכנית משולב עם שלד התא ודרכו תא-תשתית הדבקויות, מטריצות. מכנית חיטוט הגרעין בתוך תאים חסיד יכול לספק תובנה זו אינטגרציה מכנית. שיטות לטפל גרעין תאים חיים כוללים micropipette שאיפה10,11,13,12,מיקרוסקופ כוח אטומי14. אנחנו לאחרונה תיאר בדיקה ישירה כוח ( DFP) שחל כוחות מכני ישירות על גרעין תא חסיד חי15.
כאן, אנחנו חלוקה לרמות נוהל באמצעות מערכת microinjection זמין בדרך כלל במתקנים מיקרוסקופ כדי להחיל כוח מכני ידוע, בקנה מידה ננו ישירות על גרעין תא חסיד. Femtotip (0.5 מיקרומטר קוטר micropipette tip) רכוב, המחוברים למערכת microinjection באמצעות צינור. הטיפ, מוצבים בזווית של 45 מעלות ביחס השטח של המנה תרבות, היא יורדת עד סמוך אל פני השטח גרעינית. הצינור ואז מנותק ולאחר שנפתח לאווירה, אשר יוצרת לחץ שאיבה שלילי על פני הגרעין, חותמות את הטיפ micropipette נגד פני השטח גרעינית. באמצעות תרגום של קצה micropipette, הגרעין מעוותים, בסופו של דבר (בהתאם לגודל הכוח חלה), מנותקת את micropipette. בחבורה הזאת מתרחשת כאשר הכוחות (התנגדות) שחזור, המופעל על ידי גרעין התא, שווה את כוח היניקה שהחיל את micropipette. הניתוח יכול להתבצע על ידי מדידת הפיזור של הגרעין, המתח אורך (משוואה 1), או המתח באזור (איור 1 א').

<table><tbody><tr><td>FluoroDish</td><td>WPI</td><td>FD35</td><td></td></tr><tr><td>SYTO 59</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11341</td><td></td></tr><tr><td>Femtotips&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>930000043</td><td></td></tr><tr><td>InjectMan NI2</td><td>Eppendorf</td><td>NA</td><td>discontinued, current equivalent model: InjectMan 4</td></tr><tr><td>FemtoJet</td><td>Eppendorf</td><td>NA</td><td>Current model FemtoJet 4i</td></tr><tr><td>Plan Fluor oil immersion 40x</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Apo TIRF oil immersion 60x</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Donor Bovine Serum (DBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16030074</td><td>NIH 3T3 serum</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modification of Eagle&#039;s (DMEM)</td><td>Mediatech cellgro</td><td>MT10013CVRF</td><td>NIH 3T3 medium</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>MT30004CIRF</td><td>NIH 3T3 medium supplement</td></tr><tr><td>Immersion Oil Type LDF Non-Fluorescing</td><td>Nikon</td><td>77007</td><td>Immersion oil for objective lens&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

a direct force probe for measuring mechanical integration between the nucleus and the cytoskeleton

התכונות המכאניות של הגרעין לקבוע את תגובתה מכני הכוחות שנוצר בתאים. מכיוון הגרעין מולקולרי רציפה עם שלד התא, שיטות נחוצים כדי לחקור את התנהגותו מכני בתאים חסיד. כאן, אנו נדון החללית כוח ישיר ( DFP) ככלי להפעיל כוח באופן ישיר הגרעין בתא חסיד חי. אנחנו לצרף micropipette צרים על פני השטח גרעיני עם השאיבה. Micropipette מתורגמת הרחק מהגרעין, הגורמת הגרעין לעוות ולתרגם. כאשר הכוח שחזור שווה כוח יניקה, הגרעין לניתוק ונרגע elastically. בגלל הלחץ היניקה הוא ידוע במדויק, הכוח על פני הגרעין ידוע. שיטה זו חשפה כי בקנה מידה ננו כוחות מספיקים לעוות ולתרגם את הגרעין בתאים חסיד, זיהה רכיבים cytoskeletal המאפשרים את הגרעין להתנגד כוחות.  DFP ניתן לנתח התרומות של רכיבים הסלולר וגרעיני תכונות מכניות הגרעין בתאים חיים.

איור 2A מראה שהאילוץ של גרעין פיברובלסט העכבר NIH 3T3. הטיפ micropipette מתורגם מימין, הגרעין מתעוות, בסופו של דבר לניתוק מהקצה micropipette. המתח אורך של הגרעין נתפסת להגדיל עם הגדלת כוח יניקה (איור 2B). הקצה הקדמי של הגרעין (micropipette משיכת הקצה) יוצר בליטה גרעינית, הקצה נגרר מעקורי ממיקומה המקורי. האורך של בליטה היא הרבה יותר גדולה מאשר העקירה בקצה (איור 2C), מציע שילוב הדוק בין הגרעין לבין הציטופלסמה שמסביב. המאזניים זמן הם קיצור של הרפיה של הקצה הקדמי גרעינית (< 1 s), לבין הקצה האחורי גרעינית (< 2 s) (איור דו-ממדי).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58038/58038fig2.jpg"> איור 2 . אפיון הגרעין להרכב דפורמציה ותזוזה של גרעין תא חי, חסיד מאת  DFP. גרעין פיברובלסט 3T3 NIH נמשך בכוח nN 6. התמונות להראות את הצורה גרעיני ברגע המתאים. סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר דפורמציה גרעיני ב' הייתה לכמת על ידי אורך המתח. להרכב גרעיני גדל עם כוחות יישומית. קווי שגיאה מציינים את שגיאת התקן של הממוצע (SEM); n > 6. ג. העקירה בחוד גדול יותר העקירה בקצה נגרר. ד. הרפיה זן אורך הוא הרבה יותר מהר מאשר הקצה האחורי הרפיה. P < 0.05; קווי שגיאה לציין SEM; n = 10. איור זה השתנה מ קיראן ואח. 15. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58038/58038fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
השתמשנו בשיטת  DFP כדי לקבוע כיצד cytoskeletal כוחות לתרום התנגדות גרעיני דפורמציה בתא. בעוד אין הבדלים משמעותיים דפורמציה גרעינית או תרגום נמצאו לאחר F-אקטין (על-ידי cytochalasin-D) או הפרעה microtubule (על-ידי nocodazole), הפחתת הביטוי vimentin מבוססי siRNA נוקאאוט, גרמו גדול משמעותית תרגום גרעינית, דפורמציה (איור 3). הדבר מצביע על כך vimentin ביניים ב fibroblasts זיריהם היסוד cytoskeletal העיקרי לסייע לגרעין להתנגד בכוח מקומי.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58038/58038fig3.jpg"> איור 3 . פלורסנט תמונות של גרעיני להרכב  DFP שימש כדי לקבוע את התרומה של כוחות cytoskeletal דפורמציה גרעינית. הגרעין הוכתם SYTO 59 צבע. תמונות פלורסנט להראות הכיסוי של הגרעין לפני (אדום, צבע מדומה) ואחרי (ירוק, צבע מדומה)-התנאי שצוין. CTRL, תאים שליטה; CYTO-D, תאים שטופלו cytochalasin-D; המבצעי, תאים שטופלו nocodazole; . תתחפף, תאים transfected עם ביצים מקושקשות siRNA; vim siRNA, תאים transfected עם siRNA מיקוד vimentin. איור זה השתנה מ קיראן ואח. 15. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58038/58038fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton at JoVE.com

A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

בדיקה ישירה כוח למדידת מכני אינטגרציה בין הגרעין של שלד התא

ב פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה micropipette ישירות להחיל כוח מבוקר את הגרעין בתא החי. Assay הזה מאפשר חקירת תכונות מכניות הגרעין בתא חי, חסיד.

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous ...

a-direct-force-probe-for-measuring-mechanical-integration-between

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

15.1K Views.  University of Florida. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה micropipette ישירות להחיל כוח מבוקר את הגרעין בתא החי. Assay הזה מאפשר חקירת תכונות מכניות הגרעין בתא חי, חסיד.

Video: A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

פרוטוקול באמצעות העברת אנרגיה פורסטר תהודה (סריג) חיישנים ביולוגיים -force למדוד כוחות מכניים ברחבי המכלול הגרעיני LINC

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

Bioengineering

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue morphogenesis goes in hand with molecular and structural changes at the single cell level that result in variations of subcellular mechanical properties. As a consequence, even within the same cell, different organelles and compartments resist differently to mechanical stresses; and mechanotransduction pathways can actively regulate their mechanical properties. The ability of a cell to adapt to the microenvironment of the tissue niche thus is in part due to the ability to sense and respond to mechanical stresses. We recently proposed a new mechanosensation paradigm in which nuclear deformation and positioning enables a cell to gauge the physical 3D environment and endows the cell with a sense of proprioception to decode changes in cell shape. In this article, we describe a new method to measure the forces and material properties that shape the cell nucleus inside living cells, exemplified on adherent cells and mechanically confined cells. The measurements can be performed non-invasively with optical traps inside cells, and the forces are directly accessible through calibration-free detection of light momentum. This allows measuring the mechanics of the nucleus independently from cell surface deformations and allowing dissection of exteroceptive and interoceptive mechanotransduction pathways. Importantly, the trapping experiment can be combined with optical microscopy to investigate the cellular response and subcellular dynamics using fluorescence imaging of the cytoskeleton, calcium ions, or nuclear morphology. The presented method is straightforward to apply, compatible with commercial solutions for force measurements, and can easily be extended to investigate the mechanics of other subcellular compartments, e.g., mitochondria, stress-fibers, and endosomes.

Here, we present a protocol to investigate the intracellular mechanical properties of isolated embryonic zebrafish cells in three-dimensional confinement with direct force measurement by an optical trap.

מדידות כוח ישירות של מכניקה תת-תאית בכליאה באמצעות פינצטה אופטית

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

Developmental Biology

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

מדידה של דינמיקה רגישים ל"כוח הפזורים חלבונים בתאים חיים באמצעות שילוב של טכניקות פלורסנט

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the physical properties of the nucleus contribute significantly to the overall biomechanical behavior of cells under physiological and pathological conditions. For example, in migrating neutrophils and invading cancer cells, nuclear stiffness can pose a major obstacle during extravasation or passage through narrow spaces within tissues.1 On the other hand, the nucleus of cells in mechanically active tissue such as muscle requires sufficient structural support to withstand repetitive mechanical stress. Importantly, the nucleus is tightly integrated into the cellular architecture; it is physically connected to the surrounding cytoskeleton, which is a critical requirement for the intracellular movement and positioning of the nucleus, for example, in polarized cells, synaptic nuclei at neuromuscular junctions, or in migrating cells.2 Not surprisingly, mutations in nuclear envelope proteins such as lamins and nesprins, which play a critical role in determining nuclear stiffness and nucleo-cytoskeletal coupling, have been shown recently to result in a number of human diseases, including Emery-Dreifuss muscular dystrophy, limb-girdle muscular dystrophy, and dilated cardiomyopathy.3 To investigate the biophysical function of diverse nuclear envelope proteins and the effect of specific mutations, we have developed experimental methods to study the physical properties of the nucleus in single, living cells subjected to global or localized mechanical perturbation. Measuring induced nuclear deformations in response to precisely applied substrate strain application yields important information on the deformability of the nucleus and allows quantitative comparison between different mutations or cell lines deficient for specific nuclear envelope proteins. Localized cytoskeletal strain application with a microneedle is used to complement this assay and can yield additional information on intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton. Studying nuclear mechanics in intact living cells preserves the normal intracellular architecture and avoids potential artifacts that can arise when working with isolated nuclei. Furthermore, substrate strain application presents a good model for the physiological stress experienced by cells in muscle or other tissues (e.g., vascular smooth muscle cells exposed to vessel strain). Lastly, while these tools have been developed primarily to study nuclear mechanics, they can also be applied to investigate the function of cytoskeletal proteins and mechanotransduction signaling.

We present two independent, microscope-based tools to measure the induced nuclear and cytoskeletal deformations in single, living adherent cells in response to global or localized strain application. These techniques are used to determine nuclear stiffness (i.e., deformability) and to probe intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton.

מבחני Biophysical לחקור את תכונות מכניות של גרעין התא שלבי הביניים: מסננים תשתית יישומים מניפולציה Microneedle

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the ...

Biology

DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical for regulating many processes ranging from development to immunology. Therefore, developing the tools to study these forces at the molecular scale is critical. Our group developed a suite of molecular tension sensors to quantify and visualize the forces generated by cells and transmitted to specific ligands. The most sensitive class of molecular tension sensors are comprised of nucleic acid stem-loop hairpins. These sensors use fluorophore-quencher pairs to report on the mechanical extension and unfolding of DNA hairpins under force. One challenge with DNA hairpin tension sensors is that they are reversible with rapid hairpin refolding upon termination of the tension and thus transient forces are difficult to record. In this article, we describe the protocols for preparing DNA tension sensors that can be "locked" and prevented from refolding to enable "storing" of mechanical information. This allows for the recording of highly transient piconewton forces, which can be subsequently "erased" by the addition of complementary nucleic acids that remove the lock. This ability to toggle between real-time tension mapping and mechanical information storing reveals weak, short-lived, and less abundant forces, that are commonly employed by T cells as part of their immune functions.

This paper describes a detailed protocol for using DNA-based tension probes to image the receptor forces applied by immune cells. This approach can map receptor forces &gt;4.7pN in real-time and can integrate forces over time.

בדיקות מתח DNA כדי למפות את כוחות קולטן פיקוניוטון חולפים על ידי תאים חיסוניים

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical ...

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction forces have been well-characterized, but there is a lack of techniques allowing the measurement of the protrusion forces exerted by cells orthogonally to their substrate. We designed an experimental setup to measure the protrusion forces exerted by adherent cells on their substrate. Cells plated on a compliant Formvar sheet deform this substrate and the resulting topography is mapped by atomic force microscopy (AFM) at the nanometer scale. Force values are then extracted from an analysis of the deformation profile based on the geometry of the protrusive cellular structures. Hence, the forces exerted by the individual protruding units of a living cell can be measured over time. This technique will enable the study of force generation and its regulation in the many cellular processes involving protrusion. Here, we describe its application to measure the protrusive forces generated by podosomes formed by human macrophages.

Here, we detail the experimental techniques used to evaluate the protrusion forces that podosomes apply on a compliant film, from the preparation of the film to the automated analysis of topographical images.

בליטה מיקרוסקופ כוח: שיטה לכמת כוחות שפותחה על ידי בליטות תא

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of serially linked sarcomeres, the smallest contractile units in muscle. Sarcomeric dysfunction contributes to muscle weakness in patients with mutations in genes encoding for sarcomeric proteins. The study of myofibril mechanics allows for the assessment of actin-myosin interactions without potential confounding effects of damaged, adjacent myofibrils when measuring the contractility of single muscle fibers. Ultrastructural damage and misalignment of myofibrils might contribute to impaired contractility. If structural damage is present in the myofibrils, they likely break during the isolation procedure or during the experiment. Furthermore, studies in myofibrils provide the assessment of actin-myosin interactions in the presence of the geometrical constraints of the sarcomeres. For instance, measurements in myofibrils can elucidate whether myofibrillar dysfunction is the primary effect of a mutation in a sarcomeric protein. In addition, perfusion with calcium solutions or compounds is almost instant due to the small diameter of the myofibril. This makes myofibrils eminently suitable to measure the rates of activation and relaxation during force production. The protocol described in this paper employs an optical force probe based on the principle of a Fabry-P&#233;rot interferometer capable of measuring forces in the nano-Newton range, coupled to a piezo length motor and a fast-step perfusion system. This setup enables the study of myofibril mechanics with high resolution force measurements.

Presented here is a protocol to assess the contractile properties of striated muscle myofibrils with nano-Newton resolution. The protocol employs a setup with an interferometry-based, optical force probe. This setup generates data with a high signal-to-noise ratio and enables the assessment of the contractile kinetics of myofibrils.

בידוד מיו-בריאלס מבריות מביופסיות שריר השלד וקביעת תפקוד מתכווץ עם מתמר כוח רזולוציה ננו-ניוטון

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

Tension Gauge Tether Probes for Quantifying Growth Factor Mediated Integrin Mechanics and Adhesion

Multicellular organisms rely on interactions between membrane receptors and cognate ligands in the surrounding extracellular matrix (ECM) to orchestrate multiple functions, including adhesion, proliferation, migration, and differentiation. Mechanical forces can be transmitted from the cell via the adhesion receptor integrin to ligands in the ECM. The amount and spatial organization of these cell-generated forces can be modulated by growth factor receptors, including epidermal growth factor receptor (EGFR). The tools currently available to quantify crosstalk-mediated changes in cell mechanics and relate them to&#160;focal adhesions, cellular morphology, and signaling are limited. DNA-based molecular force sensors known as tension gauge tethers (TGTs) have been employed to quantify these changes. TGT probes are unique in their ability to both modulate the underlying force threshold and report piconewton scale receptor forces across the entire adherent cell surface at diffraction-limited spatial resolution. The TGT probes used here rely on the irreversible dissociation of a DNA duplex by receptor-ligand forces that generate a fluorescent signal. This allows quantification of the cumulative integrin tension (force history) of the cell. This article describes a protocol employing TGTs to study the impact of EGFR on integrin mechanics and adhesion formation. The assembly of&#160;the TGT mechanical sensing platform is systematically detailed and the procedure to image forces, focal adhesions, and cell spreading is outlined. Overall, the ability to modulate the underlying force threshold of the probe, the adhesion ligand, and the type and concentration of growth factor employed for stimulation make this a robust platform for studying the interplay of diverse membrane receptors in regulating integrin-mediated forces.

TGT surface is an innovative platform to study growth factor-integrin crosstalk. The flexible probe design, specificity of the adhesion ligand, and precise modulation of stimulation conditions allow robust quantitative assessments of EGFR-integrin interplay. The results highlight EGFR as a 'mechano-organizer' tuning integrin mechanics, influencing focal adhesion assembly and cell spreading.

מד מתח קשירה בדיקות לכימות גורם גדילה מתווך מכניקת אינטגרין והדבקה

Multicellular organisms rely on interactions between membrane receptors and cognate ligands in the surrounding extracellular matrix (ECM) to orchestrate ...

Directly Measuring Forces Within Reconstituted Active Microtubule Bundles

Microtubule networks are employed in cells to accomplish a wide range of tasks, ranging from acting as tracks for vesicle transport to working as specialized arrays during mitosis to regulate chromosome segregation. Proteins that interact with microtubules include motors such as kinesins and dynein, which can generate active forces and directional motion, as well as non-motor proteins that crosslink filaments into higher-order networks or regulate filament dynamics. To date, biophysical studies of microtubule-associated proteins have overwhelmingly focused on the role of single motor proteins needed for vesicle transport, and significant progress has been made in elucidating the force-generating properties and mechanochemical regulation of kinesins and dyneins. However, for processes in which microtubules act both as cargo and track, such as during filament sliding within the mitotic spindle, much less is understood about the biophysical regulation of ensembles of the crosslinking proteins involved. Here, we detail our methodology for directly probing force generation and response within crosslinked microtubule minimal networks reconstituted from purified microtubules and mitotic proteins. Microtubule pairs are crosslinked by proteins of interest, one microtubule is immobilized to a microscope coverslip, and the second microtubule is manipulated by an optical trap. Simultaneous total internal reflection fluorescence microscopy allows for multichannel visualization of all the components of this microtubule network as the filaments slide apart to generate force. We also demonstrate how these techniques can be used to probe pushing forces exerted by kinesin-5 ensembles and how viscous braking forces arise between sliding microtubule pairs crosslinked by the mitotic MAP PRC1. These assays provide insights into the mechanisms of spindle assembly and function and can be more broadly adapted to study dense microtubule network mechanics in diverse contexts, such as the axon and dendrites of neurons and polar epithelial cells.

Here, we present a protocol for reconstituting microtubule bundles in vitro and directly quantifying the forces exerted within them using simultaneous optical trapping and total internal reflection fluorescence microscopy. This assay allows for nanoscale-level measurement of the forces and displacements generated by protein ensembles within active microtubule networks.

מדידה ישירה של כוחות בתוך צרורות מיקרוטובולים פעילים משוחזרים

Microtubule networks are employed in cells to accomplish a wide range of tasks, ranging from acting as tracks for vesicle transport to working as ...

Combining 3D Magnetic Force Actuator and Multi-Functional Fluorescence Imaging to Study Nucleus Mechanobiology

A fundamental question in mechanobiology is how living cells sense extracellular mechanical stimuli in the context of cell physiology and pathology. The cellular mechano-sensation of extracellular mechanical stimuli is believed to be through the membrane receptors, the associated protein complex, and the cytoskeleton. Recent advances in mechanobiology demonstrate that the cell nucleus in cytoplasm itself can independently sense mechanical stimuli simultaneously. However, a mechanistic understanding of how the cell nucleus senses, transduces, and responds to mechanical stimuli is lacking, mainly because of the technical challenges in accessing and quantifying the nucleus mechanics by conventional tools. This paper describes the design, fabrication, and implementation of a new magnetic force actuator that applies precise and non-invasive 3D mechanical stimuli to directly deform the cell nucleus. Using CRISPR/Cas9-engineered cells, this study demonstrates that this tool, combined with high-resolution confocal fluorescent imaging, enables the revelation of the real-time dynamics of a mechano-sensitive yes-associated protein (YAP) in single cells as a function of nucleus deformation. This simple method has the potential to bridge the current technology gap in the mechanobiology community and provide answers to the knowledge gap that exists in the relation between nucleus mechanotransduction and cell function.

This study presents a new protocol to directly apply mechanical force on the cell nucleus through magnetic microbeads delivered into the cytoplasm and to conduct simultaneous live-cell fluorescent imaging.

שילוב של מפעיל כוח מגנטי תלת-ממדי והדמיה פלואורסצנטית רב-תפקודית לחקר גרעין המכנוביולוגיה

A fundamental question in mechanobiology is how living cells sense extracellular mechanical stimuli in the context of cell physiology and pathology. The ...