עבודה זו נתמכה על ידי סגל המחקר מעניק מתפקידה המכללה לאמנויות ודין מדעי באוניברסיטת הארטפורד.

במהלך המחקר, טיפול בבעלי חיים וטיפול תאמו מדיניות מכוני הבריאות הלאומיים, היו על פי הנחיות מוסדיים, אושרו על ידי אוניברסיטת הרטפורד טיפול בבעלי חיים מוסדיים בעלי חיים ועל שימוש הוועדה.
1. entrainment של בעלי חיים
הערה: עשרים בת שבוע זכר B6129SF2/J עכברים משמשים במחקר.
<ol><li>Entrain עכברים 12 שעות אור (סטנדרט עילי אור לבן) / כהה 12 h מחזור 2 שבועות לפני הניסוי. הערה: כאן זמן zeitgeber (ZT) 0 מקביל אורות, ZT12 אורות, תוך שמירה על איכות הסביבה גורמים אחרים (קרי, מזון ומים בטמפרטורת החדר) קבוע 21.</li>
</ol>2. הכנת כלי נגינה תרבות בינוני, בינוני אתגר
<ol><li>אוטוקלב מלקחיים ומספריים ויבתר לעטוף זוגות של שקופיות מיקרוסקופ עמומה רדיד אלומיניום, החיטוי.</li>
	<li>היכונו בינוני תרבות על-ידי הוספת סרום שור עוברית (FBS) כדי RPMI 1640 ריכוז סופי של 10%. הכינו 10 מ"ל של אתגר בינונית 50 מ ל צינורות על-ידי הוספת PAMPs הבאים את המדיום תרבות (RPMI עם 10% FBS); LPS (5 µg/mL), ODN1826 (5 µg/mL), חום-נהרג ליסטריה (108 HKLM/mL), או PAMP אחר בריכוז המוצע שלה.</li>
	<li>לחמם תרבות בינונית, אתגר בינוני עד 37 ° C באמבט מים, ולשמור כ 70 מ ל תמיסת סטרילית פוספט buffered (PBS, pH 7.2) בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להוסיף 10 מ של תרבות מדיום באמצעות פיפטה של 10 מ"ל פיפטה סיוע שפופרת 50 מ ל, המקום על קרח.</li>
	<li>להוסיף כ- 30 מ של 70% אתנול 100 מ ל גביע ומקום הקצוות של לנתח מלקחיים ומספריים לתוך כשהספל למניעת זיהום מיקרוביאלי.</li>
	<li>היכונו מאגר פירוק RNA בידוד על-ידי הוספת 10 µL β-Mercaptoethanol (תחת ברדס fume) לכל 1 מ"ל של מאגר RLT בשפופרת 50 מ. לעשות רק את הסכום יהיה צורך (600 µL עבור דגימה, אשר מורכב של 1 x 106 תאים). הערה: RLT מאגר הוא רכיב של ערכת חילוץ RNA התומך הכריכה של RNA למוח סיליקה.</li>
</ol>3. Splenocyte בידוד ואתגר
<ol><li>המתת חסד עכברים במועד מסוים zeitgeber באמצעות הרדמה על-ידי שמירתן בכלוב המקורי שלהם והוספת CO2 לכלוב בספיקה של 3 L לדקה המשך אספקת CO2 ב 1 דקות לאחר עוצר נשימה.</li>
	<li>אשר מת דרך נקע בצוואר הרחם על ידי הצבת באגודל ובאצבע משני צדי הצוואר בבסיס הגולגולת. לחלופין, הקש על מוט בבסיס הגולגולת תוך משיכת במהירות (באמצעות היד השנייה) בבסיס הזנב או הגפיים האחוריות כדי לגרום ההפרדה של חוליות צוואר הרחם של הגולגולת22.</li>
	<li>תרסיס המטען עכבר עם 70% אתנול ולנגב במגבת נייר. הנח את העכבר על הגב ועל מוטה מעט על הצד השמאלי שלו. לחתוך את הפרווה, באמצעות לנתח מספריים, לאורך הצד השמאלי של העכבר, על באמצע הדרך בין הכניסה לבין האחוריות.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים, לתפוס את הצפק ולהפוך בזהירות חתך כדי לא לפגוע בטחול. להסיר את הטחול עם מלקחיים ומניחים לתוך צינור סטרילי 50 מ ל המכיל כ- 10 מ"ל של תרבות התקשורת על קרח. חזור על החיות הנותרים. הערה: הטחול הוא הצבע של שעועית כליה, זה ארוך ושטוח יותר הכליה.</li>
	<li>
העברה הטחול אחת עם 2 מ של תרבות בינוני צלחת פטרי סטריליות קטן.
	<ol>
<li>Homogenize הטחול על ידי שפשוף זה בין החלק עמומה של שתי שקופיות עמומה סטרילי. במידת האפשר, לשמור את הנושא ואת התאים בטווח הבינוני במהלך תהליך המגון.</li>
		<li>פעם ביסודיות הומוגני, pipet mL 2 של תרבות בינוני המכיל את splenocytes דרך מסננת תא 40 µm ניילון לתוך צינור 50 מ.</li>
		<li>חזור על השלבים שלעיל טחולים הנותר באמצעות זוגות חדשים של שקופיות עמומה, צינורות 50 מ עם תרבות בינוני, תא strainers.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להוסיף כל אחד הצינורות 50 מ ל המכיל את splenocytes עבור הנפח הכולל של 10 מ"ל/צינור 8 מ של מדיום קר תרבות. לקבוע את מספר תאים למיליליטר באמצעות של hemocytometer.</li>
	<li>להוסיף כ עונה 1 פרק 106 תאים/טוב 6-ובכן תרבות צלחות. הוסף תאים מספר בארות אשר תואמים מספר PAMPs שונים בשימוש עבור הניסוי, כוללים פקד טוב. להוסיף 3 מ"ל של תרבות מדיום או 3 מ"ל של אתגר בינוני הבארות בהתאמה.</li>
	<li>דגירה הצלחות ב- 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2 ב-3 שעות.</li>
	<li>לגרד את התאים מתחתית היטב באמצעות טיפ pipet µL 1,000 קשורה micropipette P1000. להעביר את המדיום המכילות את התאים באמצעות אותו 1,000 µL pipet העצה לרכבת התחתית 15 מ"ל.</li>
	<li>גלולה התאים באמצעות צנטריפוגה ב x 167 g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את תגובת שיקוע ולשטוף בגדר תא עם 5 מ של PBS.</li>
	<li>גלולה התאים בפעם השנייה ב 167 x g למשך 5 דקות, להסיר את תגובת שיקוע, ומוסיפים µL 600 פירוק מאגר בגדר תא כדי lyse התאים. לאחר מכן המשך בידוד ה-RNA.</li>
</ol>4. RNA בידוד ו- cDNA סינתזה
<ol><li>לבודד את הרנ א מ- splenocytes באמצעות ערכת חילוץ RNA לפי הנחיות היצרן ולבצע את העיכול הדנ א על עמודות 'אופציונלי'.</li>
	<li>לפני cDNA סינתזה, לקבוע ריכוז ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטרים microvolume כדי לוודא הריכוז בטווח ה-RNA אופטימלית (עד 2 µg) של cDNA סינתזה הערכה.</li>
	<li>
CDNA Synthesize עבור כל אחת הדגימות באמצעות ערכת שעתוק במהופך על פי הוראות היצרן. השתמש µL 10 של RNA לכל אחת הדגימות באמצעי אחסון התגובה הכולל 20 µL. בסיום שעתוק לאחור (thermocycler לרוץ) להוסיף 20 μL H2O על כל תגובה.
</li>
	<li>לבנות עיקול רגיל באמצעות micropipette P10 או P20 אספנו את ה-mRNA של שליטה כמה דוגמאות (למשל, 5 µL מדגימות 2 על סך של 10 µL) לתוך צינור 0.5 mL כדי להכין את cDNA.<ol>
<li>להוסיף 10 µL 2 x מיקס מאסטר רוורס טרנסקריפטאז.</li>
		<li>בסיום שעתוק לאחור, להוסיף 10 µL של H2O ברכבת התחתית התגובה, אשר ישמש הריכוז ההתחלתי ("1") בסדרת דילול של העקומה סטנדרטי.</li>
		<li>לבצע סדרה 10-fold דילול (1 עד 10-4) על-ידי הוספת 45 µL של מים באמצעות של micropipette P100 או P200 לתוך ארבעה צינורות 0.5 mL המיועד 10-1, 10-2, 10-3, 10-4.<ol>
<li>להוסיף 5 µL הריכוז ההתחלתי "1" לתוך הצינור הראשון (10-1) באמצעות micropipettor P20, מיקס על ידי pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים, ואז העברת 5 µL מהצינור 10-1 לתוך הצינור המיועד 10-2 ומיקס.</li>
			<li>להעביר 5 µL באמצעות micropipette P20 מהצינור 10-2 לתוך הצינור המיועד 10-3 ומערבבים. להעביר 5 µL באמצעות micropipettor P20 מהצינור 10-3 לתוך הצינור המיועד 10-4 ומערבבים.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. כמותיים תגובת שרשרת פולימראזית (qPCR)
<ol><li>לקבוע כימות היחסי של mRNA רמות על ידי qPCR. במסגרת ניסיוני הגדר, בחר כימיה "כימות – יחסית סטנדרטי עיקול" ו- "TaqMan". שינוי האחסון תגובה ל- 10 µL. להזין את המידע הרלוונטי הפריסה צלחת (למשל, יעד ג'ין, עיקול רגיל, כתב, וכו ').</li>
	<li>הכנת התגובה כך שהוא מכיל 0.5 µL של וזמינותו פריימר/בדיקה, 5 µL של גנים ביטוי מיקס מאסטר, µL 2 H2O ו- 2.5 µL של cDNA (10 – 100 ng).<ol>
<li>להכין תערובת בסיס על-ידי הכפלת כל אחד ריאגנטים הקודם (למעט cDNA) לפי מספר תגובות, וודאו שכללתם את אלה של העקומה סטנדרטי, פקדים שלילי, ביצוע כל התגובה כפילויות, ו 2 תגובות נוספות יעבור לחשבון וריאציה pipetting.</li>
		<li>Pipet 7.5 µL של המיקס מאסטר מוכן לתוך בארות שנקבע מראש בצלחת 96-ובכן התגובה של micropipette או של פיפטה רב-ערוצי. Pipet µL 2.5 של cDNA לתוך הבאר המתאים אלמונים ותקני ולאחר 2.5 µL של H2O לתוך הבארות שליטה שלילי.</li>
		<li>כוללים מבחני פריימר/בדיקה עבור גנים שעון מולקולרי שונים, וכוללים גם של assay עבור פקד אנדוגני (למשל, β-אקטין).</li>
	</ol>
</li>
	<li>כדי לקבוע ערכי הביטוי יחסי, לחשב את הכמות היחסית רעה עבור כל שכפול ולאחר מכן, עבור כל דגימה, לחלק את הכמות היחסית רעה עבור הגן היעד על ידי הכמות היחסית רעה עבור β-אקטין.</li>
</ol>6. ניתוח סטטיסטי
<ol><li>באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטי, להזין נתונים לתוכנית תחת האפשרות סטטיסטיקה בעמודה. בחר חד-כיווני אנובה עם הבדיקה לאחר הוק של Dunnett כדי להעריך את ההבדלים בין ערכים רשע שעון גנים לאחר אתגר PAMP לעומת הפקד.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bell-Pedersen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+from+multiple+oscillators:+lessons+from+diverse+organisms.">Circadian rhythms from multiple oscillators: lessons from diverse organisms.</a> Nat. Rev. Genet. 6, 544-556 (2005).</li><li>Mohawk, J. A., Green, C. B., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+and+Peripheral+Circadian+Clocks+in+Mammals.">Central and Peripheral Circadian Clocks in Mammals.</a> Annu. Rev. Neurosci. 35, 445-462 (2012).</li><li>Balsalobre, A., Damiola, F., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+serum+shock+induces+circadian+gene+expression+in+mammalian+tissue+culture+cells.">A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells.</a> Cell. 93, 929-937 (1998).</li><li>Yoo, S. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PERIOD2::LUCIFERASE+real-time+reporting+of+circadian+dynamics+reveals+persistent+circadian+oscillations+in+mouse+peripheral+tissues.">PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 5339-5346 (2004).</li><li>Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resetting+Central+and+Peripheral+Circadian+Oscillators+in+Transgenic+Rats.">Resetting Central and Peripheral Circadian Oscillators in Transgenic Rats.</a> Science. 288, 682-685 (2000).</li><li>Lowrey, P. L., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+circadian+rhythms+in+mammalian+model+organisms.">Genetics of circadian rhythms in mammalian model organisms.</a> Adv. Genet. 74, 175-230 (2011).</li><li>Curtis, A. M., Bellet, M. M., Sassone-Corsi, P., O'Neill, L. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+Clock+Proteins+and+Immunity.">Circadian Clock Proteins and Immunity.</a> Immunity. 40, 178-186 (2014).</li><li>Keller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+circadian+clock+in+macrophages+controls+inflammatory+immune+responses.">A circadian clock in macrophages controls inflammatory immune responses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21407-21412 (2009).</li><li>Silver, A. C., Arjona, A., Hughes, M. E., Nitabach, M. N., Fikrig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+expression+of+clock+genes+in+mouse+macrophages,+dendritic+cells,+and+B+cells.">Circadian expression of clock genes in mouse macrophages, dendritic cells, and B cells.</a> Brain. Behav. Immun. 26, 407-413 (2012).</li><li>Kawai, T., Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+pattern-recognition+receptors+in+innate+immunity+update+on+Toll-like+receptors.">The role of pattern-recognition receptors in innate immunity update on Toll-like receptors.</a> Nat. Publ. Gr. 11, 373-384 (2010).</li><li>Marpeg&#225;n, L., Bekinschtein, T. A., Costas, M. A., Golombek, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+responses+to+endotoxin+treatment+in+mice.">Circadian responses to endotoxin treatment in mice.</a> J. Neuroimmunol. 160, 102-109 (2005).</li><li>Okada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+LPS+Causes+Transient+Suppression+of+Biological+Clock+Genes+in+Rats.">Injection of LPS Causes Transient Suppression of Biological Clock Genes in Rats.</a> J. Surg. Res. 145, 5-12 (2008).</li><li>Haimovich, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+endotoxin+synchronizes+and+suppresses+clock+gene+expression+in+human+peripheral+blood+leukocytes.">In vivo endotoxin synchronizes and suppresses clock gene expression in human peripheral blood leukocytes.</a> Crit. Care Med. 38, 751-758 (2010).</li><li>Curtis, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+control+of+innate+immunity+in+macrophages+by+miR-155+targeting+Bmal1.">Circadian control of innate immunity in macrophages by miR-155 targeting Bmal1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7231-7236 (2015).</li><li>Silver, A. C., Arjona, A., Walker, W. E., Fikrig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Circadian+Clock+Controls+Toll-like+Receptor+9-Mediated+Innate+and+Adaptive+Immunity.">The Circadian Clock Controls Toll-like Receptor 9-Mediated Innate and Adaptive Immunity.</a> Immunity. , (2012).</li><li>Gibbs, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+receptor+REV-ERB+&#945;+mediates+circadian+regulation+of+innate+immunity+through+selective+regulation+of+inflammatory+cytokines.">The nuclear receptor REV-ERB &#945; mediates circadian regulation of innate immunity through selective regulation of inflammatory cytokines.</a> PNAS. 109, 582-587 (2012).</li><li>Zee, P. C., Attarian, H., Videnovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythm+abnormalities.">Circadian rhythm abnormalities.</a> Contin. Lifelong Learn. Neurol. 19, 132-147 (2013).</li><li>Bovbjerg, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+disruption+and+cancer:+sleep+and+immune+regulation.">Circadian disruption and cancer: sleep and immune regulation.</a> Brain. Behav. Immun. 17, 48-50 (2003).</li><li>Fu, L., Lee, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+circadian+clock:+pacemaker+and+tumour+suppressor.">The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 350-361 (2003).</li><li>Germain, A., Kupfer, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIRCADIAN+RHYTHM+DISTURBANCES+IN+DEPRESSION.">CIRCADIAN RHYTHM DISTURBANCES IN DEPRESSION.</a> Hum. Psychopharmacol. 23, 571-585 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Mouse+Care+and+Maintenance.">Basic Mouse Care and Maintenance.</a> JoVE. , (2018).</li><li>Leary, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AVMA+Guidelines+for+the+Euthanasia+of+Animals+:+2013+Edition.">AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals : 2013 Edition.</a> AVMA. , (2013).</li><li>Silver, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen-associated+molecular+patterns+alter+molecular+clock+gene+expression+in+mouse+splenocytes.">Pathogen-associated molecular patterns alter molecular clock gene expression in mouse splenocytes.</a> PLoS One. , 12-15 (2017).</li><li>Silver, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daily+oscillations+in+expression+and+responsiveness+of+Toll-like+receptors+in+splenic+immune+cells.">Daily oscillations in expression and responsiveness of Toll-like receptors in splenic immune cells.</a> Heliyon. , 00579 (2018).</li></ol>

המחבר אין לחשוף.

בתוך פרוטוקול זה, ספקטרופוטומטרים microvolume יכול לשמש כדי לכמת ולהעריך את טוהר הרנ א בשימוש בקביעת ביטוי גנים. חומצות גרעין לספוג אולטרא סגול-260 ננומטר, חלבונים בדרך כלל סופגים אור-280 ננומטר, ואילו אחרים מזהמים פוטנציאליים בשימוש במהלך שגרת החילוץ RNA (למשל, פנול) לזיהוי ב- 230 ננומטר. לכן, על-ידי הערכת את ספיגת יחס (א)-260/280 ננומטר (RNA לחלבון) ו- 260/230 nm (RNA לחלבון מזהמים) איכות הרנ א יכול להיות מוערך. RNA באיכות גבוהה יש יחס A260/280 בין 1.8 – 2.1, כמו יחסי נמוך יותר להצביע על זיהום חלבון. דוגמה RNA טהורה יהיה יחס A260/230 של 2.0.
כשתקבע את הביטוי היחסי של גנים היעד (קרי, Per2, שעון, Rev-erbα, ושל Dbp) ג'ין שליטה אנדוגני גם להיות מסומנת (גן בביטוי אילו רמות לא שונות בין דוגמאות). ביטוי היחסי של הגן היעד ואז מנורמל כביטוי של הגן בקרה אנדוגני. הבדלים חומר המוצא (מספר splenocytes), וריאציה של יעילות טרנסקריפטאז, המחירים שונים של RNA השפלה, וכדומה, יתוקנו על ידי הגן בקרה אנדוגני (β-אקטין ב פרוטוקול זה). עם זאת, רצוי לוודא כי הטיפול נבחנות לא תשנה את ביטוי הגן בקרה אנדוגני. זה יכול להתבצע על-ידי הערכת רמות β-אקטין משכפל מספר של מספר שווה של תאים ( לעומת אי-טיפול טיפול). בתיאוריה, רמות β-אקטין שלהם צריכים להיות זהים. גישה אחרת כדי להתגונן מפני שליטה אנדוגני וריאציה יהיה להשתמש פאנל של פקדים אנדוגני (גןלמשל, β-אקטין, Gapdh, ו- 18S rRNA).
כאשר בוחנים את השפעת PAMPs על השעון המולקולרי, שעת היום כאשר עכברים מורדמים, splenocytes לאחר מכן מאותגרים חייב להילקח בחשבון. הביטוי Tlr והיענות שהוצג בעבר כדי להדגים וריאציה תלויות זמן-של-יום8,15, לכן, בשעה של היום, כאשר התגובה TLR הוא בשיאו, העלול לגרום השפעה גדולה יותר על שעון. יתר על כן, ביטוי של גנים שעון מולקולרי גם משתנים לאורך היום splenocytes, לכן, הפחתה של השעון ביטוי גנים בשל PAMP האתגר יהיה המשמעותי ביותר אם בחן במהלך תקופת שיא הביטוי9. מאז Dbp , Rev-erbα הוכחו להפגין ביטוי משמעותי פסגות ב- splenocytes, תאים חיסוניים הטחול בסביבה בהירה-כהה לאטמוספרה 8,9,23, 24 (ZT12), בשיטה הנוכחית, התאים היו מבודדים והזמנו -ZT13 על מנת שיהיה סיכוי גדול יותר על גילוי הפחתה של גנים אלו. לעומת זאת, PAMP זה יכול להגביר את הביטוי שעון, קרוב לוודאי תיענה אם מסתכלים בשעה של היום, כאשר השעון הביטוי הוא הנמוך ביותר.
מאז עכברים הם בעלי חיים ליליים, שלב המנוחה שלהם הוא במהלך תקופת אור, אשר מתאים לפעילות האנושית. לכן, באופן אידיאלי, עכברים להיות בבניין חדר עם תנועה מינימלית, המכילה מכונה רעש לבן כדי להפחית הפרעות בשעות היום כמו זה יכול לשבש את המקצבים השעון הביולוגי של העכברים. יתר על כן, שינויים הכלוב צריך להיעשות הרבה לפני התאריך הניסוי. עבודה בחדר בעלי חיים (כולל המתת חסד של בעלי החיים) במהלך תקופת כהה, וצריך להתנהל תחת אור אדום על מנת למנוע שיבוש המקצבים של העכברים.
מקצבים ההשתנות היומית נחשפים לגירויים סביבתיים (למשל, קל או מזון), אשר מכונים zeitgebers. במקרה של אור/12 h 12 h כהה מחזור, zeitgeber (דהיינו, אור) מאפס את השעון כדי תקופה של 24 שעות. אמנם רוב המקצבים ההשתנות היומית היממה (קרי, יומי מקצבים המתרחשות בהיעדר הסימן החיצוני), הם אינם אמת מקצבים השעון הביולוגי עד הם הוכחו נעים בעלי תקופת משוער 24 שעות בתנאים סביבתיים קבוע . לכן, לבצע הליך זה יכול להיות שימוש בעכברים בתנאים קבועים, אשר יהיה כרוך עכברים entraining למעגל בהירה-כהה, כמתואר לעיל, אבל אז מחזיק החיות בחשכה קבוע כבר 3 ימים לפני דגימה. סוג זה של הניסוי נקרא הניסוי כהה-כהה (DD), נקודת הזמן של דיגום יהיה להתייחס אליו כאל CT (שעון היממה), לא ZT.
אמנם שיטה זו ניתן לזהות PAMPs אשר משנים את השעון ביטוי גנים בתוך splenocytes, זה לא לוקח בחשבון כיצד PAMPs אלה משפיעים על שעון אמן או שעונים היקפי בכל הגוף. מאז הטחול מורכב של אוכלוסיה הטרוגנית של תאים, PAMPs הפרט יכול להשפיע כל סוג התא באופן שונה. לדוגמה, Tlr9 מקצבים ביטוי של הטחול העכבר שונים בין splenocytes, מקרופאגים, תאי B ו- DCs15. בנוסף, Tlr1, Tlr3, Tlr4, Tlr6, Tlr7,ו Tlr8 מוצגים משמעותית תנודות יומיות אוכלוסיה splenocyte חסיד אבל רק Tlr2 ולא Tlr6 חווים מדי יום תנודות מקרופאגים הטחול מועשר24. לכן, על מנת לחקור את התוצאה של אתגר על סוגי תאים בודדים, תאים יכול להיות מבודדים באמצעות מיון תא מגנטי, כפי שתואר קודם לכן9,15 , ואז לאחר מכן תיגר. בנוסף, האוכלוסייה תא הטחול תנודות של מעל מחזור יומי, אשר יכול גם לשחק תפקיד רגישות PAMP מסוים, ההשפעה הבאים על השעון8.
שיטה זו מאפשרת ניתוקה של מספר גדול של תאים חיסוניים המורכבים יוכפל לאחר המרתו של B תאים (~ 58%), T תאים (~ 21%), תאים דנדריטים (~ 5%) ו מקרופאגים (~ 4%)25. מספר גדול של תאים מספק הזדמנות לאתגר את splenocytes עם מגוון של PAMPs בניסוי יחיד. ההליך בידוד splenocyte קל מאוד לביצוע, יכולה להסתיים בתוך דקות (בהתאם מספר בעלי חיים), ועם מינימלית מניפולציה בעלי חיים או סלולרי, אשר חיוני כאשר בוחנים את השעון המולקולרי כי כאמור לעיל, פעולות אלה יכול לשבש את התזמון של השעון, כמו גם גנים שבשליטת שעון. התוצאות עבור הליך זה היו מאוד, כמו לשחזור משמעות בין תיגר תאים לאתגר הושגה עם חיות רק שלושה, התוצאות היו בקנה אחד עם העבודה שפורסמו בעבר23 (איור 1). יצוין, כי הגדלת מספר בעלי חיים לכל קבוצה שאולי חשפו הבדלים משמעותיים סטטיסטית בין קבוצת אתגר לבין שליטה (למשל, ODN 1826, Rev-erbα).
לנוע קדימה, בעוד פרוטוקול זה מטפל רק האפקטים חריפה על ביטוי גנים השעון לאחר אתגר PAMP, זה יכול לספק הוכחת העיקרון לחקירה נוספת. לדוגמה, וזמינותו הזה יכול לשמש כמודל לפענח את המנגנונים המולקולריים בנוגע TLR - PAMP אינטראקציה, כיצד זה משפיע על השעון המולקולרי. זה יכול לשמש גם כדי לקבוע את משך הזמן שלוקח את השעון המולקולרי להתאושש לאחר אתגר PAMP, אשר יכול להיקבע על-ידי עריכת ניסוי זמן-קורס (קרי, הערכת ביטוי לאחר פעמים שונות להציב אתגר). כפי שהוזכר לעיל, הניסויים הבאים יכול להתבצע לבחון את האתגר PAMP על אוכלוסיות תא splenocyte ספציפיים. מאז מספר פתוגנים לעורר TLRs מרובים על הזיהום, זה יהיה מעניין להשתמש בפרוטוקול זה לחקור אם מאתגר עם PAMPs מרובות יש אפקט סינרגיסטי על ביטוי גנים שעון.

שעון אב ביונקים, אשר האחראית תנודות 24 שעות ביממה עבור כמעט כל ההיבטים של פיזיולוגיה והתנהגות, הינו ממוקם במרחק העל-תצלובתי (SCN) של ההיפותלמוס1,2. בנוסף, ויסות תהליכים ביולוגיים ברמת organismal מסנכרנת שעון אב היקפיים שעונים הסלולר ברחבי הגוף3,4,5. בעוד המנגנון שעון מולקולרי מורכבת לפחות 3 לולאות משוב תעתיק translational שלובים, הליבה מורכבת של התקופה (Per1-3), קריפטוכרום (Cry1-2), Bmal1, ואת השעון גנים6,7. מלבד שמירה על התזמון מדויק של השעון המולקולרי הליבה, כמה מוצרים ג'ין שעון נלווים (למשל, Rev-erbα , Dbp) גם לווסת את הביטוי של גנים שאינם שעון, קרי, שעון מבוקר גנים (CCGs)6 , 7.
הפונקציונליים שעונים מולקולרית תוארו שונים ברקמות מערכת החיסון (למשל, הטחול ובלוטות הלימפה)8 , תאים (למשל, B תאים, תאים דנדריטים, מקרופאגים)8,9. תאים אלה לזהות ולהגיב פתוגן-הקשורים מולקולרית דפוסים (PAMPs), שנשמרת הרכיבים מיקרוביאלי, באמצעות קולטנים זיהוי מערכת החיסון מולדים כגון אגרה דמוי קולטנים (TLRs)10. עד כה, 13 TLRs תפקודית תוארו, אשר מזהה את המרכיבים חיידקים כגון רכיבי הקיר תא החיידק, השוטוניים חלבון מיקרוביאלי חומצות גרעין10. PAMP, ליפופוליסכריד (LPS), מרכיב דופן התא של חיידקים גראם שליליים מזוהה על-ידי TLR4, הוכח לשנות מקצבים השעון הביולוגי ברמות organismal והן מולקולרית. לדוגמה, ויוו האתגר של LPS מושרה עיכובים photic כמו שלב כפי שנמדד על-ידי פעילות עכברים11 והוביל לביטוי גנים שעון מופחת ב SCN ו הכבד כפי שנקבע על ידי הכלאה בחיי עיר ו- PCR כמותי, בהתאמה, בעוד עכברושים12. לאחר ויוו אתגר עם התקליטים, ניתוח של דם היקפיים אנושי לויקוציטים13 ו רקמת השומן התת עורית14 גילה ביטוי שונה של מספר גנים השעון כפי שנמדדה באמצעות qPCR. לבסוף, שמחוץ LPS באתגרים של מקרופאגים האנושי מקרופאגים הצפק העכבר, הוביל גם שינו שעון ביטוי כפי שהיא נמדדת qPCR14.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול כדי להעריך את השפעת התקליטים PAMPs, ODN1826 (oligonucleotides סינטטי המכיל unmethylated מוטיבים CpG), וחום-נהרג ליסטריה (HKLM), מזוהה על-ידי TLR4, TLR9 ו- TLR2, בהתאמה, על שעון מולקולרי ביטוי גנים ב העכבר splenocytes. הפרוטוקול כולל העכבר ספלנקטומיה, בידוד splenocyte, אתגר, RNA החילוץ, סינתזה cDNA qPCR להעריך ביטוי של מספר גנים שעון. פרוטוקול זה מאפשר רכישת מספר גדול של תאים חיסוניים עם מעט מאוד חיים בזמן או מניפולציה הסלולר, אז מה שיכול להיות מאותגרת שמחוץ עם PAMPs שונים. השעון המולקולרי הוכח לווסת את ההיבטים השונים של ה8,15,של התגובה החיסונית16, לכן, שיבוש של השעון המולקולרי סביר לפגום את הווריאציה תלויי-זמן נאות של התגובה החיסונית. בנוסף, מאז שיבושים של השעון הביולוגי יכול להוביל מבעיות17,18,19,20, זה עשוי להיות עניין לחוקרים לאתגר את splenocytes עם מגוון רחב של מולקולות ולהעריך את השפעתם על השעון.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:796px;" width="795">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:343px;">Frosted slides</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td style="width:137px;">12-550-343</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell strainers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td align="right">22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipopolysaccharide&#160;</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ltrl-eklps</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ODN1826</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>Tlrl-1826-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HKLM</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>Tlrl-hklm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104 or 74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6-well cell culture plate</td>
			<td>Denville</td>
			<td>T1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50 ml tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">15 ml tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td align="right">4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Gene Expression Assays b-actin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Mm00607939_s1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Gene Expression Assays Per2</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Mm00478113_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Gene Expression Assays Rev-erba</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Mm00520708_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Gene Expression Assays Bmal1</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Mm00500226_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Gene Expression Assays Dbp</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Mm00497539_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">qPCR machine StepOnePlus</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td align="right">4369016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroAmp Fast 96-well reaction plate (0.1 ml)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td align="right">4346907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Statistical Analysis Software</td>
			<td>Prism 7.0a</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of mouse splenocytes to assess pathogen-associated molecular pattern influence on clock gene expression

מהתנהגות על ביטוי גנים, השעון הביולוגי לווסת כמעט בכל ההיבטים של פיזיולוגיה. כאן, אנו מציגים מתודולוגיה אתגר splenocytes עכבר עם ליפופוליסכריד פתוגן-הקשורים דפוסי מולקולרית (PAMPs) (LPS), ODN1826, חום-נהרג ליסטריה ולבחון את השפעתם על מולקולרית היממה שעון. בעבר, מחקרים התמקדו בחינת השפעתה של LPS על השעון המולקולרי באמצעות מגוון של גישות ויוו ו- ex-vivo מבחר דגמים (למשל, עכבר, חולדה, האדם). פרוטוקול זה מתאר את הבידוד ואת האתגר של splenocytes, כמו גם את המתודולוגיה כדי להעריך את השעון ג'ין ביטוי האתגר שלאחר באמצעות PCR כמותי. גישה זו ניתן להעריך לא רק את ההשפעה של רכיבים חיידקים על השעון המולקולרי אבל מולקולות אחרות כמו גם זה עשוי לשנות את הביטוי של השעון. גישה זו יכול להיות מנוצל כדי לקנטר לגזרים את המנגנון המולקולרי של כיצד משפיע על האינטראקציה קולטן PAMP-אגרה-כמו שעון הביטוי.

עכברים הוקרבו ב ZT13, splenocytes היו מבודדים והזמנו שמחוץ עם PAMPs LPS, ODN1826, או HKLM. לאחר 3 שעות, RNA היה מבודד, qPCR שימש להערכת רמות הביטוי היחסי של הגנים שעון מולקולרי השעון, Per2, Dbp, ו- Rev-erbα לעומת תאים שליטה לאתגר. לאחר PAMP אתגר, רמות הביטוי השעון לא היו שונים באופן משמעותי מאשר הביטוי בתאים שליטה (איור 1א'). רמות הביטוי Per2 היו גבוהות משמעותית בתאים הם אתגר LPS ו ODN1826 בהשוואה לאתגר פקדים (איור 1B). LPS היה PAMP רק כדי לשנות את הביטוי Rev-erbα , רמות ה-mRNA היו נמוכים משמעותית מאשר בפקדים לאתגר (איור 1C). לבסוף, משמעותית רמות נמוכות יותר של ה-mRNA נצפו עבור Dbp לאחר אתגר עם כל אחד PAMPs בהשוואה הפקדים (איור 1D). בקנה אחד עם מה בעבר הוכח, כל הגנים שעון הקשורים בחן, Dbp ביטוי נוטה להיות המושפעים ביותר על ידי אתגר PAMP23.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58022/58022fig1.jpg"> איור 1 : שעון שינו ביטוי גנים ב splenocytes העכבר לאחר שמחוץ PAMP אתגר. Splenocytes היו מבודדים ב ZT13, הם אתגר LPS, ODN1826 או HKLM. רמות ה-mRNA שעון היחסי (מנורמל ל β-אקטין) נקבעו על ידי qPCR 3 h לאחר אתגר. כל נקודת נתונים מייצג את רמת הביטוי של חיה 1. אומר ניסיוני + SEM ניתנת. p < 0.05, * *p < 0.01, * * *p < 0.001. האתגרים המצוין היו שונים באופן משמעותי מהפקד (תאים לאתגר) לפי חד-כיווני אנובה עם הבדיקה לאחר הוק של Dunnett. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58022/58022fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about The Use of Mouse Splenocytes to Assess Pathogen-associated Molecular Pattern Influence on Clock Gene Expression at JoVE.com

The Use of Mouse Splenocytes to Assess Pathogen-associated Molecular Pattern Influence on Clock Gene Expression

פרוטוקול זה מתאר שיטה באמצעות העכבר splenocytes לגלות דפוסי מולקולריים הקשורים הפתוגן שמשנות ביטוי גנים שעון מולקולרי.

השימוש העכבר Splenocytes כדי להעריך את ההשפעה הקשורים הפתוגן התבנית המולקולרית על ביטוי גנים שעון

From behavior to gene expression, circadian rhythms regulate nearly all aspects of physiology. Here, we present a methodology to challenge mouse ...

the-use-mouse-splenocytes-to-assess-pathogen-associated-molecular

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

7.4K Views.  University of Hartford. פרוטוקול זה מתאר שיטה באמצעות העכבר splenocytes לגלות דפוסי מולקולריים הקשורים הפתוגן שמשנות ביטוי גנים שעון מולקולרי.

Video: The Use of Mouse Splenocytes to Assess Pathogen-associated Molecular Pattern Influence on Clock Gene Expression

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental changes. Considerable progress in our understanding of the tight connection between the circadian clock and most aspects of physiology has been made in the field over the last decade. However, unraveling the molecular basis that underlies the function of the circadian oscillator in humans stays of highest technical challenge. Here, we provide a detailed description of an experimental approach for long-term (2-5 days) bioluminescence recording and outflow medium collection in cultured human primary cells. For this purpose, we have transduced primary cells with a lentiviral luciferase reporter that is under control of a core clock gene promoter, which allows for the parallel assessment of hormone secretion and circadian bioluminescence. Furthermore, we describe the conditions for disrupting the circadian clock in primary human cells by transfecting siRNA targeting CLOCK. Our results on the circadian regulation of insulin secretion by human pancreatic islets, and myokine secretion by human skeletal muscle cells, are presented here to illustrate the application of this methodology. These settings can be used to study the molecular makeup of human peripheral clocks and to analyze their functional impact on primary cells under physiological or pathophysiological conditions.

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

מדידה במקביל של ביטוי גנים השעון הביולוגי ואת הפרשת הורמון בתרביות תאים ראשוניים אדם

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell activation, stress, or stimulation. Single-cell multiplex gene expression enables the simultaneous assessment of tens of genes1,2,3. At the single-cell level, multiplex gene expression determines population heterogeneity4,5. It allows for the distinction of population heterogeneity by determining both the probable mix of diverse precursor stages among mature cells and also the diversity of cell responses to stimuli.
Innate lymphoid cells (ILC) have been recently described as a population of innate effectors of the immune response6,7. In this protocol, cell heterogeneity of the ILC hepatic compartment is investigated during homeostasis.
Currently, the most widely used technique to assess gene expression is RT-qPCR. This method measures gene expression only one gene at a time. Additionally, this method cannot estimate heterogeneity of gene expression, since multiple cells are needed for one test. This leads to the measurement of the average gene expression of the population. When assessing large numbers of genes, RT-qPCR becomes a time-, reagent-, and sample-consuming method. Hence, the trade-offs limit the number of genes or cell populations that can be evaluated, increasing the risk of missing the global picture.
This manuscript describes how single-cell multiplex RT-qPCR can be used to overcome these limitations. This technique has benefited from recent microfluidics technological advances1,2. Reactions occurring in multiplex RT-qPCR chips do not exceed the nanoliter-level. Hence, single-cell gene expression, as well as simultaneous multiple gene expression, can be performed in a reagent-, sample-, and cost-effective manner. It is possible to test cell gene signature heterogeneity at the clonal level between cell subsets within a population at different developmental stages or under different conditions4,5. Working on rare populations with large numbers of conditions at the single-cell level is no longer a restriction.

This protocol describes how to assess the expression of a large array of genes at the clonal level. Single-cell RT-qPCR produces highly reliable results with a strong sensitivity for hundreds of samples and genes.

ביטוי גנים תא בודד באמצעות Multiplex RT-qPCR לאפיון הטרוגניות של אוכלוסיות הלימפה נדירים

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such as cancer. Cell cycle-regulated gene expression analysis depends on cell synchronization into specific phases. Here we describe a method utilizing two complementary synchronization protocols that is commonly used for studying periodic variation of gene expression during the cell cycle. Both procedures are based on transiently blocking the cell cycle in one defined point. The synchronization protocol by hydroxyurea (HU) treatment leads to cellular arrest in late G1/early S phase, and release from HU-mediated arrest provides a cellular population uniformly progressing through S and G2/M. The synchronization protocol by thymidine and nocodazole (Thy-Noc) treatment blocks cells in early mitosis, and release from Thy-Noc mediated arrest provides a synchronized cellular population suitable for G1 phase and S phase-entry studies. Application of both procedures requires monitoring of the cell cycle distribution profiles, which is typically performed after propidium iodide (PI) staining of the cells and flow cytometry-mediated analysis of DNA content. We show that the combined use of two synchronization protocols is a robust approach to clearly determine the transcriptional profiles of genes that are differentially regulated in the cell cycle (i.e. E2F1 and E2F7), and consequently to have a better understanding of their role in cell cycle processes. Furthermore, we show that this approach is useful for the study of mechanisms underlying drug-based therapies (i.e. mitomycin C, an anticancer agent), because it allows to discriminate genes that are responsive to the genotoxic agent from those solely affected by cell cycle perturbations imposed by the agent.

We report two cell synchronization protocols that provide a context for studying events related to specific phases of the cell cycle. We show that this approach is useful for analyzing the regulation of specific genes in an unperturbed cell cycle or upon exposure to agents affecting the cell cycle.

לימוד מחזור גנים ביטוי מוסדר על ידי שני פרוטוקולי סינכרון התא

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an excellent model for rapid assessment of whole transcriptome from whole animal or individual cell populations due to the ease of isolation of RNA from large numbers of animals. Here a protocol for global gene expression analysis in zebrafish embryos using RNA sequencing (RNASeq) is presented. We describe preparation of RNA from whole embryos or from cell populations obtained using cell sorting in transgenic animals. We also describe an approach for analysis of RNASeq data to identify enriched pathways and Gene Ontology (GO) terms in global gene expression data sets. Finally, we provide a protocol for validation of gene expression changes using quantitative reverse transcriptase PCR (qRT-PCR). These protocols can be used for comparative analysis of control and experimental sets of zebrafish to identify novel gene expression changes, and provide molecular insight into phenotypes of interest.

This protocol presents an approach for whole transcriptome analysis from zebrafish embryos, larvae, or sorted cells. We include isolation of RNA, pathway analysis of RNASeq data, and qRT-PCR-based validation of gene expression changes.

הכנת הדוגמא וניתוח של נתונים ביטוי גנים מבוססת RNASeq דג זברה

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

מתודולוגיה סטנדרטי כדי לבדוק באתר המוטגניות כפונקציה של תיקון נקודת מוטציה על ידי CRISPR/Cas9 ו- SsODN בתאי אדם

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a promising vector for gene therapy application. Here, baculovirus is produced by transient transfection of the baculovirus plasmid DNA (bacmid) in an adherent culture of Sf9 cells. Baculovirus is subsequently expanded in Sf9 cells in a serum-free suspension culture until the desired volume is obtained. It is then purified from the culture supernatant using heparin affinity chromatography. Virus supernatant is loaded onto the heparin column which binds baculovirus particles in the supernatant due to the affinity of heparin for baculovirus envelop glycoprotein. The column is washed with a buffer to remove contaminants and baculovirus is eluted from the column with a high-salt buffer. The eluate is diluted to an isotonic salt concentration and baculovirus particles are further concentrated using ultracentrifugation. Using this method, baculovirus can be concentrated up to 500-fold with a 25% recovery of infectious particles. Although the protocol described here demonstrates the production and purification of the baculovirus from cultures up to 1 L, the method can be scaled-up in a closed-system suspension culture to produce a clinical-grade vector for gene therapy application.

In this protocol, baculovirus is produced by transient transfection of baculovirus plasmid into Sf9 cells and amplified in a serum-free suspension culture. The supernatant is purified by heparin affinity chromatography and further concentrated by ultracentrifugation. This protocol is useful for the production and purification of baculovirus for gene therapy application.

ייצור, טיהור של Baculovirus עבור יישום ריפוי גנטי

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling pathway is one of such essential molecular machinery for cell-to-cell communications, which plays key roles in normal development of embryos. This pathway involves a cell-to-cell transfer of oscillatory information with ultradian rhythms, but despite the progress in molecular biology techniques, it has been challenging to elucidate the impact of multicellular interactions on oscillatory gene dynamics. Here, we present a protocol that permits optogenetic control and live monitoring of gene expression patterns in a precise temporal manner. This method successfully revealed that intracellular and intercellular periodic inputs of Notch signaling entrain intrinsic oscillations by frequency tuning and phase shifting at the single-cell resolution. This approach is applicable to the analysis of the dynamic features of various signaling pathways, providing a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Here, we present a protocol to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information by optogenetic control and live monitoring of gene expression. This approach provides a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

שיטת Optogenetic לשלוט ולנתח ג'ין תבניות ביטוי באינטראקציות לתא

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in atherogenesis progression, ischemia, and myocardial infarction. Here we present a methodology of patient genotyping to investigate the post-transcriptional role of the C924T polymorphism (rs4523) situated at the 3&#39; region of the TBXA2 receptor gene. This method relies on DNA extraction from whole blood, polymerase chain reaction (PCR) amplification of the TBXA2 gene portion containing the C924T mutation, and identification of wild type and/or mutant genotypes using a restriction digest analysis, specifically a restriction fragment length polymorphism (RFLP) on agarose gel. In addition, the results were confirmed by sequencing the TBXA2R gene. This method features several potential advantages, such as high efficiency and the rapid identification of the C924T polymorphism by PCR and restriction enzyme analysis. This approach allows a predictive study for plaque formation and atherosclerosis progression by analyzing patient genotypes for the TBXA2R C924T polymorphism. Application of this method has the potential to identify subjects who are more susceptible to atherothrombotic processes, in particular subjects in a high-risk, aspirin-treated group.

In the present study, we describe a methodology to analyze the C924T genotype. The protocol consists of three phases: DNA extraction, amplification by polymerase chain reaction (PCR), and analysis of the restriction fragment length polymorphism (RFLP) on agarose gel.

שיטה ללמוד את פולימורפיזם C924T של הגן לקולטן של Thromboxane A2

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

באמצעות העכבר Oocytes כדי להעריך תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה אני

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

לחקור את השורש Microbiome: שליפת נתונים הקהילה חיידקי מן האדמה, Rhizosphere, Endosphere שורש

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...