Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Fakultät Forschung aus der College of Arts and Sciences Dean Büro an der University of Hartford gewährt.

Während der Studie Tierpflege und Behandlung National Institutes of Health Policy eingehalten, wurden in Übereinstimmung mit Richtlinien und wurden von der University of Hartford institutionelle Animal Tierpflege und Use Committee genehmigt.
(1) die Mitnahme von Tieren
Hinweis: Zwanzig Wochen alten männlichen B6129SF2/J Mäusen werden in der Studie verwendet.
<ol><li>Mitzureißen Mäuse auf ein 12 h Licht (standard Overhead weißes Licht) / 12 h Dunkel-Zyklus für 2 Wochen vor dem Experiment. Hinweis: Hier Zeitgeber Zeit (ZT) 0 entspricht, leuchtet und ZT12 Licht aus, unter Beibehaltung aller anderen Umweltfaktoren (z.B. Nahrungsmittel, Wasser und Raumtemperatur) konstant 21.</li>
</ol>2. Vorbereitung der Instrumente, Kultur, und Herausforderung Medium
<ol><li>Autoklaven-Zange und sezierenden Scheren. Wickeln Sie Paare von satiniertem Objektträger in Aluminiumfolie und Autoklaven.</li>
	<li>Bereiten Sie Kulturmedium durch Zugabe von fetalen bovine Serum (FBS), RPMI 1640, eine Endkonzentration von 10 %. Vorbereitung 10 mL Medium Herausforderung in 50 mL Röhrchen durch Hinzufügen der folgenden PAMPs zu dem Kulturmedium (RPMI mit 10 % FBS); LPS (5 µg/mL), ODN1826 (5 µg/mL), Hitze-getötet Listeria Monocytogenes (108 HKLM/mL), oder ein anderes PAMP in der empfohlenen Konzentration.</li>
	<li>Kultur und Herausforderung Medium auf 37 ° C im Wasserbad erwärmen und etwa 70 mL sterile Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,2) bei Zimmertemperatur aufbewahren.</li>
	<li>Hinzugeben Sie 10 mL Kulturmedium mit 10 mL-Pipette und Pipette Hilfen für eine 50 mL-Tube und Platz auf dem Eis.</li>
	<li>Fügen Sie etwa 30 mL 70 % igem Ethanol zu einem 100 mL Becherglas und Ort endet sezieren Scheren und Pinzetten in das Becherglas, mikrobielle Kontamination zu verhindern.</li>
	<li>Bereiten Sie Lyse Puffer RNA Isolierung durch Zugabe von 10 µL β-Mercaptoethanol (unter einem Abzug vor) zu jeder 1 mL Puffer RLT in ein 50 mL-Tube. Machen Sie nur die Menge, die benötigten (600 µL pro Probe) werden ca. 1 x 106 Zellen bestehend. Hinweis: Der Puffer RLT ist ein Bestandteil der RNA-Extraktion-Kit, das die Bindung der RNA der Kieselsäure Membran unterstützt.</li>
</ol>3. Splenocyte Isolation und Herausforderung
<ol><li>Einschläfern Sie Mäuse zu einem bestimmten Zeitgeber Zeitpunkt über Narkose halten sie in ihrem ursprünglichen Käfig und den Käfig mit einer Durchflussrate von 3 L/min. weiter liefert CO2 für 1 min nach Atmung stoppt CO2 hinzufügen.</li>
	<li>Tod durch zervikale Dislokation zu bestätigen, indem Sie Daumen und Zeigefinger auf beiden Seiten des Halses an der Basis des Schädels. Oder drücken Sie einer Rute an der Basis des Schädels und schnell ziehen (mit der anderen Hand) die Basis für das Heck oder der hinteren Gliedmaßen, Trennung der Halswirbel vom Schädel22zu verursachen.</li>
	<li>Sprühen Sie den Maus-Stamm mit 70 % Ethanol und mit einem Papiertuch abwischen. Platzieren Sie den Mauszeiger auf seinen Rücken und schräg auf der rechten Seite. Schneiden Sie das Fell, Schere mit sezieren, entlang der Maus links über auf halbem Weg zwischen der Vorder- und Hinterbeine.</li>
	<li>Mit Pinzette, schnappen Sie sich das Bauchfell und einen Einschnitt nicht zu beschädigen die Milz aufmerksam machen. Milz mit einer Pinzette entfernen und in eine sterile 50 mL Röhrchen mit etwa 10 mL der Nährmedien auf Eis legen. Wiederholen Sie für die restlichen Tiere. Hinweis: Die Milz ist die Farbe der Kidney-Bohnen, und er ist länger und flacher als der Niere.</li>
	<li>
Übertragen Sie eine Milz mit 2 mL Kulturmedium auf eine kleine sterile Petrischale.
	<ol>
<li>Die Milz durch Schleifen zwischen den mattierten Teil zwei sterile mattierte Folien zu homogenisieren. Halten Sie wenn möglich die Ausgabe und die Zellen im Medium bei der Homogenisierung.</li>
		<li>Einmal gründlich homogenisiert, pipettieren der 2 mL Kulturmedium mit der splenocyten durch ein 40 µm Nylon Zelle Sieb in ein 50 mL-Tube.</li>
		<li>Wiederholen Sie die obigen Schritte für die verbleibenden Milz mit neuen Paare mattierte Folien, 50 mL Röhrchen mit Nährmedium und Zelle Siebe.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hinzugeben Sie 8 mL kalte Kulturmedium zu jedem der 50 mL Röhrchen mit splenocyten für ein Gesamtvolumen von 10 mL/Tube. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen pro Milliliter mit einem Hemocytometer.</li>
	<li>Fügen Sie hinzu, ca. 1 x 106 Zellen/Well Kultur 6-Well-Platten. Anzahl der Bohrungen, die entsprechen der Anzahl der verschiedenen PAMPs für das Experiment verwendet wird und ein Steuerelement fügen Sie auch Zellen hinzu. Fügen Sie 3 mL Kulturmedium oder 3 mL Herausforderung Medium in die jeweiligen Vertiefungen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C in 5 % CO2 für 3 h.</li>
	<li>Kratzen Sie die Zellen aus der Tiefe der nun mit einer 1.000 µL pipettieren Tipp mit einer Mikropipette P1000 verbunden. Die Zellen mit der gleichen 1.000 µL pipettieren Spitze, eine 15 mL Tube-haltigem Medium zu übertragen.</li>
	<li>Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 167 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Den überstand zu entfernen und Waschen der Zelle Pellet mit 5 mL PBS.</li>
	<li>Pellet-Zellen ein zweites Mal bei 167 X g für 5 min, überstand zu entfernen und die Zelle Pellet 600 µL Lyse Puffer hinzufügen, um die Zellen lysiert. Fahren Sie dann mit RNA isoliert.</li>
</ol>(4) RNA Isolation und cDNA Synthese
<ol><li>RNA von splenocyten mit dem RNA-Extraktion-Kit nach Herstellerangaben zu isolieren und die "optionale" auf Spalte DNA Verdauung führen.</li>
	<li>Bestimmen Sie vor cDNA Synthese RNA-Konzentration mit einer Microvolume Spektralphotometer, stellen Sie sicher, dass die Konzentration im optimalen Bereich der RNA (bis zu 2 µg) die cDNA-Synthese-Kit.</li>
	<li>
Synthese cDNA für jede der Proben mit der reversen Transkription-Kit nach Herstellerangaben. Verwenden Sie 10 µL RNA für jede der Proben in eine gesamte Reaktionsvolumen von 20 µL. Fügen Sie am Ende der reversen Transkription (Thermocycler laufen) 20 μL H2O, jede Reaktion.
</li>
	<li>Der standard geschwungenen mit P10 und P20 Mikropipette mRNA von ein paar Kontrollproben (z. B. 5 µL aus 2 Proben für eine Gesamtmenge von 10 µL) in ein 0,5 mL Röhrchen zur Vorbereitung der cDNA Pool zu bauen.<ol>
<li>Fügen Sie 10 µL 2 x Reverse-Transkriptase-master-Mix.</li>
		<li>Fügen Sie bei der Fertigstellung der reversen Transkription 10 µL H2O das Reaktionsgefäß hinzu, dienen als Ausgangspunkt Konzentration ("1") wird in der Verdünnungsreihe für die Standardkurve.</li>
		<li>Führen Sie ein 10-divisibel Verdünnungsreihe (1 bis 10-4) durch Zugabe von Wasser mittels einer Mikropipette P100 oder P200 in vier 0,5 mL Röhrchen benannt 10-410-1, 10-2und 10-345 µL.<ol>
<li>Fügen Sie 5 µL der Ausgangspunkt Konzentration "1" in das erste Rohr (10-1) mit einem P20 Micropipettor, Mix von oben und unten pipettieren mehrmals, dann Transfer 5 µL aus der 10-1 Tube in die Röhre bezeichnet, 10-2 und Mix.</li>
			<li>5 µL mit einer Mikropipette P20 aus der Tube 10-2 in die Röhre bezeichnet 10-3 zu übertragen und zu mischen. 5 µL mit einem P20 Micropipettor aus der Tube 10-3 in das Rohr benannt 10-4 zu übertragen und zu mischen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR)
<ol><li>Bestimmen Sie relative Quantifizierung der mRNA-Niveaus durch qPCR. Innerhalb der experimentellen einzurichten, wählen Sie "Quantifizierung – Relative Standardkurve" und "TaqMan" Chemie. Änderung das Reaktionsvolumen zu 10 µL. Geben Sie die relevante Informationen in das Platte-Layout (z.B.Zielgen Standardkurve, Reporter, usw.).</li>
	<li>Die Reaktion so aufzubereiten, dass es 0,5 µL den Primer/Sonden-Assay, 5 µL der Gen-Expression-master-Mix, H2O 2 µL und 2.5 enthält µL cDNA (10 – 100 ng).<ol>
<li>Bereiten Sie einen master-Mix durch Multiplikation aller vorhergehenden Reagenzien (mit Ausnahme der cDNA) durch die Anzahl der Reaktionen, achten Sie darauf, gehören diejenigen von der Standardkurve Negativkontrollen, Durchführung jeder Reaktion in Duplikat und 2 zusätzliche Reaktionen, die berücksichtigt werden pipettieren Variation.</li>
		<li>Pipettieren 7,5 µL bereit master-Mix in vorgegebenen Vertiefungen in einer Reaktion der 96-Well-Platte mit einer Mikropipette oder einer Mehrkanal-Pipette. Pipettieren 2,5 µL cDNA in den entsprechenden Brunnen für die unbekannten und Standards und 2,5 µL von H2O in die negativ-Kontrolle-Brunnen.</li>
		<li>Beinhalten Sie Primer/Sonden-Assays für die verschiedenen molekularen uhrengene und auch einen Test für eine endogene Steuerung (z. B. β-Aktin).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um relative Ausdruckswerte zu ermitteln, berechnen Sie die mittlere relative Menge für jede Wiederholung, dann für jede Probe, teilen Sie die mittlere relative Menge für das jeweilige Zielgen durch die mittlere relative Menge für β-Aktin.</li>
</ol>6. statistische Analyse
<ol><li>Statistische Analyse-Software verwenden, geben Sie Daten in das Programm unter der Spalte Statistik-Option. Wählen Sie eine einfache ANOVA mit der Dunnett post-hoc-Test zur Bewertung der Unterschiede zwischen den Mittelwerten der Uhr Genexpression nach PAMP Herausforderung gegenüber der Kontrolle.</li>
</ol>

<ol>
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Der Autor hat nichts preisgeben.

Innerhalb dieses Protokolls kann ein Microvolume Spektralphotometer zur Quantifizierung und Beurteilung der Reinheit der verwendeten bei der Bestimmung der Genexpression RNA verwendet werden. Nukleinsäuren absorbieren UV-Licht bei 260 nm, Proteine in der Regel absorbieren Licht bei 280 nm, während andere potentielle Schadstoffe verwendet, während ein RNA-Extraktionsverfahren (z. B. Phenol) nachweisbar bei 230 sind nm. Daher, durch die Beurteilung der Extinktion (A) Verhältnis bei 260/280 nm (RNA zum Protein) und 260/230 nm (RNA-Protein Schadstoffe) die Qualität der RNA beurteilt werden kann. Qualitativ hochwertige RNA hat ein A260/280 Verhältnis zwischen 1,8 – 2.1, als niedrigere Werte Protein Verschmutzung geben. Eine reine RNA-Probe wird eine A260/230 Verhältnis von 2.0 haben.
Bei der Festlegung des relativen Ausdrucks eines Ziel-Gens (d. h. Per2, Uhr, Rev-Erbα und Dbp), eine endogene Steuerung-gen (ein Gen in welcher Ausdruck Ebenen nicht zwischen Proben unterscheiden) muss ebenfalls aktiviert sein. Relative Expression des Zielgens wird dann auf die Expression des Gens endogene Steuerung normalisiert. Unterschiede im Ausgangsmaterial (Anzahl der splenocyten), Variation in Reverse-Transkriptase-Effizienz, unterschiedlichen Zinssätzen der RNA-Abbau, etc., werden durch das endogene Steuerung-gen (β-Aktin in diesem Protokoll) korrigiert werden. Allerdings ist es ratsam zu überprüfen, ob die Behandlung untersucht die Expression des Gens endogene Steuerung nicht verändert wird. Dies kann erreicht werden durch die Beurteilung der β-Aktin Ebenen von mehreren Wiederholungen aus einer gleichen Anzahl von Zellen ( vs. nicht-Behandlung). In der Theorie sollten ihre β-Aktin -Ebenen identisch sein. Ein anderer Ansatz zum Schutz gegen endogene Steuerung Variante wäre, eine Gruppe von endogenen Steuerelemente (z. B. β-Aktin, Gapdh, und 18 s rRNA-Gen) verwenden.
Bei der Untersuchung der Auswirkungen von PAMPs auf der molekularen Uhr muss die Tageszeit als Mäuse werden eingeschläfert und splenocyten werden anschließend herausgefordert berücksichtigt werden. TLR -Expression und Reaktionsfähigkeit zuvor nachweislich zeigen Tageszeit-abhängige Variation8,15, einer Tageszeit wann TLR Reaktionsfähigkeit auf ihrem Höhepunkt ist könnte daher einen größeren Einfluss auf die Uhr. Darüber hinaus Ausdruck der molekularen uhrengene wird auch im Laufe des Tages in splenocyten schwanken, wäre daher eine Reduktion der Clock-gen-Expression durch PAMP Herausforderung bedeutendsten, wenn während der Zeit des Peak Ausdruck9untersucht. Da Dbp und Rev-Erbα gezeigt haben, dass deutliche Ausdruck Gipfeln in splenocyten zeigen und Milz Immunzellen um die hell-dunkel 8,9,23, Interphase 24 (ZT12), in der aktuellen Methode, Zellen isoliert und bei ZT13 um eine größere Chance, bei der Erkennung einer Verringerung dieser Gene in Frage gestellt wurden. Im Gegensatz dazu würde ein PAMP, die Uhr Ausdruck erhöhen könnte wahrscheinlich beobachtet werden wenn sich eine Tageszeit wann Uhr Ausdruck auf dem niedrigsten Stand ist.
Da Mäuse nachtaktive Tiere sind, ist ihre Ruhephase während der lichtperiode, die menschliche Tätigkeit entspricht. Daher werden im Idealfall Mäuse untergebracht werden, in einem Raum mit minimalem Verkehr und eine, die eine weißes Rauschen Maschine enthält, um tagsüber Störungen zu reduzieren, da dies den Tagesrhythmus der Mäuse stören könnten. Darüber hinaus sollte Käfig Änderungen rechtzeitig vor dem Experiment Datum erfolgen. Jede Arbeit in den tierraum (einschließlich Euthanasie der Tiere) während der dunklen Periode sollte unter Rotlicht um nicht zu stören die Rhythmen der Mäuse durchgeführt werden.
Tagaktive Rhythmen unterliegen Reize aus der Umwelt (z. B. Licht oder Lebensmittel), die Zeitgeber bezeichnet werden. Bei einem 12 h Licht/12 h Dunkel-Zyklus, der Zeitgeber (z.B. Licht) setzt die Uhr auf einen 24-Stunden-Zeitraum. Während die meisten tagaktive Rhythmen circadiane sind (d.h., Tagesrhythmus, die in Ermangelung von einem externen Cue auftreten), sie sind nicht wahr zirkadianen Rhythmen, bis sie gezeigt haben, mit einem ungefähren 24-Stunden-Zeitraum unter Konstanten Umweltbedingungen zu schwingen . Daher konnte dieses Verfahren mit Hilfe von Mäusen unter konstanten Bedingungen, die Schleppmittel Mäuse, Hell-Dunkel-Zyklus mit sich bringen würde, wie oben beschrieben, aber dann hielt die Tiere in ständiger Dunkelheit für 3 Tage vor der Probennahme durchgeführt werden. Diese Art von Experiment bezeichnet man ein dunkel-dunkel (DD) experimentieren und der Zeitpunkt der Probenahme würde als CT (circadiane Zeit) nicht ZT bezeichnet werden.
Während diese Methode PAMPs, die Clock-gen-Expression in splenocyten zu ändern identifizieren kann, dauert es nicht zu berücksichtigen wie dieser PAMPs Hauptuhr oder peripheren Uhren im ganzen Körper beeinflussen. Da die Milz eine heterogene Bevölkerung der Zellen zusammengesetzt ist, könnte einzelne PAMPs jeden Zelltyp unterschiedlich auswirken. Beispielsweise unterscheiden sich Tlr9 Ausdruck Rhythmen in der Maus Milz zwischen DCs15, splenocyten, Makrophagen und B-Zellen. Darüber hinaus Tlr1, Tlr7, Tlr3und Tlr4, Tlr6und Tlr8 wichtige tägliche Schwingungen in einer festhaftenden Splenocyte Bevölkerung angezeigt aber nur Tlr2 und Tlr6 erleben Sie täglich Schwingungen in angereicherten Milz Makrophagen24. Daher, um das Ergebnis von einem Foulspiel an einzelnen Zelltypen zu untersuchen, Zellen isoliert werden konnte über magnetischen Zellsortierung, wie zuvor9,15 beschrieben und dann anschließend in Frage gestellt. Darüber hinaus schwankt die Milz Zellpopulation über die täglichen Zyklus, der auch eine Rolle in der Empfindlichkeit zu einer bestimmten PAMP und weiteren Auswirkungen auf die Uhr8spielen könnte.
Diese Methode ermöglicht die Isolation einer großen Anzahl von Immunzellen, die überwiegend der B Zellen (~ 58 %), T Zellen (~ 21 %), Dendritische Zellen (~ 5 %) und Makrophagen (~ 4 %)25bestehen. Die große Anzahl von Zellen bietet die Möglichkeit, splenocyten mit einer Vielzahl von PAMPs in einem einzigen Experiment herauszufordern. Das Splenocyte-Isolierung-Verfahren ist sehr einfach durchzuführen, können Sie innerhalb von Minuten (abhängig von der Anzahl der Tiere) und mit minimalen Tier- oder zelluläre Manipulation, was wesentlich ist bei der Untersuchung der molekularen Uhr weil abgeschlossen werden wie bereits erwähnt, Diese Maßnahmen können das Timing der Uhr sowie Uhr gesteuert Gene stören. Die Ergebnisse dieses Verfahrens wurden sehr reproduzierbar, wie Bedeutung zwischen herausgefordert und unangefochtene Zellen wurde mit nur drei Tiere erreicht und die Ergebnisse stimmten mit zuvor veröffentlichte Arbeit23 (Abbildung 1). Es sei darauf hingewiesen, dass die Zahl der Tiere pro Gruppe statistisch signifikante Unterschiede zwischen einem Challenge-Gruppe und Kontrolle (z. B. ODN 1826 und Rev-Erbα) offenbart haben könnte.
Voran, während dieses Protokoll nur die akuten Wirkungen auf die Uhr Genexpression nach PAMP Herausforderung anspricht, kann es grundsätzlich zur weiteren Untersuchung nachweisen. Beispielsweise könnte dieser Assay als Modell verwendet werden, um zu entschlüsseln, die molekularen Mechanismen über TLR - PAMP Interaktion und wie es die molekulare Uhr beeinflusst. Es könnte auch verwendet werden, um die Länge der Zeit zu bestimmen, was man für die molekulare Uhr braucht, nach einem Zweikampf PAMP, die ermittelt werden konnte, durch die Durchführung eines Experiments Zeitverlauf (d. h. Beurteilung Ausdruck nach unterschiedliche Zeiten Herausforderung post) zu erholen. Wie oben erwähnt, können nachfolgende Experimente durchgeführt werden, um PAMP Herausforderung auf bestimmte Splenocyte-Zell-Populationen zu untersuchen. Da mehrere Erreger mehrere TLRs auf Infektion fördern, wäre es interessant, dieses Protokoll zu verwenden, um zu untersuchen, ob anspruchsvolle mit mehreren PAMPs einen synergistischen Effekt auf die Genexpression der Uhr haben.

Der master-Clock bei Säugetieren, der 24 h Schwingungen für fast alle Aspekte der Physiologie und Verhalten orchestriert, liegt in den suprachiasmatischen Kern (SCN) des Hypothalamus1,2. Neben der Regulierung der biologischen Prozesse auf organismal Ebene, synchronisiert der master-Clock auch periphere zelluläre Uhren im gesamten Körper3,4,5. Während der molekularen Uhr Maschinen aus mindestens drei ineinandergreifenden transkriptionelle translationale Feedback-Schleifen besteht, besteht der Kern der Periode (Per1-3), Cryptochrome (Cry1-2), Bmal1, und Uhr Gene6,7. Neben der Pflege des genaue Timing der molekularen Uhr Kern, einige ergänzende Uhr Genprodukte (z. B. Rev-Erbα und Dbp) regulieren auch Ausdruck des nicht-uhrengene, d. h. Uhr kontrollierten Gene (KVG)6 , 7.
Funktionelle Molekulare Uhren wurden in verschiedenen immun Gewebe (z. B. Milz und Lymphknoten)8 und Zellen (z. B. B Zellen, Dendritische Zellen, Makrophagen)8,9beschrieben. Diese Zellen erkennen und reagieren auf Pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMPs), konservierte mikrobielle Komponenten über angeborene immune Anerkennung Rezeptoren wie Toll-Like-Rezeptoren (TLR)10. Bisher wurden 13 funktionale TLRs beschrieben, erkennen die mikrobielle Bestandteile wie bakterielle Zellwand-Komponenten, flagellar Protein und mikrobielle Nukleinsäuren10. PAMP, Lipopolysaccharid (LPS), eine Zellwand-Komponente von Gram-negativen Bakterien erkannt von TLR4, nachweislich zirkadianen Rhythmen auf organismal und molekularer Ebene zu verändern. Z. B. in Vivo Herausforderung der LPS induzierte photic-ähnliche Phase Verzögerungen Aktivität in Mäusen11 gemessen und führte zu reduzierten Uhr gen-Expression in der SCN und Leber in Situ Hybridisierung und quantitative PCR bestimmt, bzw. in Ratten12. Nach einer in-Vivo -Herausforderung mit LPS ergab die Analyse der menschlichen peripheren Blut Leukozyten13 und subkutanem Fettgewebe14 veränderte Expression von mehreren uhrengene gemessen über qPCR. Zu guter Letzt geändert ex Vivo LPS Herausforderungen des menschlichen Makrophagen und Maus peritonealen Makrophagen, führte auch zu Uhr Ausdruck qPCR14gemessen.
Hier beschreiben wir ein Protokoll, um den Einfluss der PAMPs LPS, ODN1826 (synthetische Oligonukleotide mit unmethylated CpG Motive), zu bewerten und Hitze getötet Listeria Monocytogenes (HKLM), anerkannt von TLR4, TLR9 und TLR2, bzw. auf Molekulare Uhr Genexpression in Maus splenocyten. Das Protokoll enthält Maus Splenektomie, Splenocyte Isolierung und Herausforderung, RNA Extraktion, cDNA Synthese und qPCR Ausdruck mehrere uhrengene bewerten. Dieses Protokoll ermöglicht für den rechtzeitigen Erwerb einer großen Anzahl von Immunzellen mit sehr kleinen Tier oder zellulären Manipulation, die dann ex Vivo mit verschiedenen PAMPs in Frage gestellt. Die molekulare Uhr hat gezeigt, dass verschiedene Aspekte der Immunantwort8,15,16modulieren, Störung der molekularen Uhr beeinträchtigt daher höchstwahrscheinlich die richtige zeitabhängige Variation von der Immunantwort. Darüber hinaus da Störungen des zirkadianen Rhythmen zu schweren Pathologien17,18,19,20führen können, kann es von Interesse für Forscher, splenocyten mit einer breiten Palette von Herausforderung sein Moleküle und deren Einfluss auf die Uhr zu beurteilen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:796px;" width="795">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:343px;">Frosted slides</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td style="width:137px;">12-550-343</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell strainers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td align="right">22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipopolysaccharide&#160;</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ltrl-eklps</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ODN1826</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>Tlrl-1826-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HKLM</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>Tlrl-hklm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104 or 74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6-well cell culture plate</td>
			<td>Denville</td>
			<td>T1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50 ml tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">15 ml tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td align="right">4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Gene Expression Assays b-actin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Mm00607939_s1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Gene Expression Assays Per2</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Mm00478113_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Gene Expression Assays Rev-erba</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Mm00520708_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Gene Expression Assays Bmal1</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Mm00500226_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Gene Expression Assays Dbp</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Mm00497539_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">qPCR machine StepOnePlus</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td align="right">4369016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroAmp Fast 96-well reaction plate (0.1 ml)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td align="right">4346907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Statistical Analysis Software</td>
			<td>Prism 7.0a</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of mouse splenocytes to assess pathogen-associated molecular pattern influence on clock gene expression

Vom Verhalten, Genexpression regulieren ZIRKADIANE Rhythmen fast alle Aspekte der Physiologie. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode zur Maus splenocyten mit der Pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMPs) Lipopolysaccharid (LPS), ODN1826 und Hitze getötet Listeria Monocytogenes hinterfragen und prüfen ihre Wirkung auf die molekularen zirkadianen Uhr. Bisher haben Studien untersuchen den Einfluss von LPS auf der molekularen Uhr mit einer Vielzahl von in Vivo und ex Vivo Ansätze aus einem Sortiment von Modellen (z. B. Maus, Ratte und Mensch) fokussiert. Dieses Protokoll beschreibt die Isolation und die Herausforderung des splenocyten sowie die Methodik zur Uhr Gen Ausdruck nach Herausforderung über quantitative PCR zu beurteilen. Dieser Ansatz lässt sich nicht nur der Einfluss der mikrobielle Komponenten auf der molekularen Uhr aber auch andere Moleküle zu bewerten, die Ausdruck der Uhr ändern kann. Dieser Ansatz könnte genutzt werden, um die molekularen Mechanismen wie PAMP-Toll-Like-Rezeptor-Interaktion beeinflusst Uhr Ausdruck auseinander zu necken.

Mäuse wurden geopfert, bei ZT13, splenocyten wurden isoliert und ex Vivo mit den PAMPs LPS, ODN1826 oder HKLM in Frage gestellt. Nach 3 h RNA wurde isoliert und qPCR wurde verwendet, um relative Ausdruck Niveaus der molekularen uhrengene zu beurteilen, die Uhr, Per2, Dbp, und Rev-Erbα im Vergleich zu unangefochten Kontrollzellen. Nach PAMP Herausforderung waren Uhr Ausdruck Niveaus nicht wesentlich anders als Ausdruck in der Kontrollzellen (Abb. 1A). Per2 Ausdruck Niveaus waren in den Zellen vor der Herausforderung, LPS und ODN1826 im Vergleich zu unangefochten Steuerelemente (Abbildung 1B) deutlich erhöht. LPS war die einzige PAMP, Rev-Erbα Ausdruck zu verändern wie mRNA-Niveaus deutlich niedriger als in den unangefochtenen Kontrollen (Abbildung 1C). Zu guter Letzt wurden deutlich niedrigeren mRNA Dbp nach Herausforderung mit jedem PAMPs im Vergleich zu den Kontrollen (Abbildung 1D) beobachtet. Was zuvor ist, aus all den verbundenen uhrengene untersucht gezeigt worden, Dbp Ausdruck tendenziell PAMP Herausforderung23am stärksten betroffen werden, entsprechen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58022/58022fig1.jpg"> Abbildung 1 : Uhr veränderten Genexpression in Maus splenocyten nach ex-Vivo PAMP Herausforderung. Splenocyten wurden bei ZT13 isoliert und mit LPS, ODN1826 oder HKLM in Frage gestellt. Relative Uhr mRNA-Niveaus (normiert auf β-Aktin) wurden vom qPCR 3 h nach Herausforderung festgelegt. Jeder Datenpunkt stellt Ausdruck für 1 Tier dar. Experimentelle Mittel + SEM sind gegeben. p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Die angegebenen Herausforderungen unterschieden sich signifikant von der Steuerung (unangefochten Zellen) wie pro One-Way ANOVA mit der Dunnett post-hoc-Test. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58022/58022fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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The Use of Mouse Splenocytes to Assess Pathogen-associated Molecular Pattern Influence on Clock Gene Expression

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik, mit der Maus splenocyten, um Pathogen-assoziierte molekulare Muster zu entdecken, die molekulare Uhr Genexpression verändern.

Die Nutzung von Maus Splenocyten, Pathogen-assoziierte molekulare Muster Einfluss auf die Genexpression Uhr abzuschätzen

From behavior to gene expression, circadian rhythms regulate nearly all aspects of physiology. Here, we present a methodology to challenge mouse ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

7.4K Aufrufe.  University of Hartford. Dieses Protokoll beschreibt eine Technik, mit der Maus splenocyten, um Pathogen-assoziierte molekulare Muster zu entdecken, die molekulare Uhr Genexpression verändern.

Serie: The Use of Mouse Splenocytes to Assess Pathogen-associated Molecular Pattern Influence on Clock Gene Expression

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental changes. Considerable progress in our understanding of the tight connection between the circadian clock and most aspects of physiology has been made in the field over the last decade. However, unraveling the molecular basis that underlies the function of the circadian oscillator in humans stays of highest technical challenge. Here, we provide a detailed description of an experimental approach for long-term (2-5 days) bioluminescence recording and outflow medium collection in cultured human primary cells. For this purpose, we have transduced primary cells with a lentiviral luciferase reporter that is under control of a core clock gene promoter, which allows for the parallel assessment of hormone secretion and circadian bioluminescence. Furthermore, we describe the conditions for disrupting the circadian clock in primary human cells by transfecting siRNA targeting CLOCK. Our results on the circadian regulation of insulin secretion by human pancreatic islets, and myokine secretion by human skeletal muscle cells, are presented here to illustrate the application of this methodology. These settings can be used to study the molecular makeup of human peripheral clocks and to analyze their functional impact on primary cells under physiological or pathophysiological conditions.

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

Parallel Messung von Circadian Clock Genexpression und Hormon-Sekretion in primären humanen Zellkulturen

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Forschung

Genetik

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell activation, stress, or stimulation. Single-cell multiplex gene expression enables the simultaneous assessment of tens of genes1,2,3. At the single-cell level, multiplex gene expression determines population heterogeneity4,5. It allows for the distinction of population heterogeneity by determining both the probable mix of diverse precursor stages among mature cells and also the diversity of cell responses to stimuli.
Innate lymphoid cells (ILC) have been recently described as a population of innate effectors of the immune response6,7. In this protocol, cell heterogeneity of the ILC hepatic compartment is investigated during homeostasis.
Currently, the most widely used technique to assess gene expression is RT-qPCR. This method measures gene expression only one gene at a time. Additionally, this method cannot estimate heterogeneity of gene expression, since multiple cells are needed for one test. This leads to the measurement of the average gene expression of the population. When assessing large numbers of genes, RT-qPCR becomes a time-, reagent-, and sample-consuming method. Hence, the trade-offs limit the number of genes or cell populations that can be evaluated, increasing the risk of missing the global picture.
This manuscript describes how single-cell multiplex RT-qPCR can be used to overcome these limitations. This technique has benefited from recent microfluidics technological advances1,2. Reactions occurring in multiplex RT-qPCR chips do not exceed the nanoliter-level. Hence, single-cell gene expression, as well as simultaneous multiple gene expression, can be performed in a reagent-, sample-, and cost-effective manner. It is possible to test cell gene signature heterogeneity at the clonal level between cell subsets within a population at different developmental stages or under different conditions4,5. Working on rare populations with large numbers of conditions at the single-cell level is no longer a restriction.

This protocol describes how to assess the expression of a large array of genes at the clonal level. Single-cell RT-qPCR produces highly reliable results with a strong sensitivity for hundreds of samples and genes.

Einzellige Gene Expression Mit Multiplex-RT-qPCR zum Charakterisieren Heterogene Rare Lymphatische Populations

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such as cancer. Cell cycle-regulated gene expression analysis depends on cell synchronization into specific phases. Here we describe a method utilizing two complementary synchronization protocols that is commonly used for studying periodic variation of gene expression during the cell cycle. Both procedures are based on transiently blocking the cell cycle in one defined point. The synchronization protocol by hydroxyurea (HU) treatment leads to cellular arrest in late G1/early S phase, and release from HU-mediated arrest provides a cellular population uniformly progressing through S and G2/M. The synchronization protocol by thymidine and nocodazole (Thy-Noc) treatment blocks cells in early mitosis, and release from Thy-Noc mediated arrest provides a synchronized cellular population suitable for G1 phase and S phase-entry studies. Application of both procedures requires monitoring of the cell cycle distribution profiles, which is typically performed after propidium iodide (PI) staining of the cells and flow cytometry-mediated analysis of DNA content. We show that the combined use of two synchronization protocols is a robust approach to clearly determine the transcriptional profiles of genes that are differentially regulated in the cell cycle (i.e. E2F1 and E2F7), and consequently to have a better understanding of their role in cell cycle processes. Furthermore, we show that this approach is useful for the study of mechanisms underlying drug-based therapies (i.e. mitomycin C, an anticancer agent), because it allows to discriminate genes that are responsive to the genotoxic agent from those solely affected by cell cycle perturbations imposed by the agent.

We report two cell synchronization protocols that provide a context for studying events related to specific phases of the cell cycle. We show that this approach is useful for analyzing the regulation of specific genes in an unperturbed cell cycle or upon exposure to agents affecting the cell cycle.

Das Studium der Zellzyklus-regulierten Genexpression durch zwei komplementäre Zellsynchronisationsprotokolle

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an excellent model for rapid assessment of whole transcriptome from whole animal or individual cell populations due to the ease of isolation of RNA from large numbers of animals. Here a protocol for global gene expression analysis in zebrafish embryos using RNA sequencing (RNASeq) is presented. We describe preparation of RNA from whole embryos or from cell populations obtained using cell sorting in transgenic animals. We also describe an approach for analysis of RNASeq data to identify enriched pathways and Gene Ontology (GO) terms in global gene expression data sets. Finally, we provide a protocol for validation of gene expression changes using quantitative reverse transcriptase PCR (qRT-PCR). These protocols can be used for comparative analysis of control and experimental sets of zebrafish to identify novel gene expression changes, and provide molecular insight into phenotypes of interest.

This protocol presents an approach for whole transcriptome analysis from zebrafish embryos, larvae, or sorted cells. We include isolation of RNA, pathway analysis of RNASeq data, and qRT-PCR-based validation of gene expression changes.

Probenvorbereitung und Analyse der RNASeq-basierte Genexpressionsdaten von Zebrafisch

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

Eine Standardmethodik, vor-Ort-Mutagenität als Funktion der Punktmutation Reparatur katalysiert durch CRISPR/Cas9 und SsODN in den menschlichen Zellen zu untersuchen

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a promising vector for gene therapy application. Here, baculovirus is produced by transient transfection of the baculovirus plasmid DNA (bacmid) in an adherent culture of Sf9 cells. Baculovirus is subsequently expanded in Sf9 cells in a serum-free suspension culture until the desired volume is obtained. It is then purified from the culture supernatant using heparin affinity chromatography. Virus supernatant is loaded onto the heparin column which binds baculovirus particles in the supernatant due to the affinity of heparin for baculovirus envelop glycoprotein. The column is washed with a buffer to remove contaminants and baculovirus is eluted from the column with a high-salt buffer. The eluate is diluted to an isotonic salt concentration and baculovirus particles are further concentrated using ultracentrifugation. Using this method, baculovirus can be concentrated up to 500-fold with a 25% recovery of infectious particles. Although the protocol described here demonstrates the production and purification of the baculovirus from cultures up to 1 L, the method can be scaled-up in a closed-system suspension culture to produce a clinical-grade vector for gene therapy application.

In this protocol, baculovirus is produced by transient transfection of baculovirus plasmid into Sf9 cells and amplified in a serum-free suspension culture. The supernatant is purified by heparin affinity chromatography and further concentrated by ultracentrifugation. This protocol is useful for the production and purification of baculovirus for gene therapy application.

Herstellung und Reinigung des Baculovirus für Gentherapie Anwendung

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling pathway is one of such essential molecular machinery for cell-to-cell communications, which plays key roles in normal development of embryos. This pathway involves a cell-to-cell transfer of oscillatory information with ultradian rhythms, but despite the progress in molecular biology techniques, it has been challenging to elucidate the impact of multicellular interactions on oscillatory gene dynamics. Here, we present a protocol that permits optogenetic control and live monitoring of gene expression patterns in a precise temporal manner. This method successfully revealed that intracellular and intercellular periodic inputs of Notch signaling entrain intrinsic oscillations by frequency tuning and phase shifting at the single-cell resolution. This approach is applicable to the analysis of the dynamic features of various signaling pathways, providing a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Here, we present a protocol to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information by optogenetic control and live monitoring of gene expression. This approach provides a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Eine optogenetische Methode zu kontrollieren und analysieren gen Expressionsmuster in Zell-Zell-Interaktionen

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in atherogenesis progression, ischemia, and myocardial infarction. Here we present a methodology of patient genotyping to investigate the post-transcriptional role of the C924T polymorphism (rs4523) situated at the 3&#39; region of the TBXA2 receptor gene. This method relies on DNA extraction from whole blood, polymerase chain reaction (PCR) amplification of the TBXA2 gene portion containing the C924T mutation, and identification of wild type and/or mutant genotypes using a restriction digest analysis, specifically a restriction fragment length polymorphism (RFLP) on agarose gel. In addition, the results were confirmed by sequencing the TBXA2R gene. This method features several potential advantages, such as high efficiency and the rapid identification of the C924T polymorphism by PCR and restriction enzyme analysis. This approach allows a predictive study for plaque formation and atherosclerosis progression by analyzing patient genotypes for the TBXA2R C924T polymorphism. Application of this method has the potential to identify subjects who are more susceptible to atherothrombotic processes, in particular subjects in a high-risk, aspirin-treated group.

In the present study, we describe a methodology to analyze the C924T genotype. The protocol consists of three phases: DNA extraction, amplification by polymerase chain reaction (PCR), and analysis of the restriction fragment length polymorphism (RFLP) on agarose gel.

Eine Methode, um den C924T-Polymorphismus von Thromboxan-A2-Rezeptor-Gens zu studieren

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

Mit Maus Eizellen menschliche Gen-Funktion während der Meiose zu beurteilen ich

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

Die Wurzel Mikrobiom zu erkunden: Extrahieren von Bakteriengemeinschaft Daten aus dem Boden, die Rhizosphäre und die Wurzel Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...