Nitya Jain נתמכה על ידי NIH/NIAID הקריירה המעבר פרס 1K22AI116661-01.

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו עם האישור של ובציות על טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) בבית החולים הכללי במסצ'וסטס.
התראה: פרוטוקול זה כרוכה בשימוש של class 3b לייזר (LG3). משקפי בטיחות לייזר LG3 תמיד חייב לשמש בעת הפעלת הלייזר הזה. חייב להיות במעקב הנחיות בטיחות והדרכה המתאימים כדי למנוע את הסיכון לפציעות.
1. עיצוב והרכבה של לייזר
<ol><li>לחבר את דיודות פולטות אור (LED) (405 ננומטר, 19.3 mW, אמא 1400, מצמידים סיבים) LED הנהג באמצעות הכבל המחבר של 4 פינים M8 המגיע מחובר ה-LED. בזהירות להדק את הבורג כדי להדק את הקשר.</li>
	<li>לפני חיבור כבל תיקון ה optogenetics ה-LED, להחזיק את המחבר פתיחה של ה-LED עד האור כדי להבטיח שם הביתור לא נראה לעין. תנשוף על החור כדי למנוע כל הפרעה במידת הצורך, הכנס את כבל תיקון optogenetics לתוך הפתח.</li>
	<li>לחבר את הצינורית סיבים אופטיים הכבל תיקון optogenetics על-ידי הוספת את הצינורית אחד מהקצוות של השרוול המחבר. לצרף את הקצה השני של השרוול מחבר כבל תיקון.  מספיק ללחוץ כדי לאבטח את הקשר אך הקפד לא לכופף או לפרוץ את סיב אופטי הצינורית. הערה: הצינורית סיב אופטי סיבים שביר הוא מכוסה את המכסה המגן בכל פעם הלייזר אינו בשימוש.</li>
	<li>הגדר את הנהג LED למצב (CW) רציף wave עם הידית התאמה רציפה-0 והגבול הנוכחי מוגדר כ- 1.2 א</li>
</ol>2. Photoconversion של תאים במעי הגס
הערה: זכר ונקבה עכברים נחשפו intracolonic 405 ננומטר אור 1-2 ימים לאחר הלידה שלהם, הוקרבו לפני שבוע 1 של גיל.
<ol><li>לאבטח ממיקום כהה עם גישה לשקע חשמל. הנהג LED מתחברים לשקע. הערה: הליך זה מבוצע באור לבן מינימלית כמו חשיפה ממושכת של העכברים תאורת עלול לגרום photoconversion לא רצויים של תאים. אור אדום משמש כחלופה. התראה: השלב הבא כרוכה בשימוש של חיה הרדמה. הממשל של ההרדמה מתבצעת בשכונה Class II או באמצעות מערכת הניקוי המתאים אחרת. שאיפת ההרדמה עלול לגרום סחרחורת, נמנום או אפילו חוסר הכרה.</li>
	<li>עזים ומתנגד העכבר על ידי חשיפה לאיזופלוריין 4-5% 100% O2 בתיבת אינדוקציה. לאמת עומק נאותה של הרדמה על ידי בחוזקה צובט כפה האחוריות (ללא תגובה). לשמור על הרדמה באמצעות קונוס האף כ 2% איזופלוריין. למנוע חשיפה המטפל איזופלוריין על ידי שימוש של המנוע המתאים או התקן הניקוי הרדמה.</li>
	<li>מיקום העכבר anesthetized לחשיפה intracolonic באמצעות 1 יד על עורפה האחורי של העכבר בעדינות עם האגודל והאצבע. . תהפוך את העכבר כדי לחשוף את הבטן שחרר את אחיזת אם העכבר מתחיל. לאבד את צבעו ורוד או אם קצב הנשימות שלה מתחיל להאט. אבטח את הזנב של העכבר בין כביש הטבעת של האצבעות.</li>
	<li>עם היד השנייה, להסיר את המכסה המגן הצינורית. תוך שמירה על ציר הארוך של הצינורית במקביל קו האמצע של העכבר, הכנס בעדינות את הצינורית סיבים אופטיים דרך פי הטבעת לתוך המעי הגס כך כל 5 מ מ של סיבים אופטיים הם בתוך העכבר. הערה: הליך זה מתבצע לאט ובזהירות, לא כדי לנקב את הקיר חוקן. דקה נענוע ומתפתל של הצינורית עזרי קידום לתוך המעי הגס.</li>
	<li>דון את משקפי בטיחות ולהגדיל את הלייזר הנוכחי לערך המרבי (כל הדרך עם כיוון השעון). לאשר הנוכחות של אור UV על ידי הסתכלות על הבטן שקוף של העכבר. הערה: משקפי בטיחות לייזר LG3 באופן דרמטי להפחית הניראות. יש לסייע עמית (ללבוש ציוד מגן) עוטה את משקפי המגן, הפעלת הלייזר.</li>
	<li>לחשוף את המעי הגס כדי אור לייזר עבור סכום כולל של 2 דק להחלפה הצינורית כ- 1 מ מ לכל 30 s כדי למקסם את האזור luminal חשוף לאור. בסוף 2 דקות, כבה את הלייזר.</li>
	<li>אט-אט להסיר את הצינורית של העכבר. לאחר התאוששות מהרדמה בכלוב חמים ריק, להחזיר את העכבר לכלוב הביתה.</li>
</ol>3. בידוד של לימפוציטים מעיים
<ol><li>להכנת 1 ליטר של ההאנק פתרון מאוזן מלח/עגל סרום (HBSS/CS) המאגר, 200 מ ל רצועת אפיתל המאגר, 500 מ"ל של שטיפת מדיה ו- 200 מ ל חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA)-ללא שטיפת המדיה. הערה: אמצעי האחסון ריאגנט מחושבות עבור גודל דגימה של 9.<ol>
<li>להפוך את המאגר HBSS/מדעי המחשב (HBSS; 5% CS) על-ידי הוספת 50 מ של CS עד 950 מ"ל של HBSS. אחסן אותו בקרח.</li>
		<li>הכנת המאגר רצועת אפיתל [HBSS CS 5% 1 מ dithiothreitol (DTT); 5 מ מ EDTA; 15 מ מ- 4-(2-Hydroxyethyl)-piperazine-1-ethanesulfonic-חומצה (HEPES) (pH 7.2-7.5)] על-ידי הוספת 10 מ"ל של CS, 200 µL של 1 מ' DTT, 2 מ של EDTA 0.5 M ו- 3 מ של 1 מ' HEPES מאגר 185 מ של HBSS. מקום המאגר רצועת אפיתל באמבט מים 37 º C.</li>
		<li>להפוך את המדיה לשטוף (HBSS; 1% CS 1 מ"מ EDTA) על-ידי הוספת 5 מ ל CS 1 מ"ל של 0.5 M EDTA 494 מ של HBSS. אחסן אותו בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>להכין ללא EDTA שטיפת המדיה (15 מ מ HEPES; HBSS; 1% CS) על-ידי הוספת 2 מ"ל של CS ו- 3 מ"ל של 1 מ' HEPES 195 מ של HBSS. אחסן אותו בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>להפוך את מאגר FACS [1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) (ה-pH = 7.2); CS 2%] על-ידי הוספת 10 מ"ל של CS 490 מ של PBS. אחסן אותו בקרח.</li>
	</ol></li>
	<li>להכין את המאכל אוסף רקמה על-ידי הצבת מסננת תא מיקרומטר 70 בתוך לצלחת תרבות 60 x 10 מ מ. להוסיף 10 מ ל מאגר HBSS/מדעי המחשב (HBSS; מאגר CS 5% שבוצעו בשלב 3.1.1 ומאוחסנים על קרח) לצלחת ומניחים אותו על הקרח.</li>
	<li>המתת חסד את העכבר באמצעות מנת יתר של איזופלוריין בשאיפה באמצעות ניקוי המתאים של הרדמה (כ 3 דקות חשיפה > איזופלוריין 4% באוויר חדר או ב- 100% O2). לאחר הפסקת לכאורה של נשימה, רפלקס תנועה, לוודא העדר כאב עמוק על-ידי בחוזקה צובט כפה האחוריות (באמצעות מלקחיים מומלץ). ודא המתת החסד באמצעות עריפת ראש באמצעות זוג מספריים כירורגיים או תער חדש. הערה: נקע בצוואר הרחם לא מומלץ בשלב זה עקב גודל גיל של החיה. שיטות אלה תואמים ההנחיות AVMA 2013 על המתת חסד ואושרו על-ידי IACUC MGH.</li>
	<li>הקציר המעי הגס באמצעות מלקחיים נקי ומספריים כדי לפתוח את הבטן. משקפים את המעיים לצד 1 של הבטן של העכבר כדי לחשוף את המעי הגס. להסיר את כל המעי הגס על ידי הראשון transecting זה רק הדיסטלי (לכיוון פי הטבעת) כדי המעי. לאחר מכן, בזמן אוחז בחוזקה המעי הגס עם מלקחיים, להשתמש במספריים לחתוך דרך השופכה אל החלחולת. חותכים את המעי הגס כמו קרוב לפי הטבעת ככל האפשר. הקציר הטחול לאחר הסרת המעי הגס (ראה שלבים 4.1-4.2 להלן). הערה: בזמן פרוטוקול photoconversion רק מטרות ~ 25% של המעי הגס של היילוד (5 מ מ הצינורית סיבים אופטיים), המעי הגס כולו האיסוף כדי לסייע בבידוד התא.</li>
	<li>ניקוי המעי הגס באמצעות מלקחיים כדי לדחוף את תוכן המעי הגס, על גבי מגבת נייר יבש. Homogenize הרקמה באמצעות סכיני קוצצים המעי הגס לתוך עיסה על השער של צלחת תרבות ואז להעביר את הדבק הזה מסננת תאים בצלוחית הפטרי.</li>
	<li>להוסיף פס מגנטי זמן מערבבים נקי 8 מ"מ ל מסננת ולמקם את המנה על צלחת 9-מיקום פגים. להגדיר את מהירות בר מגנטי מערבבים עד 800 סל ד, דגירה את התאים עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. לבטל את המאגר וחזור בכביסה באמצעות 10 מ"ל של HBSS/CS (את HBSS; מאגר CS 5% שבוצעו בשלב 3.1.1 ומאוחסנים על הקרח). לבטל את המאגר במשרד בסוף לשטוף.</li>
	<li>מביצועם בתאי אפיתל על-ידי הוספת 10 מ"ל של מאגר prewarmed רצועת אפיתל (HBSS את CS 5% 1 מ"מ DTT; 5 מ מ EDTA; 15 מ מ HEPES [pH 7.2-7.5] מאגר שבוצעו בשלב 3.1.2 ומאוחסנים באמבט מים 37 ° C) כדי מסננת התא ומערבבים במהירות של 800 סל ד למשך 30 דקות ב- 3 החממה 7 ° C. בסוף הדגירה, להעביר את המאגר המועשר השבר אפיתל אל צינור נקי 15 מ"ל. הערה: אפיתל ותאים המשויך (תאי אפיתל המעי ו לימפוציטים אפיתל המעי) משתחררים לתוך המאגר, בעוד התאים שלמה פרופריה. מוסקולריס להישאר על מסננת התא במהלך שלב זה11.<ol>
<li>Centrifuge מועשר מעיים אפיתל השבר (IELs)-700 g x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא ב 1 מ"ל של מאגר FACS. לאחסן אותו על הקרח לשימוש בשלב 3.15.</li>
	</ol></li>
	<li>לשטוף את השבר פרופריה. מוסקולריס בתוך מסננת התא 2 x עם HBSS/מדעי המחשב. כדי לעשות זאת, להוסיף 10 מ של פתרון HBSS/מדעי המחשב (HBSS; 5% CS מאגר שבוצע בשלב 3.1.1 שאוחסן בקרח) מסננת תא ומערבבים אותו ב- 800 סל ד במשך 5 דקות בתוך חממה 37 ° C. לבטל את המאגר לשטוף אחרי זה.</li>
	<li>לשטוף את הדגימה 2 x בתקשורת לשטוף. להוסיף 10 מ של שטיפת המדיה (HBSS; 1% CS 1 מ"מ EDTA מאגר שבוצעו בשלב 3.1.3 ומאוחסנים בטמפרטורת החדר) מסננת תא ומערבבים אותו ב- 800 סל ד למשך 15 דקות חממה 37 ° C. לבטל את המאגר לשטוף אחרי זה.<ol>
<li>לאחר השימוש בתקשורת לשטוף, לאחסן אותו על הקרח לשימוש בשלב 3.14.</li>
	</ol></li>
	<li>לשטוף את הדגימה 2 x עם HBSS/מדעי המחשב להוסיף 10 מ ל מאגר HBSS/מדעי המחשב (HBSS; 5% CS מאגר שבוצעו בשלב 3.1.1 שאוחסן בקרח) מסננת תא ולבחוש אותו ב 800 סל"ד למשך 5 דקות בתוך חממה 37 ° C. לבטל את המאגר לשטוף אחרי זה.</li>
	<li>דגירה הרקמה במאגר שטיפה נטולי EDTA. להוסיף 10 מ ל מאגר שטיפה נטולי EDTA (HBSS; 1% CS; 15 מ מ HEPES מאגר שבוצעו בשלב 3.1.4 ומאוחסנים בטמפרטורת החדר) מסננת תא, דגירה את הצלחת. בשביל 10 דקות בטמפרטורת החדר, ללא ערבוב. לבטל את המאגר בסופו של שלב זה.</li>
	<li>לשטוף את הדגימה 2 x עם HBSS/מדעי המחשב ולהכין את הפתרון אנזים. להוסיף 10 מ של HBSS/CS (HBSS; 5% CS מאגר שבוצעו בשלב 3.1.1 שאוחסן בקרח) מאגר כדי מסננת התא ומערבבים אותו ב- 800 סל ד 10 דקות בתוך חממה 37 ° C. לבטל את המאגר לשטוף אחרי זה.<ol>
<li>להכין את הפתרון אנזים (ללא EDTA לשטוף מאגר; 0.1 מ"ג/מ"ל DNase אני; collagenase 167 מ"ג/מ"ל) בתקופת שטיפת שני: להוסיף 9 מ ג של DNase ו- 15 מ ג של collagenase lyophilized עד 90 מ"ל של EDTA ללא לשטוף את מאגר. אחסן את הפתרון בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol></li>
	<li>לעכל את השבר פרופריה. מוסקולריס הכלול מסננת התא כדי להשיג פרופריה. מוסקולריס לימפוציטים (LPLs). להוסיף 10 מ של הפתרון אנזים (EDTA ללא שטיפת מאגר; 0.1 מ"ג/מ"ל DNase אני; 167 מ"ג/מ"ל collagenase מאגר שבוצעו בשלב 3.12.1, בטמפרטורת החדר) על מסננת התא ולבחוש אותו ב- 800 סל ד למשך 45 דקות בחממה 37 ° C. הערה: LPLs משתחררים אל הפתרון לאחר עיכול אנזימטי.<ol>
<li>לאסוף את הפתרון אנזים המכילות את התאים ולסנן אותו דרך מסננת תא חדש לתוך צינור חרוטי 50 מ.</li>
	</ol></li>
	<li>הוסף 20 מ של כביסה קרה מדיה (את HBSS; 1% CS 1 מ"מ EDTA מאגר תוצרת בשלב 3.1.3 ומאוחסן על הקרח בשלב 3.9.1) לתאים מסוננים כדי לחסום את פעילות collagenase בפתרון אנזים. Centrifuge את הצינור ב 700 g x עבור 6 דקות בטמפרטורת החדר. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend את גלולה המכילה LPLs ב 1 מ"ל של מאגר FACS.</li>
	<li>לשלב את אישור IEL (מתוך שלב 3.7.1) ושברים LPL (מתוך שלב 3.14) ו תכתים אותם עם פלורסנט מצומדת נוגדנים לניתוח cytometric זרימה (ראה שלב 5). הערה: שברים אישור IEL ו- LPL ייתכן מוכתם בנפרד אם מידע תא רצוי.</li>
</ol>4. בידוד של לימפוציטים מן הטחול
<ol><li>הכינו את הצינור איסוף על-ידי הוספת µL 500 FACS מאגר לתוך צינור microcentrifuge. לאחסן אותו על הקרח.</li>
	<li>לאחר הסרת המעי הגס (שלב 3.4), למסוק את הטחול כולו ולמקם אותו בצינור אוסף. אחסן את הרקמה על קרח.</li>
	<li>באמצעות מהמגן של רקמות חשמלי, homogenize הטחול צינור microcentrifuge עבור 1 מינימלית צנטריפוגה המדגם-g x 300 [צנטריפוגה מיקרו] עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, לשאוב את תגובת שיקוע.</li>
	<li>לבצע את פירוק תאי הדם האדומים על ידי resuspending לדוגמה ב- 500 µL אמוניום כלוריד-אשלגן (ACK) פירוק מאגר ליזום מוות של תאים על-ידי פירוק osmotic. לאפשר את הדגימה דגירה 1-2 דקות בטמפרטורת החדר, ואז resuspend אותו ב- µL 725 FACS המאגר.</li>
	<li>Centrifuge המדגם-g x 300 [צנטריפוגה מיקרו] עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, לשאוב את תגובת שיקוע. Resuspend בגדר ב 500 µL מאגר FACS ולסנן אותו דרך מסננת תא 40 µm לתוך צינור microcentrifuge. להעביר את הדגימה כל צינור microcentrifuge, את הכתם עם פלורסנט מצומדת נוגדנים לניתוח cytometric זרימה (ראה שלב 5).</li>
</ol>5. זיהוי של Dendra-r+ תאים באמצעות Flow Cytometry
<ol><li>Centrifuge הדגימות LPL/אישור IEL וה טחול ב g 300 x [צנטריפוגה מיקרו] למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, לשאוב את תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend כדורי ב- 100 µL של נוגדן מכתים מיקס. להכין נוגדן מכתים לערבב על-ידי הוספת 1 µL של נוגדן anti-CD45 מצומדת fluorescently µL 100 FACS מאגר עבור דגימה. הערה: חשוב titrate נוגדנים המשמש את cytometry זרימה לפני הניסוי כדי לקבוע ריכוז אופטימלי בו מחייב רוויה מתרחשת.</li>
	<li>דגירה בדגימות במשך 35 דקות על קרח (במיקום כהה).</li>
	<li>Resuspend את הדגימות ב- 300 µL מאגר FACS, centrifuge אותם ב g 300 x [צנטריפוגה מיקרו] למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend את הדגימות בשנת 325 µL מאגר FACS. לנתח את הדוגמאות על cytometer זרימה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+interactions+of+the+intestinal+microbiota+and+immune+system.">Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system.</a> Nature. 489, 231-241 (2012).</li><li>Paun, A., Yau, C., Danska, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Influence+of+the+Microbiome+on+Type+1+Diabetes.">The Influence of the Microbiome on Type 1 Diabetes.</a> Journal of Immunology. 198, 590-595 (2017).</li><li>Mathis, D., Benoist, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+and+autoimmune+disease:+the+hosted+self.">Microbiota and autoimmune disease: the hosted self.</a> Cell Host Microbe. 10, 297-301 (2011).</li><li>Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protecting+the+Newborn+and+Young+Infant+from+Infectious+Diseases:+Lessons+from+Immune+Ontogeny.">Protecting the Newborn and Young Infant from Infectious Diseases: Lessons from Immune Ontogeny.</a> Immunity. 46, 350-363 (2017).</li><li>Jain, N., Walker, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet+and+host-microbial+crosstalk+in+postnatal+intestinal+immune+homeostasis.">Diet and host-microbial crosstalk in postnatal intestinal immune homeostasis.</a> Nature Reviews in Gastroenterology and Hepatology. 12, 14-25 (2015).</li><li>Mowat, A. M., Agace, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+specialization+within+the+intestinal+immune+system.">Regional specialization within the intestinal immune system.</a> Nature Reviews in Immunology. 14, 667-685 (2014).</li><li>Macpherson, A. J., Uhr, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+protective+IgA+by+intestinal+dendritic+cells+carrying+commensal+bacteria.">Induction of protective IgA by intestinal dendritic cells carrying commensal bacteria.</a> Science. 303, 1662-1665 (2004).</li><li>Mowat, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+basis+of+tolerance+and+immunity+to+intestinal+antigens.">Anatomical basis of tolerance and immunity to intestinal antigens.</a> Nature Reviews in Immunology. 3, 331-341 (2003).</li><li>Diehl, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+restricts+trafficking+of+bacteria+to+mesenteric+lymph+nodes+by+CX(3)CR1(hi)+cells.">Microbiota restricts trafficking of bacteria to mesenteric lymph nodes by CX(3)CR1(hi) cells.</a> Nature. 494 (3), 116-120 (2013).</li><li>Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lines+with+photo-activatable+mitochondria+to+study+mitochondrial+dynamics.">Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics.</a> Genesis. 50, 833-843 (2012).</li><li>Conway, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATG5+regulates+plasma+cell+differentiation.">ATG5 regulates plasma cell differentiation.</a> Autophagy. 9, 528-537 (2013).</li><li>Buzoni-Gatel, D., Lepage, A. C., Dimier-Poisson, I. H., Bout, D. T., Kasper, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+gut+intraepithelial+lymphocytes+protects+against+murine+infection+with+Toxoplasma+gondii.">Adoptive transfer of gut intraepithelial lymphocytes protects against murine infection with Toxoplasma gondii.</a> Journal of Immunology. 158, 5883-5889 (1997).</li><li>Guo, X., Muite, K., Wroblewska, J., Fu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Adoptive+Transfer+of+Group+3+Gut+Innate+Lymphoid+Cells.">Purification and Adoptive Transfer of Group 3 Gut Innate Lymphoid Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1422, 189-196 (2016).</li><li>Morton, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoscopic+photoconversion+reveals+unexpectedly+broad+leukocyte+trafficking+to+and+from+the+gut.">Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 6696-6701 (2014).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

זיהוי ואפיון של תאים אינטראקציה עם והם מושפעים את microbiota במעי הגס הם חשובים, צריך להקל על ההבנה של איך מועבר מידע microenvironment הרירית לשאר חלקי הגוף. שיטה אחת ללמוד נדידת תאים הקשורים הבטן דורש את הבידוד של תאים הקשורים בטן ואחריו העברה המאמצת לתוך עכברים הנמען כדי לקבוע דפוסי רקמה-יונת שלהן לתפקד12,13. גישה זו היא מוגבלת, שכן רק סוגי תאים מסוים הועברו מהמינה. יתר על כן, חפצים הנובע בידודו של תאים מן הרקמות ואת תהליך טיהור שעלולות להפריע ויוו תהליך הנדידה. לאחרונה, פרוטוקול photoconversion אנדוסקופי לסמן תאים מעיים באמצעות עכברים קאךה היה דווח על14. במחקר זה נמצא רחבה בבני אדם וחריגה מן המעי של עכברים בוגרים.
הדו ח שלנו מתאר שיטה תווית תאים במעי הגס של עכברים היילוד ולעקוב להגירתם מעיים במיוחד לאתרים כמו הטחול. העכברטוחנות PhAM מבטא ubiquitously photoconvertible ירוק ניאון Dendra2 חלבון זה בלתי הפיך נכנס למצב פלואורסצנטי אדום על ההפעלה שלה על ידי אור UV. חשיפת נקודתיים של עכברים היילוד 405 ננומטר אור המסומנות בשני CD45+ hematopoietic CD45neg תאים שאינם hematopoietic. CD45+Dendra2-אדום+ תאים אותרו הטחול 3 עד 5 ימים לאחר photoconversion, המציין את ההעברה במיוחד מעיים של תאים hematopoietic.
השלב הגבלת קצב עבור assay הזה הוא השבר של אזור המעי הגס נחשף לאור 405 ננומטר. את השבריריות של המעי הגס היילוד ואת נוכחותם של שרפרף, אמנם מינימלית בגיל הזה, להגביל את משך הצינורית סיב אופטי סיבים שניתן להוסיף. בניסויים הקודמים, בצינורית יותר לא היתה אפשרות בהצלחה להוסיפה יותר מ 5 מ מ.  חומרי סיכה היית נמנע בשל הסכנה של השבירה האור משתנה של קרן הלייזר. תנועת הצינורית החוצה כל 30 s עזר להגדיל את אזור המעי הגס נחשפים אור הלייזר. חשוב, בצינורית עם ערך נה גדול (NA = 0.5) שימש ליצירת קונוס רחב של אור במעי הגס.
פרוטוקול זה יש כבר סטנדרטית עבור היילוד (יום 0 - 2) PhAMטוחנות הגורים. לאור השינויים תוכן ואורך של המעי הגס עם הגיל של העכברים, הטכניקה יצטרך להיות ממוטבים בהתאם בעת שימוש גורים בוגרים. בעיקר, שינויים משך הפעילות הכולל את photoconversion ואת האורך של החדרת הצינורית סיבים אופטיים יהיה צורך.
גישה זו להבנת ההתנהגות הנדידה של תאים במעי הגס בהנחייתם של ניתוח תזרים cytometric. Cytometry זרימה מרובה פרמטר עשוי לשמש עוד יותר כדי לזהות וסוגי פנוטיפ התא מהגרות עבודה המועסקות חיסוניים בתוך CD45+ תא משנה. תאים Dendra2-r+ אולי גם ניתן למיין על ידי FACS ליישומים במורד הזרם כגון ניתוחים פרופיל או פרוטאומיקס של ביטוי גנים. בעוד ביים להבנה של קבוצות משנה תא hematopoietic במעי הגס במחקר זה, השיטה שעשוי להיות מותאם ללמוד ההעברה הסלולר מאתרים נוספים רקמת המוח כולל את העור.

מערכת העיכול יונקים בנמלים מאות מינים של חיידקים הקיימים במערכת יחסים סימביוטיים עם מארח1. תאים חיסוניים נוכח הסביבה המקומית שבה התרחשה לאכוף שוחר שלום עם החיידקים האלה ולהקים מחסום הגנה מפני פלישות הפתוגן. לפיכך, דו-כיוונית אינטראקציות בין תאים חיסוניים את microbiota הם קריטיים להקים קהילה commensal אשר מחנך את מערכת החיסון של הפונדקאי ומגדיר את סף תגובתיות מערכת החיסון פתוגנים. שינויים בשירותים מיקרוביאלי, או dysbiosis, להפריע את המערכת החיסונית הומאוסטזיס ואת perturb מעגלים רגולטוריות לרסן דלקות מעיים המוביל בתיווך החיסון למחלות כמו סוכרת מסוג 1, מחלת המעי הדלקתי2,3 .
תקופת מיד לאחר הלידה הוא חלון התפתחותי ייחודי שבמהלכו הקהילות מיקרוביאלית מעיים להתחיל להקים בו זמנית את מערכת החיסון מבשילה4. Microbiota לאחר הלידה אינה יציבה, עם משמרות הרכב הקהילה המתרחשים באופן טבעי, לעתים קרובות5. תאים חיסוניים המקיימים אינטראקציה עם microbiota שוכנים שני אנטומי מקומות נפרדים במעי - את פרופריה. מוסקולריס ו אפיתל המעי6. סוגים רבים של תאים חיסוניים נמצאים המעי, כולל לימפוציטים (כגון תאי T, תאים B ומולדת בתאי הלימפה) כמו גם התאים מיאלואידית (הכוללות תאים דנדריטים, ומונוציטים ו מקרופאגים). תאים אלה, ידוע גם בתאי hematopoietic, לבצע מספר רב של פונקציות לשמר את מחסום המעי ולשמור הומאוסטזיס.
בנוסף פונקציות התקינה שלהם באתרים מעיים, תאי המערכת החיסונית של רירית עשוי גם להעביר מסרים מיקרוביאלי לאתרים מעיים במיוחד כדי לווסת את החסינות מערכתית-7,-8,-9. זהו אזור גידול מחקר מעניין והוא מדגיש את הצורך שיטות לזהות תאים חיסוניים נודדים מתוך הרקמות מעיים על מנת לחקור את תפקידם. פרוטוקול דיווח כאן מנצל דגם העכבר זמינים מסחרית שבה החלבון הניאון photoconvertible הוא מנוצל לתאים תווית. פאםטוחנות עכברים מביעים ubiquitously של חלבון פלואורסצנטי ירוק Dendra2 זה בלתי הפיך נכנס למצב פלואורסצנטי אדום על הפעלה על ידי אולטרה סגול (UV) אור10. באמצעות הצינורית אופטיים סיבים כדי לספק אור 405 ננומטר לתוך המעי הגס של עכברים היילוד, נדגים כי ניתן למצוא תאים hematopoietic photoconverted, אשר מקורו או transited דרך המעי הגס הטחול.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:873px;" width="874">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:873px;">Laser</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:259px;">Light Emitting Diode (LED)</td>
			<td style="width:201px;">THORLABS</td>
			<td style="width:167px;">M405FP1</td>
			<td style="width:247px;">CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:259px;">LED driver</td>
			<td style="width:201px;">THORLABS</td>
			<td style="width:167px;">LEDD1B</td>
			<td style="width:247px;">Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:259px;">Optogenetics patch cable</td>
			<td style="width:201px;">THORLABS</td>
			<td style="width:167px;">M87L01</td>
			<td style="width:247px;">1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&#38;pn=M87L01#11454</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:259px;">Fiber optic cannula</td>
			<td style="width:201px;">Doric lenses&#160;</td>
			<td style="width:167px;">MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45</td>
			<td style="width:247px;">5 mm long cannula with an outer diameter of 500 &#181;m and an inner diameter of 480 &#181;m. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">Power supply</td>
			<td style="width:201px;">THORLABS</td>
			<td style="width:167px;">KPS101</td>
			<td style="width:247px;">Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:259px;">LG3 laser safety goggles&#160;</td>
			<td style="width:201px;">THORLABS</td>
			<td style="width:167px;">LG3</td>
			<td style="width:247px;">Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&#38;pn=LG3#2523</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Red light&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>74327-10</td>
			<td style="width:247px;">15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:873px;">Intestinal cell isolation</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:259px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:201px;">Patterson Veterinary</td>
			<td style="width:167px;">07-893-1389</td>
			<td style="width:247px;">CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood.&#160; https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:259px;">1X HBSS</td>
			<td style="width:201px;">Gibco</td>
			<td style="width:167px;">14025076</td>
			<td style="width:247px;">Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&#38;searchTerm=14025076&#38;searchType=RAPID&#38;matchedCatNo=14025076</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Calf Serum</td>
			<td style="width:201px;">Hyclone AZM</td>
			<td style="width:167px;">197696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:259px;">EDTA</td>
			<td style="width:201px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:167px;">15575020</td>
			<td style="width:247px;">0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:259px;">DTT</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">10197777001</td>
			<td style="width:247px;">CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:259px;">HEPES</td>
			<td style="width:201px;">Gibco</td>
			<td style="width:167px;">15630080</td>
			<td style="width:247px;">1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:259px;">Petri dish</td>
			<td style="width:201px;">Corning</td>
			<td style="width:167px;">353004</td>
			<td style="width:247px;">https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&#38;searchTerm=08772F&#38;searchType=RAPID&#38;matchedCatNo=08772F</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">70 micron cell strainer</td>
			<td style="width:201px;">Falcon</td>
			<td style="width:167px;">352350</td>
			<td style="width:247px;">https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:259px;">Micro magnetic stir bar</td>
			<td style="width:201px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:167px;">1451364</td>
			<td style="width:247px;">Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:259px;">Magnetic stir plate</td>
			<td style="width:201px;">Corning Laboratory Stirrers</td>
			<td style="width:167px;">440826</td>
			<td style="width:247px;">https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&#38;persist=true&#38;ip=no&#38;gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:259px;">Collagenase</td>
			<td style="width:201px;">Roche</td>
			<td style="width:167px;">5401020001</td>
			<td style="width:247px;">https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en&#38;region=US&#38;gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">DNase I</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">10104159001</td>
			<td style="width:247px;">https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">1X PBS</td>
			<td style="width:201px;">Gibco</td>
			<td style="width:167px;">20012-027</td>
			<td style="width:247px;">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:259px;">Pipet aid</td>
			<td style="width:201px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:167px;">14387165</td>
			<td style="width:247px;">https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">10 mL serological pipet</td>
			<td style="width:201px;">Falcon</td>
			<td style="width:167px;">357530</td>
			<td style="width:247px;">https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">25 mL serological pipet</td>
			<td style="width:201px;">Falcon</td>
			<td style="width:167px;">357515</td>
			<td style="width:247px;">https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td style="width:201px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:167px;">339651</td>
			<td style="width:247px;">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td style="width:201px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:167px;">339653</td>
			<td style="width:247px;">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:873px;">Single cell suspension</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:201px;">Seal-Rite</td>
			<td style="width:167px;">1615-5500</td>
			<td style="width:247px;">Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:259px;">Tissue homogenizer&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Kimble</td>
			<td>K7495400000</td>
			<td style="width:247px;">Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:259px;">Homogenizer tips&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Kimble</td>
			<td style="width:167px;">7495210590</td>
			<td style="width:247px;">Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">ACK lysing buffer</td>
			<td style="width:201px;">Gibco</td>
			<td style="width:167px;">A10492-01</td>
			<td style="width:247px;">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">40 micron cell strainer</td>
			<td style="width:201px;">Falcon</td>
			<td style="width:167px;">08-771-1</td>
			<td style="width:247px;">https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:873px;">Antibodies</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:259px;">BV786 anti-mouse CD45&#160;</td>
			<td style="width:201px;">BD</td>
			<td style="width:167px;">564225</td>
			<td style="width:247px;">Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Live/Dead</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L34962</td>
			<td style="width:247px;">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Other</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Razor blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td style="width:247px;">Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo photolabeling of cells in the colon to assess migratory potential of hematopoietic cells in neonatal mice

קהילות חיידקי המעית נקבעו בשלב מוקדם בחיים ולהשפיע על התפתחות תאי המערכת החיסונית ותפקוד. Microbiota neonatal חשופה להשפעות חיצוניות רבות, כולל שימוש אנטיביוטיקה, דיאטה, אשר משפיעה על הרגישות אוטואימוניות ומחלות דלקתיות. הפרעות כגון דלקת המעי המחלה (מחלת המעי הדלקתי) מאופיינים על ידי המאסיבית של תאים חיסוניים למעיים. עם זאת, תאים חיסוניים מותנה microbiota אולי בנוסף להגר מחוץ למעיים. להשפיע על תגובות חיסוניות באתרי אקסטרה מעיים. לפיכך, יש צורך לזהות ולאפיין תאים עשויים להעביר מסרים חיידקים מהמעיים לאתרים דיסטלי. כאן, אנו מתארים שיטה תווית תאים במעי הגס של עכברים היילוד ויוו המאפשרת את הזיהוי שלהם באתרי אקסטרה מעיים לאחר ההעברה.

כבל סיבים אופטיים שימש כדי לספק אור 405 ננומטר לתוך נקודתיים של עכבריםטוחנות PhAM 2 - בן יום. בניסויים הקודמים, חשיפה של 30 נקבע לתת photoconversion מקסימלי של המעי הגס תאים עם cytotoxicity מינימלי (איור 1א'). לכן, רציפים-30 s חשיפות של חלקים שונים של המעי הגס בוצעו כמפורט בפרוטוקול. בעקבות החשיפה לייזר, העכברים היו מורדמים מיד, photoconversion של התאים נקבע. תא בודד ההכנות של רקמת מעי סה כ היו מוכתמים נוגדן anti-CD45 מצומדת פלורסנט ובוצע ניתוח cytometric זרימה לאתר photoconversion. חלבון ירוק-Dendra2 (Dendra-g) אשר יש עירור, פליטה maxima ב nm 490 ו 553 בהתאמה, ניתן להבחין בערוץ FITC, ואילו photoconverted Dendra2-אדום (Dendra-r) חלבון יש עירור, פליטה maxima nm 507, 573 בהתאמה, עשוי להתגלות בערוץ PE של cytometer זרימה. ברגע בלתי הפיך החליף לצורתו אדום, Dendra2 הוא מאוד photostable שימושי עבור יישומי מעקב לטווח ארוך.
תאים Dendra-r+ לא אותרו בעכברים unlasered (איור 1B שמאלה). עם זאת, 405 ננומטר לאור החשיפה הביא ברורים אוכלוסיות תא Dendra-r+ CD45neg והן CD45+ תא תאים (איור 1B נכון). כדי לקבוע אם פרוטוקול photoconversion שטיפת המעי הגס גרמו תיוג הרקע של תאים באתרי אקסטרה מעיים, קצרנו טחולים מ לאחרונה photoconverted עכברים (T = 0), לבדיקה עבור Dendra-r+ תאים על-ידי cytometry זרימה. אף תא Dendra-r+ התגלו CD45שלילי או CD45+ תא תאים (איור 1C), רומז כי קרן הלייזר אינטרה-חוקן שלא חדרו מספיק כדי photolabel תאי הטחול. לפיכך, תאים Dendra-r+ זוהה הטחול לאחר המאפשר זמן ההעברה (T = 3d, 5d) צריך להיות שמקורם מן המעי הגס.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57929/57929fig1.jpg"> איור 1 : אין ויוו photoconversion של רקמת מעי. תאים של המעי הגס של הגוריםטוחנות PhAM 2 - בן יום נחשפו לאור אינטרה-חוקן 405 ננומטר ל 30 s כמתואר. את photoconversion ואת תיוג של התאים היו נחושים מיד לאחר הניתוח (T = 0) על ידי ניתוח cytometric זרימה של תא בודד ההכנות של רקמת מעי, הטחול. (א) מגרש נקודה זו הזרימה נציג cytometric מציגה את הביטוי של CD45 (x-ציר), צביעה של לצבוע חי-מת (y-ציר) בתוך תא בודד גלמי נקודתיים של שליטה ועכברים lasered. פאנלים B ו- C הם זרימת נציג cytometric נקודה מגרש שכבות המציגות את הביטוי של החלבון Dendra2-ירוק (Dendra2-g, ציר אופקי), חלבון Dendra2-אדום (Dendra2-r, אנכי ציר) בשליטה-סמויה, חשופים CD45+ (hematopoietic) CD45מינוס (שאינם hematopoietic) תאי (B) המעי הגס ופי (C) הטחול. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57929/57929fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
נתונים ניסוי טיפוסי photoconversion לזהות תאים נודדים הטחול מוצגים באיור2. Photoconversion של התאים נקודתיים של עכבריםטוחנות PhAM 2 - בן יום בוצעה כמו באיור 1. עכברים היו מורדמים 3 ו- 5 ימים לאחר החשיפה, הנוכחות של תאים Dendra-r+ הטחול נקבע על ידי cytometry זרימה. היו שם אין תאים Dendra-r+ CD45neg תא המשנה, עקבי עם הנוף כי התאיםneg CD45 הם בעיקר אפיתל והתאים מבנית של המעי. כמה CD45+ hematopoietic תאי ביטא Dendra-r, רומז כי הם היו כבר photoconverted במעי הגס, הועברו הטחול.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57929/57929fig2.jpg"> איור 2 : CD45+ תאים hematopoietic להגר מן המעי הגס הטחול. היילוד (יום 0 - 2) PhAMטוחנות עכברים נחשפו לאור 405 ננומטר לחלבון photoconvert Dendra2 על ידי חשיפה אינטרה-חוקן. Cytometry זרימה נציג מראים את הביטוי של החלבון Dendra2-ירוק (Dendra2-g, הציר האופקי) וחלבון Dendra2-אדום (Dendra2-r, אנכי ציר) CD45שלילי , CD45+ תאי הטחול של עכברים בת 5 ימים שלא נחשפו ו חשוף עכברים נותחו 3 ו- 5 ימים (T = 3d, 5d) לאחר photoconversion. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57929/57929fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice at JoVE.com

In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

הפרוטוקול המתואר כאן משתמשת בגישה photolabeling בעכברים היילוד במיוחד לזהות תאים חיסוניים להגר מן המעי הגס לאתרים במיוחד מעיים. אסטרטגיה זו יהיה מועיל ללמוד אינטראקציות מארח-microbiome בחיים מוקדם.

אין ויוו Photolabeling של תאים במעי הגס כדי להעריך את פוטנציאל הנדידה של תאים Hematopoietic בעכברים Neonatal

Enteric bacterial communities are established early in life and influence immune cell development and function. The neonatal microbiota is susceptible to ...

in-vivo-photolabeling-cells-colon-to-assess-migratory-potential

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

5.7K Views.  Massachusetts General Hospital. הפרוטוקול המתואר כאן משתמשת בגישה photolabeling בעכברים היילוד במיוחד לזהות תאים חיסוניים להגר מן המעי הגס לאתרים במיוחד מעיים. אסטרטגיה זו יהיה מועיל ללמוד אינטראקציות מארח-microbiome בחיים מוקדם.

Video: In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, the de novo mutation rate in humans is relatively high, so new mutations are generated at a high frequency in the population. However, de novo mutations have not been reported in most common diseases. Mutations in genes leading to severe diseases where there is a strong negative selection against the phenotype, such as lethality in embryonic stages or reduced reproductive fitness, will not be transmitted to multiple family members, and therefore will not be detected by linkage gene mapping or association studies. The observation of very high concordance in monozygotic twins and very low concordance in dizygotic twins also strongly supports the hypothesis that a significant fraction of cases may result from new mutations. Such is the case for diseases such as autism and schizophrenia. Second, despite reduced reproductive fitness1 and extremely variable environmental factors, the incidence of some diseases is maintained worldwide at a relatively high and constant rate. This is the case for autism and schizophrenia, with an incidence of approximately 1% worldwide. Mutational load can be thought of as a balance between selection for or against a deleterious mutation and its production by de novo mutation. Lower rates of reproduction constitute a negative selection factor that should reduce the number of mutant alleles in the population, ultimately leading to decreased disease prevalence. These selective pressures tend to be of different intensity in different environments. Nonetheless, these severe mental disorders have been maintained at a constant relatively high prevalence in the worldwide population across a wide range of cultures and countries despite a strong negative selection against them2. This is not what one would predict in diseases with reduced reproductive fitness, unless there was a high new mutation rate. Finally, the effects of paternal age: there is a significantly increased risk of the disease with increasing paternal age, which could result from the age related increase in paternal de novo mutations. This is the case for autism and schizophrenia3. The male-to-female ratio of mutation rate is estimated at about 4&#x2013;6:1, presumably due to a higher number of germ-cell divisions with age in males. Therefore, one would predict that de novo mutations would more frequently come from males, particularly older males4. A high rate of new mutations may in part explain why genetic studies have so far failed to identify many genes predisposing to complexes diseases genes, such as autism and schizophrenia, and why diseases have been identified for a mere 3% of genes in the human genome. Identification for de novo mutations as a cause of a disease requires a targeted molecular approach, which includes studying parents and affected subjects. The process for determining if the genetic basis of a disease may result in part from de novo mutations and the molecular approach to establish this link will be illustrated, using autism and schizophrenia as examples.

Molecular genetic strategy for finding de novo mutations causing common disorders such as autism and schizophrenia.

אסטרטגיה לזהות מוטציות דה נובו בהפרעות נפוצות כגון אוטיזם וסכיזופרניה

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J Mice

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular through transplantation of stromal cells and epithelial cells in the mammary gland of mice. Current transplantation models often involve the use of immunocompromised mice due to the different genetic backgrounds of stromal cells and epithelial cells. Extracellular matrices are often used to embed the two different cell types for consistent cell-cell interactions, but involve the use of Matrigel or rat tail collagen, which are immunogenic substrates. The lack of functional T cells from immunocompromised mice prevents accurate assessment of stromal cells on mammary tumor progression in vivo, with important implications on drug development and efficacy. Moreover, immunocompromised mice are costly, hard to breed and require special care conditions. To overcome these obstacles, we have developed an approach to orthotopically transplant stromal cell and epithelial cells into mice from the same genetic background to induce consistent tumor formation. This system involves harvesting normal, carcinoma associated fibroblasts, PyVmT mammary carcinoma cells and collagen from donor C57BL/6J mice. The cells are then embedded in collagen and transplanted in the inguinal mammary glands of female C57BL/6J mice. Transplantation of PyVmT cells alone form palpable tumors 30-40 days post transplantation. Endpoint analysis at 60 days indicates that co-transplantation with fibroblasts enhances mammary tumor growth compared to PyVmT cells transplanted alone. While cells and matrix from C57BL/6J mice were used in these studies, the isolation of cells and matrix and transplantation approach may be applied towards mice from different genetic backgrounds demonstrating versatility. In summary, this system may be used to investigate molecular interactions between stromal cells and epithelial cells, and overcomes critical limitations in immunocompromised mouse models.

In this report, we demonstrate a system to isolate and culture donor cells from the mouse mammary gland, and orthotopically transplant these cells in recipient mice to analyze stromal: epithelial interactions during mammary tumor development.

השתלה של תאים סטרומה החלב ותאי קרצינומה של עכברים C57BL/6J

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

בF-MRI 19 vivo למעקב סלולרי

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study model. As the use of mouse models are often a vital step in preclinical drug discovery and drug development1-8, it is necessary to design a system to introduce drugs into mice in a uniform, reproducible manner. Ideally, the system should permit the collection of blood samples at regular intervals over a set time course. The ability to measure drug concentrations by mass-spectrometry, has allowed investigators to follow the changes in plasma drug levels over time in individual mice1, 9, 10. In this study, paclitaxel was introduced into transgenic mice as a continuous arterial infusion over three hours, while blood samples were simultaneously taken by retro-orbital bleeds at set time points. Carotid artery infusions are a potential alternative to jugular vein infusions, when factors such as mammary tumors or other obstructions make jugular infusions impractical. Using this technique, paclitaxel concentrations in plasma and tissue achieved similar levels as compared to jugular infusion. In this tutorial, we will demonstrate how to successfully catheterize the carotid artery by preparing an optimized catheter for the individual mouse model, then show how to insert and secure the catheter into the mouse carotid artery, thread the end of the catheter out through the back of the mouse&#8217;s neck, and hook the mouse to a pump to deliver a controlled rate of drug influx. Multiple low volume retro-orbital bleeds allow for analysis of plasma drug concentrations over time.

This method was developed with the goal of delivering a steady drug solution via the carotid artery, to assess the pharmacokinetics of novel drugs in mouse models.

חליטות עורק הראשי לpharmacokinetic וpharmacodynamic ניתוח של taxanes בעכברים

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

טלמטריה תוך רחמי למדידת לחץ עכבר התכווצות<em&gt; In vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest improved outcome measures in both experimental and clinical studies. Although the BMMSC are implanted into the tendon lesion in large numbers (usually 10 - 20 million cells), only a relatively small number survive (&#60;10%) although these can persist for up to 5 months after implantation. This appears to be a common observation in other species where BMMSC have been implanted into other tissues and it is important to understand when this loss occurs, how many survive the initial implantation process and whether the cells are cleared into other organs. Tracking the fate of the cells can be achieved by radiolabeling the BMMSC prior to implantation which allows non-invasive in vivo imaging of cell location and quantification of cell numbers.
This protocol describes a cell labeling procedure that uses Technetium-99m (Tc-99m), and tracking of these cells following implantation into injured flexor tendons in horses. Tc-99m is a short-lived (t1/2 of 6.01 hr) isotope that emits gamma rays and can be internalized by cells in the presence of the lipophilic compound hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO). These properties make it ideal for use in nuclear medicine clinics for the diagnosis of many different diseases. The fate of the labeled cells can be followed in the short term (up to 36 hr) by gamma scintigraphy to quantify both the number of cells retained in the lesion and distribution of the cells into lungs, thyroid and other organs. This technique is adapted from the labeling of blood leukocytes and could be utilized to image implanted BMMSC in other organs.

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

This protocol describes the radiolabeling of equine mesenchymal stem cells and their implantation into tendon injuries in the horse in order to determine cell survival and tissue distribution using gamma scintigraphy.

In vivo ההדמיה ומעקב של טכנציום-99m תווית תאי גזע מח העצם mesenchymal בסוסי Tendinopathy

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

לומד סרטן לבלב גזע מאפייני תא לפיתוח טיפול חדש אסטרטגיות

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis. Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or prevention are lacking. We report a method for the establishment of pulmonary metastases in mice, useful for the study of this phenomenon. Tail vein injection of B57BL/6J mice with B16-BL6 is among the most used models for melanoma metastases. Some of the circulating tumor cells establish themselves in the lungs of the mouse, creating "experimental" metastatic foci. With this model it is possible to measure the relative effects of therapeutic agents on the development of cancer metastasis. The difference in enumerated lung foci between treated and untreated mice indicates the efficacy of metastases neutralization. However, prior to the investigation of a therapeutic agent, it is necessary to determine an optimal number of injected B16-BL6 cells for the quantitative analysis of metastatic foci. Injection of too many cells may result in an overabundance of metastatic foci, impairing proper quantification and overwhelming the effects of anti-cancer therapies, while injection of too few cells will hinder the comparison between treated and controls.

Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.

הזרקה של תאים syngeneic Murine מלנומה מנת לקבוע את פוטנציאל גרורתי שלהם בתוך הריאות

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis.  Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

חסך בתאי עכבר מן xenografts גידול האנושי משפר משמעותי ניתוח במורד זרם של תאי יעד

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a wide variety of disorders including metabolic diseases, premature aging syndromes, and neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD). Maintenance of mitochondrial health depends on mitochondrial biogenesis and the efficient clearance of dysfunctional mitochondria through mitophagy. Experimental methods to accurately detect autophagy/mitophagy, especially in animal models, have been challenging to develop. Recent progress towards the understanding of the molecular mechanisms of mitophagy has enabled the development of novel mitophagy detection techniques. Here, we introduce several versatile techniques to monitor mitophagy in human cells, Caenorhabditis elegans (e.g., Rosella and DCT-1/ LGG-1 strains), and mice (mt-Keima). A combination of these mitophagy detection techniques, including cross-species evaluation, will improve the accuracy of mitophagy measurements and lead to a better understanding of the role of mitophagy in health and disease.

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitophagy, the process of clearing damaged mitochondria, is necessary for mitochondrial homeostasis and health maintenance. This article presents some of the latest mitophagy detection methods in human cells, Caenorhabditis elegans, and mice.

במבחנה and In Vivo זיהוי של Mitophagy ב תאים אנושיים, C. Elegansועכברים

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...