עבודה זו מומן על ידי פרס אין. OCE-1323652 דרך no.1012629 הלאומי למדע קרן האוקיינוס המדע בתר ופרס מתוכנית בורוז Wellcome קרן פוסט-דוקטורט העשרה.

1. הסרת פרפין
שים לב: בצע את השלבים הבאים תחת ברדס fume.
<ol><li>Dewax דק-למחלקה פרפין-מוטבע השקופיות. עם 100% קסילן מתחת למכסה המנוע בצנצנות זכוכית Coplin למשך 10 דקות. אל תשתמש/י צנצנות פלסטיק Coplin, כפי קסילן נמס פלסטיק. לעקר את הצנצנות Coplin ב החיטוי לפני השימוש.</li>
	<li>הכינו ארבע צנצנות זכוכית סטריליים Coplin את הפעולות הבאות: אתנול 100%, 80% אתנול, אתנול 70% ו-60% אתנול. לדלל האתנול עם RNase ללא מים.<ol>
<li>להעביר את השקופיות הצנצנת Coplin זכוכית סטריליים עם 100% אתנול, להשרות אותם למשך 10 דקות. לאחר 10 דקות, לרוקן את צנצנת הזכוכית Coplin והחלף חדש 100% אתנול. משרים את השקופיות שוב למשך 10 דקות.</li>
		<li>להעביר את השקופיות הצנצנת Coplin זכוכית סטריליים עם 80% אתנול עבור 1 דקות.</li>
		<li>להעביר את השקופיות הצנצנת Coplin זכוכית סטריליים עם אתנול 70% עבור 1 דקות.</li>
		<li>להעביר את השקופיות הצנצנת Coplin זכוכית סטריליים עם 60% אתנול עבור 1 דקות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. רעלני של שקופיות עבור הכנה של RNA בדיקה הכלאה
<ol><li>לבצע את מנקי הבאים בטמפרטורת החדר, אלא אם צוין אחרת. מבצע בטמפרטורת החדר-מנקי תפקודי לב / נשימה במהירות איטית. להשתמש את פרסומי שקופית סטרילי עם חדר עבור שקופיות עד חמישה לשטיפת מכוניות של השקופיות.</li>
	<li>להעביר את השקופיות למבוטחים שקופית סטרילי עם 18 מ ל 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS). לרחוץ למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>יוצקים את מגניב 1 x, ולטפל באופן מיידי הרקמה בשקופיות עם proteinase K כדי לאפשר חדירה בדיקה של הרקמה. להוסיף כ 18 מ של proteinase K פתרון מיילר שקופית (ראה טבלה 1 לעבודה פתרון ריכוז). דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. אל תלחץ.<ol>
<li>בזמן, השקופיות הן המקננת להכין מאגר prehybridization (מאגר Prehybe). למקם את המאגר Prehybe באמבט מים רותחים למשך 10 דקות ולאחר מכן מגניב על אמבטיית קרח למשך 5 דקות. לקבלת מתכון של מאגר Prehybe, ראה טבלה 1.</li>
		<li>העיכול של התגובה proteinase K שמוציא את הפתרון proteinase K, ולקבל מיד להוסיף 18 מ של 0.2% גליצין-PBS פתרון מיילר שקופיות. תן את מיילר שקופית לשבת בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.</li>
		<li>שופכים את הפתרון גליצין-PBS 0.2% ולהוסיף mL 18 בפתרון נתרן מלוחים ציטראט (האס) 2 x מיילר כל שקופית. לשטוף את השקופיות 2 x SSC 10 דקות בטמפרטורת החדר, עם רועדת במהירות של 100-150 סל ד.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. prehybridization של שקופיות לקראת בדיקה RNA הכלאה
<ol><li>בזמן שהשקופיות להיות נשטפים עם 2 x SSC, להשיג למבוטחים סטרילי שקופית חדשה ולשים כ 18 מ של מאגר Prehybe לתוך מיילר שקופיות. מקם את מיילר שקופיות לתוך התנור הכלאה בטמפרטורת הכלאה. הערה: הטמפרטורה הכלאה תלויות המכשיר בשימוש אבל בדרך כלל נע בין 50-60 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>עם סיום לשטוף את x SSC 2, שופכים את 2 x האס, והמקום השקופיות בתוך מיילר שקופית במאגר Prehybe בתנור הכלאה לשעה.</li>
</ol>4. הכלאה של המכשיר RNA
<ol><li>בעוד השקופיות הן המקננת עם המאגר Prehybe בתנור הכלאה, להכין פתרון הכלאה-בדיקה.<ol>
<li>לדלל כל בדיקה במאגר הכלאה (0.5 µL של בדיקה עם µL 24.5 הכלאה מאגר). הערה: המתכון הכלאה המאגר נמצא בטבלה 1. דוגמה של ריכוז והכנה של המכשיר ניתן למצוא טריילור-נואלס. et al. 11.</li>
		<li>למקם את המכשיר מדולל בבלוק חום 86-90 מעלות צלזיוס במשך 12 דקות, ואז להתקרר למשך 1 דקות על קרח.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להסיר את מיילר שקופית מהתנור הכלאה ולהסיר באופן אינדיבידואלי שקופיות מיילר שקופיות באמצעות פינצטה סטרילי. להניח את השקופיות על מגבת נייר, בזהירות. תנגב את מאגר עודף Prehybe סביב דגימות רקמה. להיזהר לא לגעת הדגימות, ועבודה במהירות כדי למנוע התייבשות דגימות רקמה.</li>
	<li>להקיף את הרקמה עם עט PAP. להחיל µL 25 בפתרון בדיקה מדולל עם פיפטה ולכסות את הדגימה עם coverslip פלסטיק.<ol>
<li>מקם את הדגימות בבית הבליעה לחות שקופיות עם 4 x האס + 50% פתרון formamide בחלק התחתון של החדר.</li>
		<li>ברגע הגששים נוספו כל השקופיות, מקום תא לחות שקופיות לתוך התנור הכלאה לפחות 24 שעות בטמפרטורה הכלאה של 50-60 מעלות צלזיוס. זמן הדגירה יכולה להשתנות בהתאם הריכוז של המכשיר, אבל צריך להיות מינימום של 24 שעות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר דגירה לילה עם הגששים מדולל, להסיר תא לחות שקופית מהתנור הכלאה.<ol>
<li>הסר כל אחת מהשקופיות, נזהר לא לעקור את רקמת coverslips. פיפטה µL 1000, להוסיף 1000 µL של פתרון x SSC 2, בעדינות לשטוף את השקופית.</li>
		<li>מקם את השקופית למבוטחים שקופית סטרילי עם 18 מ של x SSC 2, לפתרון 5 דקות בטמפרטורת החדר. שופכים את הפתרון ולהחליף אותו עם 18 מיליליטר 2 טריים x SSC. חזור על הדגירה שוב עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר עם טלטול עדין.</li>
		<li>יוצקים את הפתרון x SSC 2. להוסיף 18 מ של 1 x SSC פתרון ושטוף במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. שופכים את הפתרון x SSC 1 ולהחליף אותו עם 18 מ ל 1 טרי x SSC. חזור על הדגירה עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר עם טלטול עדין.</li>
		<li>שופכים את 1 x SSC. להוסיף מ 18 ל 0.5 x האס ושטוף במשך 10 דקות ב 42 ° C ללא רועד. שופכים את 0.5 x האס והחלף אותו עם 18 מ של 0.5 טרי x SSC. לשטוף שוב 10 דקות ב 42 ° C ללא רועד.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. ויזואליזציה של המכשיר RNA
הערה: המדגימה את החללית, מוניטור סגול ייעשה שימוש בתהליך הפיתוח. עם זאת, לפני שלב זה, מספר שוטף נדרשים להכין את הדגימות מכתים.
<ol><li>לשטוף את השקופיות 18 מ ל מאגר phosphatase אלקליין (AP-מאגר) ללא MgCl2 ב 1 מינימלית שופכים AP-למאגר מבלי MgCl2, ולהוסיף mL 18 1 x Boehringer-מנהיים חסימה מאגר מדולל עם חומצה maleic מאגר. תקופת דגירה של פחות שעה בטמפרטורת החדר למבוטחים שקופיות עם טלטול עדין. הערה: מאגר חסימה Boehringer-מנהיים ומאגר חומצה maleic השתמשו היו premade ורכש החפירה לשטוף, להגדיר מאגר בלוק (זמין מסחרית).<ol>
<li>לחלופין, ניתן לבצע הדגירה למשך הלילה ב 4 ° C. תקופה עוד חסימה יעמעם את המראה של איגוד שאינם ספציפיים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין mL 20 של קטעים Fab anti-digoxigenin-AP החפירה מדולל (נוגדן אנטי החפירה = 2 µL של נוגדן אנטי החפירה + 20 מ ל 1 x מאגר חסימה Boehringer-מנהיים). זה מספיק לשימוש במיילר פלסטיק שקופית 1 יותר של פתרון זה חייב להיות מוכן אם אחד או יותר מיילר שקופית כדי לשמש.</li>
	<li>מוסיפים נוגדן אנטי החפירה למבוטחים סטרילי שקופית חדשה, להעביר את השקופיות מיילר שקופיות עם הפתרון נוגדן אנטי החפירה. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 3 שעות עם טלטול עדין.</li>
	<li>לאחר דגירה, שופכים הנוגדן אנטי החפירה ולשטוף את השקופיות ב מיילר שקופית 18 מ ל AP-מאגר ללא MgCl2 עבור חמש דקות עם טלטול עדין.</li>
	<li>שופכים את AP-המאגר ללא MgCl2, ולהוסיף מ 18 ל AP-Buffer. רחץ במשך חמש דקות עם טלטול עדין. לאחר 5 דקות הדגירה, יוצקים את המאגר AP, להחליף אותו עם 18 מ ל AP טריים-מאגר, לשטוף במשך חמש דקות עם טלטול עדין.</li>
	<li>בחושך, שופכים את AP-המאגר ולהוסיף 18 מ של מוניטור סגול מיילר שקופיות. דגירה השקופיות בטמפרטורת החדר בחושך, בדיקת לפיתוח צבע סגול שכל זמני התגובה ה ½ להמחשת ישתנו בהתבסס על החללית זה מפותח. הערה: במקום מוניטור סגול ויזואליזציה, פיתוח פתרון יכול להתבצע באמצעות 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) ו- tetrazolium ניטרו כחול (NBT). לקבלת הוראות, ראה טבלה 1 .</li>
	<li>לעצור התפתחות צבע על ידי העברת השקופיות למבוטחים סטרילי שקופית חדשה עם mL 18 טריס-EDTA (TE) המאגר עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, בחושך.</li>
	<li>יוצקים את המאגר טה ולהוסיף 18 מיליליטר מים נטולי RNase מיילר שקופיות ו בשביל 1 דקות, בחושך.</li>
	<li>הסר את השקופיות מן המים, לייבש אותם בקצוות של הרקמה. להוסיף גליצרול הרכבה בינונית ומניחים על coverslips. אחסן את השקופיות ב 4 ° C עד תמונות מוכן לקחת.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hughes, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Climate+Change,+Human+Impacts,+and+the+Resilience+of+Coral+Reefs.">Climate Change, Human Impacts, and the Resilience of Coral Reefs.</a> Science. 301 (5635), 933 (2003).</li><li>Chen, P. -. Y., Chen, C. -. C., Chu, L., McCarl, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+economic+damage+of+climate+change+on+global+coral+reefs.">Evaluating the economic damage of climate change on global coral reefs.</a> Global Environmental Change. 30 (Supplement C), 12-20 (2015).</li><li>Hoegh-Guldberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coral+Reefs+Under+Rapid+Climate+Change+and+Ocean+Acidification.">Coral Reefs Under Rapid Climate Change and Ocean Acidification.</a> Science. 318 (5857), 1742 (2007).</li><li>Grasso, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+identifies+candidate+genes+for+key+roles+in+coral+development.">Microarray analysis identifies candidate genes for key roles in coral development.</a> BMC Genomics. 9 (1), 540 (2008).</li><li>Miller, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+innate+immune+repertoire+in+Cnidaria+-+ancestral+complexity+and+stochastic+gene+loss.">The innate immune repertoire in Cnidaria - ancestral complexity and stochastic gene loss.</a> Genome Biology. 8 (4), R59 (2007).</li><li>Shinzato, C., Iguchi, A., Hayward, D. C., Technau, U., Ball, E. E., Miller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox+genes+in+the+coral+Acropora+millepora:+divergent+expression+patterns+reflect+differences+in+developmental+mechanisms+within+the+Anthozoa.">Sox genes in the coral Acropora millepora: divergent expression patterns reflect differences in developmental mechanisms within the Anthozoa.</a> BMC Evolutionary Biology. 8 (1), 311 (2008).</li><li>Anctil, M., Hayward, D. C., Miller, D. J., Ball, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+and+expression+of+four+coral+G+protein-coupled+receptors+distinct+from+all+classifiable+members+of+the+rhodopsin+family.">Sequence and expression of four coral G protein-coupled receptors distinct from all classifiable members of the rhodopsin family.</a> Gene. 392 (1-2), 14-21 (2007).</li><li>Darby, I. A., Hewitson, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In situ hybridization protocols. , (2006).</li><li>Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In situ hybridization. , (1987).</li><li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback.">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).</li><li>Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+specificity+of+gene+expression+in+the+response+to+heat+stress+in+corals.">The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals.</a> Journal of Experimental Biology. 220 (10), (2017).</li><li>Wolenski, F. S., Layden, M. J., Martindale, M. Q., Gilmore, T. D., Finnerty, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+spatiotemporal+expression+of+RNAs+and+proteins+in+the+starlet+sea+anemone,+Nematostella+vectensis.">Characterizing the spatiotemporal expression of RNAs and proteins in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis.</a> Nature Protocols. 8, 900 (2013).</li><li>Schnitzler, C. E., Simmons, D. K., Pang, K., Martindale, M. Q., Baxevanis, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+multiple+Sox+genes+through+embryonic+development+in+the+ctenophore+Mnemiopsis+leidyi+is+spatially+restricted+to+zones+of+cell+proliferation.">Expression of multiple Sox genes through embryonic development in the ctenophore Mnemiopsis leidyi is spatially restricted to zones of cell proliferation.</a> EvoDevo. 5 (1), 15 (2014).</li><li>Traylor-Knowles, N. G., Kane, E. G., Sombatsaphay, V., Finnerty, J. R., Reitzel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-specific+and+developmental+expression+of+Dmrt+genes+in+the+starlet+sea+anemone,+Nematostella+vectensis.">Sex-specific and developmental expression of Dmrt genes in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis.</a> EvoDevo. 6 (1), (2015).</li><li>Barry, S. N., Crow, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+HoxA11+and+HoxA13+in+the+evolution+of+novel+fin+morphologies+in+a+representative+batoid+(Leucoraja+erinacea).">The role of HoxA11 and HoxA13 in the evolution of novel fin morphologies in a representative batoid (Leucoraja erinacea).</a> EvoDevo. 8 (1), 24 (2017).</li><li>Sharma, P. P., Gupta, T., Schwager, E. E., Wheeler, W. C., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdivision+of+arthropod+cap-n-collar+expression+domains+is+restricted+to+Mandibulata.">Subdivision of arthropod cap-n-collar expression domains is restricted to Mandibulata.</a> EvoDevo. 5 (1), 3 (2014).</li><li>Piatigorsky, J., Kozmik, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cubozoan+jellyfish:+an+Evo/Devo+model+for+eyes+and+other+sensory+systems.">Cubozoan jellyfish: an Evo/Devo model for eyes and other sensory systems.</a> The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 719-729 (2004).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

השיטה המתוארת ב פרוטוקול זה השתנה מהעבודה הקודמת מחקר התפתחותי רפואי ואבולוציוני8,9,10,12,17. פרוטוקול זה מתמקד הניואנסים של הכלאה בחיי עיר גשש אנטי-תחושה RNA התווית על-ידי לחפור על מבוגרים אלמוגים, אשר נשמר, נעוץ פרפין. בשיטה זו ניתן להעביר בקלות את דגימות של אורגניזמים מעבר אלמוגים זה היו גם פרפין-מוטבע. לבסוף, שיטה זו יכולה להתבצע בשלבים חיים שונים של אלמוגים (למשל, פגית) או בתוך תרביות תאים, אולם פרוטוקול מדויק עשויות להיות שונות מאז סוגים אלה של דגימות אינם תמיד פרפין-מוטבע5,6 .
ישנם מספר שלבים קריטיים פרוטוקול זה, לרבות הטיפול proteinase K, הכלאה של המכשיר, ופיתוח צבע של המכשיר. במהלך הטיפול proteinase K, התזמון חשוב מאוד. אם הטיפול הוא יותר הציע, רקמות ניתן להיות מושפל, פגום. בנוסף, לעצור התגובה proteinase K צריכה להתבצע בנקודה במשרה מלאה הקבועה. חשוב גם לשמור את הדגימה בטמפרטורה קבועה הכלאה, כמו ירידה בטמפרטורה יכול לגרום מחייב שאינם ספציפיים של המכשיר, לסבך את התוצאות. כשהם רוחצים את החללית, חשוב לקחת כל שקופית מהתנור הכלאה אחת בכל פעם, במקום כל בבת אחת, כדי להבטיח השקופיות לא hybridize עם החללית בטמפרטורה נמוכה. כמו כן, שטיפה של השקופיות לאחר בדיקה הכלאה תסייע למנוע מחייב שאינם ספציפיים. לבסוף, צבע פיתוח של המכשיר הוא אחד השלבים הקריטיים ביותר אך סובייקטיבית של תהליך זה. פיתוח צבע יכול להיות בקלות יתר על המידה או עצר מוקדם מדי. שלב זה דורש סבלנות, דריכות על מנת להבטיח את צביעת יתר של השקופיות אינו מתרחש.
פתרון בעיות בפרוטוקול זה יכול להיות תהליך מרתיע עקב מספר השלבים המעורבים. אם הפרוטוקול מניב תוצאות שליליות, אז עדיף להתחיל על-ידי בדיקת המכשיר כדי לוודא כי זה החוש אנטי (וגם לא התחושה) בדיקה. בנוסף, אם הפתרונות הישן, זה שווה חידושה או החלפתם ולכן הם טריים בעת ביצוע פרוטוקול זה. ניתן ליישם שינויים, כגון אורך הכלאה וחסימת, כדי להגדיל את הסיכוי של בדיקה הכלאה או הפחתת כמויות של רקע שאינם ספציפיים מכתים. בשל המספר הגבוה של השלבים של פרוטוקול זה, זה עשוי להיות קל לאבד; לכן, חשוב להישאר מאורגן ולעקוב אחר אילו חלקים של הפרוטוקול הושלמו. בנוסף, חיוני כדי להבטיח כי תדלג על שלבים לא, הזמן הזה הוא לא צמצם במהלך incubations, שוטף. כלל אצבע טוב נועד לאפשר יותר זמן מאשר שוטף קצר יותר כדי להבטיח כי כל השקופיות מנוקים ביסודיות.
המגבלה הגדולה ביותר של שיטה זו הוא כי התוצאות אינן לכימות. זוהי שיטה איכותי זה, ביחד עם שיטות אחרות כגון כפפות, transcriptomics פרוטאומיקס, מאוד אינפורמטיבי. בשל הבדלים הכלאה פעמים, כמו גם את הזמנים סובייקטיבית במהלך ויזואליזציה, לכימות עוצמת ההכתמה היא לא מושגת בקלות. . זה מפתה לומר כי בדיקה מתבטא גבוהה יותר אם זה מראה בעוצמה גדולה יותר, אך בגלל הוריאציות במאגר זה פרוטוקול (כגון משך הזמן המותר לפיתוח צבע), לא ניתן לקבוע סכומים ביטוי גנים.
טכניקה זו אינה שיטה חדשה בביולוגיה; עם זאת, זהו אחד לא מתבצע לעיתים קרובות על אלמוגים למבוגרים. השימוש בשיטה זו על אלמוגים למבוגרים חזק מאוד כי זה עוגנים נתונים ביטוי גנים טישו או תא הקלד11. Transcriptomics, גנומיקה הפכו כלי פופולרי וחזק בביולוגיה אלמוג; עם זאת, שיטות אלה נעשים בדרך כלל על homogenates של כל החיות. דבר זה הופך מאתגרת כדי לזהות אילו חלקים של האלמוגים הם ביטוי הגנים של עניין, ובכך יותר מאתגר להבין את המנגנונים בפועל. באמצעות איש יחד עם נתוני ביטוי גנים, יכולה להיות מושגת בצורה הוליסטית כדי ואיפה באיזו מידה באים לידי ביטוי של גנים. זה יעזור מאוד בהבנת המנגנונים אחראי מתח שונה מסלולים התגובה באלמוגים למבוגרים.

האלמוגים הם בוני המערכת האקולוגית קריטי וחשוב עבור מגוון ביולוגי האוקיינוס ובריאות האדם-1,-2,-3. הם תחת איום בשל שינויי האקלים ואת שאר גורמי אנתרופוגניים, אלמוג מינים רבים נחשבים בסכנת הכחדה חמורה. לפיכך, יש צורך בכלים תאית ומולקולרית לאבחן אלמוגים תחת לחץ משמעותי. בנוסף, יש קצת מובנת על שבו גנים מבוטאים בתוך רקמת האלמוג למבוגרים, ולכן מעט הבנה של הפונקציות של גנים אלה. כדי לטפל בבעיה זו, אנחנו הסתגלו בחיי עיר הכלאה (איש) הפרוטוקול, נפוץ האנושי רפואה וביולוגיה התפתחותית אבולוציונית, לשימוש על דגימות רקמה פרפין-מוטבע של אלמוגים למבוגרים. טכניקה זו היא עוצמתי ביותר כאשר משתמשים באלמוגים מבוגרים שעברו אירוע מלחיץ כגון חשיפה עומס חום. עם זאת, טכניקה זו ניתן להשתמש במגוון רחב של רקמות, שלבי החיים באלמוגים, אינה מוגבלת רק אלמוגים הדגיש חום4,6,7. בנוסף, ניתן להשתמש בטכניקה זו על רקמות או תאים של כל metazoan כל עוד יש cDNA רצף מידע זמין.
מטרת שיטה זו היא להמחיש RNA הגששים בתוך רקמת האלמוג למבוגרים יש כבר נשמר, המוטבעות פרפין, למחלקה על שקופיות. שיטה זו היא כלי אבחון רב עוצמה המאפשר הפריט החזותי של חומצות גרעין בתוך רקמת האלמוג למבוגרים. בתחילה שיטה זו פותחה עבור אבחון רפואי, זה ומאז הפך להיות כלי פופולרי בתחומים כגון ביולוגיה התפתחותית ביולוגיה אבולוציונית התפתחותית8,9,10. איש גם שיטה קריטי, במיוחד במערכות שאינן-דגם, כאשר גנומית, transcriptomic רצף נתונים זמינים אך דפוסי ביטוי מרחבי הגן אינם ידועים. לעבודה האבחון במערכות שאינן-דגם, טכניקה זו היא חזקה כי זה יכול לציין אילו תאים ורקמות אקספרס הגן עניין והוא יכול להוביל יותר ממוקד גישות טיפוליות8,9,10, 11,12. לבסוף, טכניקה זו היא חזקה יותר כאשר יחד עם נתונים של ביטוי כמותי ג'ין11וכמותיים.
הגישה המתוארים במאמר זה יהיה עניין החוקרים כבר עיצבו את digoxigenin (מחדירים)-הנקרא RNA בדיקה (הגיוני והן antisense הגששים) והם עכשיו מוכן לבצע בחיי עיר הכלאה של הגששים מדגם. כדי לבצע בשיטה זו, יהיה צורך שני מקטעי רקמה פרפין אלמוג טורי עבור כל בדיקה הנבדקת. מקטע אחד ישמש עבור המכשיר הגיוני והשני עבור המכשיר antisense. החללית הגיוני יהיה פקד כדי לציין מחייב שאינם ספציפיים. אם צביעת הוא ציין את הגשוש הגיוני, ואז המכשיר antisense אינה ספציפית הרנ א עניין. הגששים יכולים מיועד לכל הגן בא לידי ביטוי. פרוטוקול זה, מספר דוגמאות משמשים שנמצאו קודם לכן לבוא לידי ביטוי במהלך עומס חום באלמוגים: FBJ אוסטאוסרקומה מאתר אונקוגן ויראלי homolog B (פוס-B), מפעיל חלבון (AP1), גידול נקרוזה מקדם קולטן 41 (TNFR 41)11. איש באמצעות התווית על-ידי החפירה RNA הגששים היא עדיפה על שימוש רדיואקטיבי הגששים כי הטיפול הוא הרבה יותר בטוח10. בנוסף, טכניקה זו היא רגישה מאוד, ניתן לבצע מגוון רחב של רקמות העוברים מעבר חום הדגיש אלמוגים למבוגרים13,14,15,16.

<table><tbody><tr><td>Denhardt&#039;s solution</td><td>Affymetrix</td><td>70468 50 ML</td><td></td></tr><tr><td>Bioworld Alkaline phosphatase buffer</td><td>Fisher</td><td>50-198-724</td><td></td></tr><tr><td>Slide mailers</td><td>Fisher</td><td>12-587-17B</td><td></td></tr><tr><td>Bioworld Alkaline phosphatase buffer</td><td>Fisher</td><td>50-198-724</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon tubes</td><td>Fisher</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Salmon Sperm DNA solution</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>PBS - Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4</td><td>Invitrogen</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL</td><td>Invitrogen</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL</td><td>Invitrogen</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Salmon Sperm DNA solution</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Slide white apex superior adhesive</td><td>Leica Biosystems</td><td>3800080</td><td></td></tr><tr><td>PBS solution, pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010072</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Super Pap Pen Liquid Blocker</td><td>Promega</td><td>22309</td><td></td></tr><tr><td>DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>BM Purple, 100 mL</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>DIG Wash and Block Buffer Set</td><td>Roche</td><td>11585762001</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP</td><td>Roche</td><td>11681451001</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde solution, 500 mL size</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-500ML</td><td></td></tr><tr><td>SSC Buffer 20X concentration</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639-1L</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Anhydride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320102-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47670-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Triethanolamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90279-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td></td></tr><tr><td>Xylenes, AR (ACS), For Histological Use</td><td>VWR</td><td>MK866806</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>EM-EX0276-4S</td><td></td></tr><tr><td>TE buffer</td><td>VWR</td><td>PAV6232</td><td></td></tr><tr><td>hybridization oven</td><td>VWR</td><td>97005-252, 97005-254</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>VWR</td><td>89032-088</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples

אלמוגים הם אוקיינוס חשוב חסרי חוליות קריטית לבריאות הכללית של האוקיינוס, כמו גם בריאות האדם. עם זאת, בשל בהשפעה האנושית כגון עליית הטמפרטורות התחמצות, אלמוגים הם יותר ויותר תחת איום. כדי להתמודד עם האתגרים הללו, ההתקדמות התא וביולוגיה מולקולרית הוכיחו להיות חיונית לאבחון הבריאות של אלמוגים. שינוי כמה מן הטכניקות הנפוצות ברפואה האנושית יכולה לשפר באופן ניכר של חוקרים היכולת לטפל ולשמור אלמוגים. כדי לטפל בבעיה זו, עבור בחיי עיר הכלאה בעיקר בשימוש ברפואה האנושית וביולוגיה התפתחותית אבולוציונית פרוטוקול כבר מותאם לשימוש באלמוגים למבוגרים תחת לחץ.
מטרת שיטה זו היא להמחיש את הביטוי המרחבי של בדיקה RNA ברקמת האלמוג למבוגרים יש כבר מוטבע פרפין, למחלקה על גבי מדרון זכוכית. שיטה זו מתמקדת הסרת פרפין, התייבשות של המדגם, רעלני לדוגמה כדי להבטיח חדירות של המדגם, הכלאה קדם דגירה, הכלאה של המכשיר RNA, הפריט החזותי של המכשיר RNA. זוהי שיטה חזקה בעת שימוש אורגניזמים שאינם-דגם לגלות שבו באים לידי ביטוי גנים ספציפיים, הפרוטוקול ניתן להתאים בקלות עבור אורגניזמים אחרים שאינם-מודל. עם זאת, השיטה זו מוגבלת כי זהו בעיקר איכותיים, כי עוצמת הביטוי יכול להשתנות בהתאם כמות הזמן בשימוש במהלך השלב חזותי וריכוז של המכשיר. יתר על כן, סבלנות נדרשת, כמו פרוטוקול זה יכול לקחת עד 5 ימים (וגם במקרים רבים, ארוכים יותר) בהתאם המכשיר בשימוש. לבסוף, צביעת הרקע שאינם ספציפיים שכיחה, אך ניתן להתגבר על מגבלה זו.

לאחר השלמת פרוטוקול זה, זיהוי של תאים ורקמות כי הם ביטוי החללית RNA עניין תושג. התוצאות נציג עבור פרוטוקול זה מיועדות AP-1, FosB ו- TNFR41. התוצאות, שפורסמו קודם לכן על ידי טריילור-נואלס. et al. 11, הצג ביטוי מרחבי של RNA רגשים על אלמוגים למבוגרים זה נחשפו עומס חום. שתי דוגמאות מסוגים שונים מכתימים מוצגים באיור1. איור 1A היא דוגמה של צביעת רקמות ' מאטום לשקוף '. הכתם נמצא בכל הרקמות, לא רק בתוך תאים ספציפיים. . הנה, הביטוי של אנטי-תחושה AP-1 הוא נמצא בכל רחבי האפידרמיס ואת ה גסטרודרמיס אוראלי11 (איור 1 א'). ההכתמה הוא מפוזר, לא שביל לסוג תאים מסוים אחד. עבור סוג זה של צביעת, זה קריטי במיוחד להפעלת פקד הגיוני באותו זמן, כמו חלק התוצאות יכול להיות בגלל שאינם ספציפיים מכתים.
הסוג השני של צביעת הוא תא ספציפי, שבו הכתם נמצא רק סוגי תאים ספציפיים. FosB (איור 1B) והן TNFR41 (איור 1C) להראות מסוג זה מכתים. שני רגשים אלו שימשו על דגימות רקמה של אלמוגים למבוגרים זה שהיה חשוף של מתח חום11. בחלונית ' חוש אנטי ', צביעת סגול הוא ציין. TNFR41 היה בא לידי ביטוי בסוגים שונים של cnidocytes, משפחה של סוגי תאים זה נמצא רק בתוך cnidarians (איור 1). באופן ספציפי, זה מוכתם nematocytes המייצרים את אברון mastigophore microbasic (nematocysts), spirocytes לייצר spirocysts, מצאו כל בתוך האפידרמיס של רקמת האלמוג. Nematocytes מצויים גם שאר השכבות רקמות של האלמוג, כגון calicodermis; עם זאת, בשל לבצע דגימה מסוימת זו חלוקתה, המידע הזה לא ניתן לאסוף. FosB גם צבעונית cnidocytes והיה מסוים הן spirocytes והן nematocytes. שני הצדדים של רגשים אלו הפקד הגיוני הראתה לא מכתים, המציין כי ההכתמה עבור המכשיר אנטי-תחושה היה אכן ספציפיים. אלו רק שני סוגים של תוצאות נציג (צביעת רקמות ' מאטום לשקוף ', צביעת תאים ספציפיים) של טכניקות צביעת שעשויות להיות עם סוגים שונים של הגששים. עקב ההשתנות, חשוב להשתמש בפקד הגיוני לקבוע שאינם ספציפיים מכתים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57853/57853fig1.jpg"> איור 1: התוצאה נציג של איש זה מוכתם תאים ספציפיים. (א) בחלונית ' הראשונה, הגיוני שליטה על החללית AP-1 מראה כתמים קטנים היא מתנה בתוך השקופית. בחלונית ' השני, החללית אנטי-תחושה AP-1 מראה מכתים עם המכשיר הזה היא מפוזר ברחבי הרקמה. הכתם הוא ספציפי גסטרודרמיס שבעל-פה, האפידרמיס. עם סוג זה של צביעת, חיוני להפעלת פקד הגיוני כדי להבטיח ההכתמה שנצפה ספציפיים. (ב) פקד הגיוני עבור המכשיר FosB שבלוח הראשון מראה קטנה מכתים הנוכחי. בחלונית ' השני, החללית תחושה אנטי להופעות FosB מכתים ספציפי אל spirocytes ואל nematocytes, עם מפוזר מכתים בכל רחבי גסטרודרמיס האפידרמיס, אורלי. (ג) בחלונית ' הראשון, הפקד הגיוני עבור המכשיר TNFR 41 מראה כי צביעת קטן קיים על השקופית. בחלונית ' השני, רגש אנטי-תחושה TNFR 41 מראה מסוים מכתים בתוך spirocytes, nematocytes, microblastic mastigophores. קיצורים: spirocytes (SP), symbiodium (SY), nematocyte (NE), microbasic mastigophores (מ מ), המכילים ונאבו תא gastrodermal (סו). איור זה שוחזר עם הרשאה11. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57853/57853fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">
הערה: כל דילולים צריך להיעשות עם מים ללא תשלום RNase סטרילי, בלוק זכוכית.</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">מאגר Prehybe (50 מ"ל)</td>
			<td>להוסיף</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Formamide</td>
			<td>25 מ</td>
		</tr><tr><td colspan="3">X 20 האס (pH 4.5)</td>
			<td>מ"ל</td>
		</tr><tr><td colspan="3">הפארין 20 מ"ג/מ"ל</td>
			<td>0.1 מ"ל</td>
		</tr><tr><td colspan="3">50 X Denhardts</td>
			<td>5 מ</td>
		</tr><tr><td colspan="3">20% Tween-20</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">20% מרחביות</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">10 מ"ג/מ"ל זרע סלמון DNA (denature לפני הוספת)</td>
			<td>2 מ</td>
		</tr><tr><td colspan="3">מים חינם RNase</td>
			<td>4.4 מ</td>
		</tr><tr><td colspan="3">
הערה: הפתרון יכול להיות עשוי צינור disposible 50 מ. צריך להיות שפגע בסימני זרע סלמון על ידי הרתחה על גוש חום למשך 5 דקות לפני הוספת פתרון.</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">הכלאה מאגר (47 מ)</td>
			<td>להוסיף</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Formamide</td>
			<td>25 מ</td>
		</tr><tr><td colspan="3">X 20 האס (pH 4.5)</td>
			<td>מ"ל</td>
		</tr><tr><td colspan="3">הפארין 20 מ"ג/מ"ל</td>
			<td>0.1 מ"ל</td>
		</tr><tr><td colspan="3">50 X Denhardts</td>
			<td>5 מ</td>
		</tr><tr><td colspan="3">20% Tween-20</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">20% מרחביות</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">10 מ"ג/מ"ל זרע סלמון DNA (denature לפני הוספת)</td>
			<td>2 מ</td>
		</tr><tr><td colspan="3">מים חינם RNase</td>
			<td>1 מ"ל</td>
		</tr><tr><td colspan="3">
הערה: הפתרון יכול להיות עשוי צינור disposible 50 מ. צריך להיות שפגע בסימני זרע סלמון על ידי הרתחה על גוש חום למשך 5 דקות לפני הוספת פתרון.</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">X 10 PBS (1.0 L)</td>
			<td>להוסיף</td>
		</tr><tr><td colspan="3">18.6 מ"מ NaH2PO4
</td>
			<td>2.56 g</td>
		</tr><tr><td colspan="3">מ מ 84.1 נה2HPO4
</td>
			<td>11.94 g</td>
		</tr><tr><td colspan="3">1,750 מ מ NaCl</td>
			<td>102.2 g</td>
		</tr><tr><td colspan="3">
הערות: מערבבים פוספטים כ- 800 מ ל מים עבור אמצעי אחסון 1.0 L. בדוק את ה-pH. זה צריך להיות 7.4 ± 0.4. אחרת להתאים את ה-pH ל 7.4 עם NaOH של HCl. מוסיפים NaCl ואת שאר המים. לאחר ה-pH הוא אוטוקלב מנוכי עונתיות.</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">X 20 האס (1.0 L)</td>
			<td>להוסיף</td>
		</tr><tr><td colspan="3">NaCl 3 מ'</td>
			<td>175.3 g</td>
		</tr><tr><td colspan="3">0.3 M נה ציטראט</td>
			<td>88.2 g</td>
		</tr><tr><td colspan="3">
הערות: מערבבים כ 800 מ ל מים חינם RNase להביא אל אמצעי אחסון 1.0 L. להתאים את ה-pH 4.5 ו אוטוקלב.</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">מאגר אלקליין פוספטאז (AP) ללא MgCl2 (50 מ"ל)</td>
			<td>להוסיף</td>
		</tr><tr><td colspan="3">NaCl 1 מ'</td>
			<td>5.0 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">1 מ' טריס, pH 9.5</td>
			<td>5.0 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">20% Tween-20</td>
			<td>1.25 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">מים חינם RNase</td>
			<td>38.75 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">
הערות: להכין מראש רק להשתמש בצינור 50 מ.</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">אלקליין פוספטאז (AP) מאגר (100 מ"ל)</td>
			<td>להוסיף</td>
		</tr><tr><td colspan="3">NaCl 1 מ'</td>
			<td>10.0 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">MgCl 1 מ'2
</td>
			<td>5 מ</td>
		</tr><tr><td colspan="3">1 מ' טריס, pH 9.5</td>
			<td>10 מ</td>
		</tr><tr><td colspan="3">20% Tween-20</td>
			<td>2.5 מ</td>
		</tr><tr><td colspan="3">מים חינם RNase</td>
			<td>72.5 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">
הערות: להכין מראש רק להשתמש בצינור 50 מ ל. הפתרון הפך מעונן אחרי כמה שעות, כבר לא יעבוד עבור התגובה אנזימטיות.</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">פתרון AP המצע</td>
			<td>להוסיף</td>
		</tr><tr><td colspan="3">מאגר AP</td>
			<td>25 מ</td>
		</tr><tr><td colspan="3">NBT</td>
			<td>82.5 uL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">BCIP</td>
			<td>82.5 uL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">
הערות: ניתן להשתמש במקום מוניטור סגול. להכין מראש רק להשתמש בצינור 50 מ. שמור פתרון זה בחושך על ידי כיסוי התחתית בנייר, והכנת באור נמוך.</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">פתרון מניות proteinase K (10 mg/mL)</td>
			<td>להוסיף</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Proteinase K</td>
			<td>10 מ ג</td>
		</tr><tr><td colspan="3">מים חינם RNase</td>
			<td>10 מ</td>
		</tr><tr><td colspan="3">
הערות: Aliquot וחנות ב-20 ° C.</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Proteinase K עובד פתרון</td>
			<td>להוסיף</td>
		</tr><tr><td colspan="3">פתרון מניות proteinase K</td>
			<td>90 ul</td>
		</tr><tr><td colspan="3">1 X PBS</td>
			<td>מ ל 18</td>
		</tr><tr><td colspan="3">
הערות: לעשות רק לפני השימוש לקבלת התוצאות הטובות ביותר.</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">0.2 פתרון גליצין-PBS %</td>
			<td>להוסיף</td>
		</tr><tr><td colspan="3">10 X PBS</td>
			<td>45 מ</td>
		</tr><tr><td colspan="3">מים חינם RNase</td>
			<td>405 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">גליצין</td>
			<td>1 g</td>
		</tr><tr><td colspan="3">
הערות: להכין במיכל זכוכית בלוק. מערבבים בטמפרטורת החדר על צלחת stirer עד התפרקה לחלוטין גליצין.</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">מאגר חסימת Boehringer-מנהיים (30 מ"ל) (חלק החפירה לשטוף ואת ערכת מאגר בלוק)</td>
			<td>להוסיף</td>
		</tr><tr><td colspan="3">10 x חסימת פתרון</td>
			<td>3 מ</td>
		</tr><tr><td colspan="3">1 x חומצה maleic מאגר</td>
			<td>27 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">
הערות: להפוך רק לפני השימוש לקבלת התוצאות הטובות ביותר. פתרון חסימת מלאי חומצה maleic מאגר שימשו מ "לשטוף את החפירה של רחוב-מאגר קבע".</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">האס X 4 – 50% formamide (30 מ ל)</td>
			<td>להוסיף</td>
		</tr><tr><td colspan="3">20 X האס</td>
			<td>6 מ</td>
		</tr><tr><td colspan="3">50% formamide</td>
			<td>מ ל 24</td>
		</tr><tr><td colspan="3">
הערות: להכין מראש רק להשתמש בצינור 50 מ. הכינו מתחת מעבדה המנוע.</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">גליצרול הרכבה מדיה</td>
			<td>להוסיף</td>
		</tr><tr><td colspan="3">50 מ מ טריס, pH 8.4</td>
			<td>80 ΜL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">גליצרול</td>
			<td>20 ΜL</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: מלאי פתרונות עבור ביצוע בחיי עיר הכלאה. הטבלה היא רשימה של פתרונות מניות שונים הדרושים עבור פרוטוקול זה. סכומים כוללים מוערך לביצועים כ- 2 את פרסומי שקופיות. מומלץ להתאים סכומים כוללים מבוסס על הסכום של שקופיות המעובדות.

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples at JoVE.com

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

המטרה של פרוטוקול זה היא לבצע הכלאה בחיי עיר על דגימות אלמוגים מבוגרים שמוטבע פרפין, למחלקה על גבי מדרון זכוכית. זוהי שיטה איכותי המשמש כדי להמחיש את הביטוי המרחבי לווין אנטי-חוש RNA ברקמות פרפין-מוטבע.

בחיי עיר טכניקות הכלאה פרפין-מוטבע דגימות אלמוגים למבוגרים

Corals are important ocean invertebrates that are critical for overall ocean health as well as human health. However, due to human impacts such as rising ...

in-situ-hybridization-techniques-for-paraffin-embedded-adult-coral

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Environment

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

7.0K Views.  University of Miami, Rosenstiel School of Marine and Atmospheric Sciences. המטרה של פרוטוקול זה היא לבצע הכלאה בחיי עיר על דגימות אלמוגים מבוגרים שמוטבע פרפין, למחלקה על גבי מדרון זכוכית. זוהי שיטה איכותי המשמש כדי להמחיש את הביטוי המרחבי לווין אנטי-חוש RNA ברקמות פרפין-מוטבע.

Video: In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues comprising the Caribbean reef building corals Montastraeaannularis and M. faveolata. These approaches include fluorescence microscopy (FM), serial block face imaging (SBFI), and two-photon confocal laser scanning microscopy (TPLSM). SBFI provides deep tissue imaging after physical sectioning; it details the tissue surface texture and 3D visualization to tissue depths of more than 2 mm. Complementary FM and TPLSM yield ultra-high resolution images of tissue cellular structure. Results have: (1) identified previously unreported lobate tissue morphologies on the outer wall of individual coral polyps&#160;and (2) created the first surface maps of the 3D distribution and tissue density of chromatophores and algae-like dinoflagellate zooxanthellae endosymbionts. Spectral absorption peaks of 500 nm and 675 nm, respectively, suggest that M. annularis and M. faveolata contain similar types of chlorophyll and chromatophores. However, M. annularis and M. faveolata exhibit significant differences in the tissue density and 3D distribution of these key cellular components. This study focusing on imaging methods indicates that SBFI is extremely useful for analysis of large mm-scale samples of decalcified coral tissues. Complimentary FM and TPLSM reveal subtle submillimeter&#160;scale changes in cellular distribution and density in nondecalcified coral tissue samples. The TPLSM technique affords: (1) minimally invasive sample preparation,&#160;(2) superior optical sectioning ability,&#160;and (3) minimal light absorption and scattering, while still permitting deep tissue imaging.

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine polyp morphology and tissue structure in the Caribbean corals Montastraeaannularis and M. faveolata. Fluorescence, serial block face,&#160;and two-photon confocal laser scanning microscopy have identified lobate structure, polyp walls, and estimated chromatophore and zooxanthellae densities and distributions.

Multimodal שיטות מיקרוסקופית אופטיות לחשוף רקמות מורפולוגיה ומבנה פוליפ בקריביים אלמוגי בניית ריף

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues ...

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal. Such analysis of two or more genes needs to be complemented with in situ hybridization of other genes, or immunohistochemistry of their proteins, both in whole mounted developing organs or sections for detailed resolution of the cellular and tissue expression alterations. Combining multiple gene alterations requires the use of cre or flipase to conditionally delete genes and avoid embryonic lethality. Required breeding schemes dramatically enhance effort and cost proportional to the number of genes mutated, with an outcome of very few animals with the full repertoire of genetic modifications desired. Amortizing the vast amount of effort and time to obtain these few precious specimens that are carrying multiple mutations necessitates tissue optimization. Moreover, investigating a single animal with multiple techniques makes it easier to correlate gene deletion defects with expression profiles. We have developed a technique to obtain a more thorough analysis of a given animal; with the ability to analyze several different histologically recognizable structures as well as gene and protein expression all from the same specimen in both whole mounted organs and sections. Although mice have been utilized to demonstrate the effectiveness of this technique it can be applied to a wide array of animals. To do this we combine lipophilic dye tracing, whole mount in situ hybridization, immunohistochemistry, and histology to extract the maximal possible amount of data.

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

A combination of different techniques to maximize data collection from mouse tissue is presented.

שילוב של צבע lipophilic, באתרו</emהכלאה>, אימונוהיסטוכימיה ו היסטולוגיה

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Neuroscience

שיפור ניתוח FISH עבור גורמים אונקוגניים בדגימות רקמה סרטנית

Robust Detection of Gene Amplification in Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Samples by Fluorescence In Situ Hybridization

Focal gene amplification, such as extrachromosomal DNA (ecDNA), plays an important role in cancer development and therapy resistance. While sequencing-based methodologies enable an unbiased identification of ecDNA, cytogenetic-based techniques, such as fluorescence in situ hybridization (FISH), remain time and cost-effective for identifying ecDNA in clinical specimens. The application of FISH in formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue samples offers a unique avenue for detecting amplified genes, particularly when viable specimens are not available for karyotype examination. However, there is a lack of consensus procedures for this technique. This protocol provides comprehensive, fully optimized, step-by-step instructions for conducting FISH to detect gene amplification, including ecDNA, in FFPE tissue samples which present unique challenges that this protocol aims to overcome and standardize. By following this protocol, researchers can reproducibly acquire high-quality imaging data to assess gene amplification.

מחבר זרקור: FISH ככלי להערכת הגברה גנטית מדויקת בדגימות סרטן

This protocol provides a reproducible method to visualize gene amplification in formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue specimens.

זיהוי חזק של הגברה גנטית בדגימות משובצות פרפין קבועות פורמלין על ידי הכלאה פלואורסצנטית באתרו

Focal gene amplification, such as extrachromosomal DNA (ecDNA), plays an important role in cancer development and therapy resistance. While ...

Cancer Research

Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum

Cnidarians, including sea anemones, corals, and jellyfish, exhibit diverse morphology and lifestyles that are manifested in sessile polyps and free-swimming medusae. As exemplified in established models such as Hydra and Nematostella, stem cells and/or proliferative cells contribute to the development and regeneration of cnidarian polyps. However, the underlying cellular mechanisms in most jellyfish, particularly at the medusa stage, are largely unclear, and, thus, developing a robust method for identifying specific cell types is critical. This paper describes a protocol for visualizing stem-like proliferating cells in the hydrozoan jellyfish Cladonema pacificum. Cladonema medusae possess branched tentacles that continuously grow and maintain regenerative capacity throughout their adult stage, providing a unique platform with which to study the cellular mechanisms orchestrated by proliferating and/or stem-like cells. Whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) using a stem cell marker allows for the detection of stem-like cells, while pulse labeling with 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU), an S phase marker, enables the identification of proliferating cells. Combining both FISH and EdU labeling, we can detect actively proliferating stem-like cells on fixed animals, and this technique can be broadly applied to other animals, including non-model jellyfish species.

Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum

Here, we describe a protocol for visualizing stem-like proliferating cells in the jellyfish Cladonema. Whole-mount fluorescent in situ hybridization with a stem cell marker allows for the detection of stem-like cells, and 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine labeling enables the identification of proliferating cells. Together, actively proliferating stem-like cells can be detected.&#160;

הכלאה פלואורסצנטית באתרה ותיוג 5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין לתאים דמויי גזע במדוזה הידרוזואנית Cladonema pacificum

Cnidarians, including sea anemones, corals, and jellyfish, exhibit diverse morphology and lifestyles that are manifested in sessile polyps and ...

Developmental Biology

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

הר שלם<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של E8.5 לעוברי E11.5 עכבר

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Biology

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene expression. Microarray and next generation sequencing approaches are being used to investigate developmental, physiological and stress response processes, dissect epigenetic and small RNA pathways, and build large gene regulatory networks1-3. While these techniques facilitate the simultaneous analysis of large gene sets, they typically provide a very limited spatiotemporal resolution of gene expression changes. This limitation can be partially overcome by using either profiling method in conjunction with lasermicrodissection or fluorescence-activated cell sorting4-7. However, to fully understand the biological role of a gene, knowledge of its spatiotemporal pattern of expression at a cellular resolution is essential. Particularly, when studying development or the effects of environmental stimuli and mutants can the detailed analysis of a gene's expression pattern become essential. For instance, subtle quantitative differences in the expression levels of key regulatory genes can lead to dramatic phenotypes when associated with the loss or gain of expression in specific cell types. 
Several methods are routinely used for the detailed examination of gene expression patterns. One is through analysis of transgenic reporter lines. Such analysis can, however, become time-consuming when analyzing multiple genes or working in plants recalcitrant to transformation. Moreover, an independent validation to ensure that the transgene expression pattern mimics that of the endogenous gene is typically required. Immunohistochemical protein localization or mRNA in situ hybridization present relatively fast alternatives for the direct visualization of gene expression within cells and tissues. The latter has the distinct advantage that it can be readily used on any gene of interest. In situ hybridization allows detection of target mRNAs in cells by hybridization with a labeled anti-sense RNA probe obtained by in vitro transcription of the gene of interest. 
Here we outline a protocol for the in situ localization of gene expression in plants that is highly sensitivity and specific. It is optimized for use with paraformaldehyde fixed, paraffin-embedded sections, which give excellent preservation of histology, and DIG-labeled probes that are visualized by immuno-detection and alkaline-phosphatase colorimetric reaction. This protocol has been successfully applied to a number of tissues from a wide range of plant species, and can be used to analyze expression of mRNAs as well as small RNAs8-14.

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

The in situ hybridization protocol described here allows a direct localization of mRNA and small RNA expression at the cellular level with high sensitivity and specificity. The procedure is optimized for paraffin-embedded plant tissue sections, is applicable to a wide range of plants and tissues, and can be completed within ten days.

ב הכלאה באתרו עבור לוקליזציה המדויק של תמלילי בצמחים

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

רנ&quot;א<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה בעוברי הר שלמים והיסטולוגיה הסלולרית מותאמת לElasmobranchs הימי

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a model for human diseases. Gene function study is based on the detection of gene expression patterns. Although immunohistochemistry offers a powerful way to assay protein expression, the limited number of commercially available antibodies in zebrafish restricts the application of costaining. In situ hybridization is widely used in zebrafish embryos to detect mRNA expression. This protocol describes how to obtain images by combining in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish embryo sections. In situ hybridization was performed prior to cryosectioning, followed by antibody staining. Immunohistochemistry and the imaging of a single cryosection were performed after in situ hybridization. The protocol is helpful to unravel the expression pattern of two genes, first by in situ transcript detection and then by immunohistochemistry against a protein in the same section.

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

This protocol describes how to obtain images by combining in situ hybridization and immunohistochemistry of zebrafish embryonic sections. In situ hybridization was performed prior to cryosectioning, followed by antibody staining. It is useful to detect the expression patterns of two genes in zebrafish if there is a paucity of antibodies.

ב Situ הכלאה בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה בעוברי דגי זברה Cryosectioned

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a ...

בחיי עיר טכניקות הכלאה פרפין-מוטבע דגימות אלמוגים למבוגרים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Multimodal שיטות מיקרוסקופית אופטיות לחשוף רקמות מורפולוגיה ומבנה פוליפ בקריביים אלמוגי בניית ריף

שילוב של צבע lipophilic, באתרו, אימונוהיסטוכימיה ו היסטולוגיה

זיהוי חזק של הגברה גנטית בדגימות משובצות פרפין קבועות פורמלין על ידי הכלאה פלואורסצנטית באתרו

זיהוי חזק של הגברה גנטית בדגימות משובצות פרפין קבועות פורמלין על ידי הכלאה פלואורסצנטית באתרו

זיהוי חזק של הגברה גנטית בדגימות משובצות פרפין קבועות פורמלין על ידי הכלאה פלואורסצנטית באתרו

הכלאה פלואורסצנטית באתרה ותיוג 5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין לתאים דמויי גזע במדוזה הידרוזואנית Cladonema pacificum

הר שלם

ב הכלאה באתרו עבור לוקליזציה המדויק של תמלילי בצמחים

רנ"א

ב Situ הכלאה בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה בעוברי דגי זברה Cryosectioned