Diese Arbeit wurde von Award finanziert keine. OCE-1323652 durch die National Science Foundation Ocean Science Postdoctoral Fellowship und Award-no.1012629 von Burroughs Wellcome Fonds Postdoctoral Enrichment Program.

1. Entfernung des Paraffins
Achtung: Führen Sie die folgenden Schritte unter einem Abzug.
<ol><li>Wachsentfernung dünn geschnittene Paraffin-eingebetteten Folien mit 100 % Xylol unter der Haube in Coplin Gläser für 10 Minuten. Verwenden Sie keine Coplin Plastikdosen, wie Xylol Kunststoff schmilzt. Sterilisieren Sie die Coplin Gläser im Autoklav vor Gebrauch.</li>
	<li>Bereiten Sie vier sterile Coplin Gläsern mit den folgenden: 100 % Ethanol, 80 % Ethanol, Ethanol 70 % und 60 % Ethanol. Das Ethanol mit RNase-freies Wasser zu verdünnen.<ol>
<li>Die Folien zu den sterilen Coplin Behälter mit 100 % Ethanol zu übertragen und für 10 Minuten einweichen. Leeren Sie nach 10 min Coplin Glas zu, und ersetzen Sie durch neue 100 % Ethanol. Die Folien wieder für 10 Minuten einweichen.</li>
		<li>Übertragen Sie die Folien auf die sterile Glas Coplin mit 80 % igem Ethanol für 1 min.</li>
		<li>Übertragen Sie die Folien auf die sterile Coplin Glas mit 70 % igem Ethanol für 1 min.</li>
		<li>Übertragen Sie die Folien auf die sterile Glas Coplin mit 60 % Ethanol für 1 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Vorbehandlung von Folien für die Vorbereitung der RNA-Sonde Hybridisierung
<ol><li>Führen Sie die folgenden Waschungen bei Raumtemperatur, sofern nicht anders angegeben. Führen Sie Raumtemperatur Waschungen auf einem Orbitalschüttler mit langsamer Geschwindigkeit. Verwenden Sie sterile Folie Versandtaschen mit Platz für bis zu fünf Folien für das Waschen der Folien.</li>
	<li>Die Folien auf einem sterilen Folie Mailer mit 18 mL 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) übertragen. Wäsche für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Gießen Sie 1 X PBS, und sofort behandeln Sie das Gewebe auf den Folien mit Proteinase K Sonde Durchdringung des Gewebes ermöglichen. Die Folie Mailer ca. 18 mL Proteinase K-Lösung hinzufügen (siehe Tabelle 1 für die Lösungskonzentration Arbeit). Inkubation bei 37 ° C für 15 Minuten. Nicht schütteln.<ol>
<li>Während die Folien Inkubation sind, bereiten Sie prehybridization Puffer (Prehybe Puffer). Legen Sie den Prehybe-Puffer in einem kochenden Wasserbad für 10 min, dann auf einem Eisbad für 5 min abkühlen lassen. Nach einem Rezept von Prehybe Puffer siehe Tabelle 1.</li>
		<li>Stoppen Sie Verdauung der Proteinase K Reaktion durch Ausgießen der Proteinase K-Lösung zu, und sofort 18 mL 0,2 % Glycin-PBS-Lösung für Folie Mailer. Lassen Sie die Folie-Mailer für 5 min bei Raumtemperatur sitzen.</li>
		<li>Gießen Sie die 0,2 % Glycin-PBS-Lösung und jede Folie Mailer fügen Sie 18 mL 2 X Kochsalzlösung Natriumcitrat (SSC) Lösung hinzu. Waschen Sie die Folien in den 2 X SSC für 10 min bei Raumtemperatur, mit 100-150 u/min schütteln.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Prehybridization von Folien in Vorbereitung für die RNA-Sonde Hybridisierung
<ol><li>Während die Folien mit 2 gewaschen werden X SSC, erhalten einen neue sterile Folie Mailer und ca. 18 mL Prehybe Puffer in Folie Mailer. Legen Sie die Folie Mailer in Hybridisierung Backofen bei Hybridisierung Temperatur. Hinweis: Die Hybridisierung Temperatur hängt von der Sonde verwendet wird, aber in der Regel reicht von 50-60 ° C.</li>
	<li>Nach Abschluss der 2 X SSC Wäsche 2 x SSC und Ort Ausgießen der Folien in der Dia-Mailer in der Prehybe-Puffer in der Hybridisierung Ofen für 1 h.</li>
</ol>(4) Hybridisierung der RNA-Sonde
<ol><li>Während die Folien mit dem Prehybe-Puffer in der Hybridisierung Ofen Inkubation sind, bereiten Sie Hybridisierung-Sonde Lösung.<ol>
<li>Jede Sonde in Hybridisierung Puffer (0,5 µL der Sonde mit 24,5 µL Hybridisierung Puffer) verdünnen. Hinweis: Das Rezept für Hybridisierung Puffer findet sich in Tabelle 1. Ein Beispiel der Sonde Vorbereitung und Konzentrationen finden im Traylor-Knowles Et al. 11.</li>
		<li>Legen Sie die verdünnte Probe auf einem Heizblock 86-90 ° C für 12 min, dann für 1 min auf Eis abkühlen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfernen Sie den Folie Mailer aus dem Ofen Hybridisierung und entfernen Sie Folien einzeln von der Folie-Mailer mit einer sterilen Pinzette. Legen Sie die Folien flach auf ein Papiertuch und wischen Sie vorsichtig überschüssiges Prehybe Puffer um Gewebeproben. Achten Sie darauf, nicht zu die Proben zu berühren und arbeiten schnell, um zu verhindern, Trocknung von Gewebeproben.</li>
	<li>Umschließen Sie das Gewebe mit einem PAP-Stift. Gelten Sie 25 µL der verdünnten Probe Lösung mit einer Pipette und bedecken Sie die Probe mit einem Kunststoff deckgläschen.<ol>
<li>Legen Sie die Proben in der Folie Feuchtigkeit Kammer mit 4 x SSC + 50 % Formamid-Lösung in den Boden der Kammer.</li>
		<li>Sobald Sonden auf alle Folien hinzugefügt wurden, legen Sie die Folie Feuchtigkeit Kammer in der Hybridisierung Ofen für mindestens 24 Stunden bei einer Hybridisierung-Temperatur von 50-60 ° C. Die Inkubationszeit sollte variiert abhängig von der Konzentration der Sonde jedoch mindestens 24 Stunden lang.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nehmen Sie nach der Übernachtung Inkubation mit der verwässerte Sonden die Folie Feuchtigkeit Kammer aus der Hybridisierung Ofen.<ol>
<li>Entfernen Sie Deckgläsern aus einzelnen Dias, ohne dabei das Gewebe verdrängen. In einer 1000 µL Pipette 1000 µL 2 X SSC-Lösung hinzufügen und die Folie vorsichtig abwaschen.</li>
		<li>Legen Sie die Folie in einem sterilen Folie Mailer mit 18 mL 2 X SSC-Lösung für 5 min bei Raumtemperatur. Gießen Sie die Lösung und ersetzen Sie es mit 18 mL frische 2 X SSC. Wiederholen Sie die Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur mit sanft schütteln.</li>
		<li>Gießen Sie die 2 X SSC-Lösung. 18 mL 1 X SSC Lösung und Wäsche für 5 min bei Raumtemperatur hinzugeben. Gießen Sie 1 X SSC Lösung und ersetzen Sie es mit 18 mL frische 1 X SSC. Wiederholen Sie die Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur mit sanft schütteln.</li>
		<li>Gießen Sie die 1 X SSC. 18 mL 0,5 x SSC und Wäsche für 10 min bei 42 ° C ohne schütteln hinzugeben. Gießen Sie die 0,5 x SSC und ersetzen es mit 18 mL frische 0,5 X SSC. Ohne schütteln wieder für 10 min bei 42 ° C waschen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(5) Visualisierung der RNA-Sonde
Hinweis: Für die Visualisierung der Sonde, BM lila während des Entwicklungsprozesses verwendet werden. Allerdings müssen mehrere Wäschen vor diesem Schritt Vorbereitung der Proben für das Beflecken.
<ol><li>Waschen Sie die Folien mit 18 mL Puffer alkalische Phosphatase (AP-Puffer), ohne MgCl2 für 1 min. Ausgießen der AP-Puffer ohne MgCl2, und 18 mL 1 X Boehringer Mannheim blockierende Puffer mit Maleic Säure-Puffer verdünnt. Mindestens 1 h bei Raumtemperatur in einer Dia-Mailer mit sanft schütteln inkubieren. Hinweis: Der Boehringer Mannheim blockierende Puffer Maleic Acid Puffer verwendet vorgefertigte und in dem Graben waschen und Block Puffer Set gekauft (erhältlich im Handel).<ol>
<li>Alternativ kann die Inkubation über Nacht bei 4 ° C durchgeführt werden. Mehr Sperrfrist verringert das Auftreten von unspezifischen Bindung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie die 20 mL verdünnten DIG Anti-Digoxigenin-AP-Fab-Fragmente (Anti-DIG-Antikörper = 2 µL Anti-DIG-Antikörper + 20 mL 1 x Boehringer Mannheim blockierende Puffer). Das ist genug für den Einsatz in 1 Kunststoff-Folie-Mailer. Mehr von dieser Lösung müssen bereit sein, wenn mehr als eine Folie Mailer verwendet werden soll.</li>
	<li>Eine neue sterile Folie Mailer der Anti-DIG-Antikörper hinzu, und übertragen Sie die Folien auf die Folie-Mailer mit der Anti-DIG Antikörperlösung. Inkubation bei Raumtemperatur für 3 h mit sanft schütteln.</li>
	<li>Nach der Inkubation Ausgießen des Anti-DIG-Antikörpers und waschen Sie die Folien in der Dia-Mailer mit 18 mL AP-Puffer ohne MgCl2 für 5 min mit sanft schütteln.</li>
	<li>Der AP-Puffer ohne MgCl2, Gießen Sie aus und 18 mL AP-Puffer. Wäsche für 5 min mit sanft schütteln. Gießen Sie nach 5 min Inkubation den AP-Puffer, ersetzen Sie es mit 18 mL frisch AP-Puffer und waschen für 5 min mit sanft schütteln.</li>
	<li>Gießen Sie in der Dunkelheit die AP-Puffer und 18 mL BM lila an der Folie-Mailer. Die Folien bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren, Überprüfung auf lila Farbe Entwicklung jedes ½ h. Reaktionszeiten für die Visualisierung variieren basierend auf der Sonde, die entwickelt wird. Hinweis: Anstelle von BM lila Visualisierung Entwicklungslösung erfolgen mit 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) und Nitro blau tetrazoliumsalz (NBT). Siehe Tabelle 1 für Anweisungen.</li>
	<li>Vorbeischauen Sie Farbentwicklung, die Dias auf eine neue sterile Folie Mailer mit 18 mL Tris-EDTA (TE)-Puffer für 5 min bei Raumtemperatur im Dunkeln zu übertragen.</li>
	<li>Gießen Sie die TE-Puffer und 18 mL RNase-freies Wasser auf die Folie Mailer und Wäsche für 1 min, im Dunkeln.</li>
	<li>Entfernen Sie die Folien aus dem Wasser, und trocknen Sie sie an den Rändern des Gewebes. Fügen Sie Glycerin Montage Medium hinzu und platzieren Sie die Deckgläsern. Speichern Sie die Folien bei 4 ° C bis Bilder aufgenommen werden können.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hughes, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Climate+Change,+Human+Impacts,+and+the+Resilience+of+Coral+Reefs.">Climate Change, Human Impacts, and the Resilience of Coral Reefs.</a> Science. 301 (5635), 933 (2003).</li><li>Chen, P. -. Y., Chen, C. -. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+identifies+candidate+genes+for+key+roles+in+coral+development.">Microarray analysis identifies candidate genes for key roles in coral development.</a> BMC Genomics. 9 (1), 540 (2008).</li><li>Miller, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+innate+immune+repertoire+in+Cnidaria+-+ancestral+complexity+and+stochastic+gene+loss.">The innate immune repertoire in Cnidaria - ancestral complexity and stochastic gene loss.</a> Genome Biology. 8 (4), R59 (2007).</li><li>Shinzato, C., Iguchi, A., Hayward, D. C., Technau, U., Ball, E. E., Miller, D. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdivision+of+arthropod+cap-n-collar+expression+domains+is+restricted+to+Mandibulata.">Subdivision of arthropod cap-n-collar expression domains is restricted to Mandibulata.</a> EvoDevo. 5 (1), 3 (2014).</li><li>Piatigorsky, J., Kozmik, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cubozoan+jellyfish:+an+Evo/Devo+model+for+eyes+and+other+sensory+systems.">Cubozoan jellyfish: an Evo/Devo model for eyes and other sensory systems.</a> The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 719-729 (2004).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In diesem Protokoll beschriebene Methode wurde von der früheren Arbeit in medizinischen und evolutionäre Entwicklungsforschung8,9,10,12,17geändert. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Nuancen der eine in Situ Hybridisierung mit einer Grabung beschriftet RNA Gegenstrang Sonde auf Erwachsenen Korallen, die konserviert und in Paraffin eingebettet wurden. Diese Methode kann leicht Proben von Organismen über Korallen übertragen werden, die auch Paraffin eingebettet wurden. Zu guter Letzt diese Methode kann in verschiedenen Lebensphasen von Korallen (z.B. Larve) oder in Zellkulturen durchgeführt werden, aber das genaue Protokoll kann abweichen, da diese Arten von Proben nicht immer Paraffin-eingebetteten5,6 .
Es gibt mehrere wichtige Schritte in diesem Protokoll, einschließlich der Behandlung von Proteinase K, Hybridisierung der Sonde und Farbentwicklung der Sonde. Während der Behandlung Proteinase K ist das Timing sehr wichtig. Wenn die Behandlung länger als empfohlen wird, können Gewebe abgebaut und beschädigt werden. Darüber hinaus sollte das Anhalten der Proteinase K-Reaktion an der Vollzeit-Stelle angegeben durchgeführt werden. Es ist auch wichtig, die Probe bei einer Konstanten Hybridisierung Temperatur zu halten als die Absenkung der Temperatur kann verursachen unspezifische Bindung der Sonde und Ergebnisse zu erschweren. Beim Ausschalten der Sonde zu waschen, ist es wichtig, jede Folie aus der Hybridisierung Ofen eine nehmen, anstatt alles auf einmal, um sicherzustellen, dass die Folien nicht mit der Sonde bei einer niedrigen Temperatur hybridisieren. Darüber hinaus hilft gründliches Waschen der Folien nach der Sonde Hybridisierung unspezifischen Bindung zu vermeiden. Zu guter Letzt ist Farbentwicklung der Sonde einer der kritischen noch subjektive Schritte dieses Prozesses. Die Farbentwicklung kann leicht übertrieben oder zu früh beendet. Dieser Schritt erfordert Geduld und Wachsamkeit, um sicherzustellen, dass über Färbung der Folien findet nicht statt.
Problembehandlung bei dieses Protokoll kann eine schwierige Prozess aufgrund der Anzahl der Schritte sein. Wenn das Protokoll führt zu negativen Ergebnissen, dann es am besten ist, um anhand der Sonde um sicherzustellen, dass es die Anti-Sense (und nicht der Sinn) ist Sonde. Zusätzlich, wenn die Lösungen alt sind, lohnt es sich neu zu gestalten oder sie zu ersetzen, so dass sie frisch sind, bei der Durchführung dieses Protokolls. Änderungen, wie die Längen der Hybridisierung und blockieren, können implementiert werden, erhöhen Sie die Chancen der Sonde Hybridisierung oder Verringerung der Mengen von Hintergrund und unspezifische Färbung. Aufgrund der hohen Anzahl der Schritte in diesem Protokoll ist es leicht den Überblick verlieren möglicherweise; Daher ist es wichtig, stets gut organisiert und nachverfolgen, welche Teile des Protokolls abgeschlossen haben. Darüber hinaus ist es wichtig, sicherzustellen, dass keine Schritte übersprungen, und damals ist nicht während der Inkubationen und Waschungen geverringert. Eine gute Faustregel ist, um zu ermöglichen länger statt kürzer wäscht um sicherzustellen, dass alle Folien gründlich gereinigt werden.
Die größte Einschränkung dieser Methode ist, dass die Ergebnisse nicht quantifizierbar sind. Dies ist eine qualitative Methode, die im Konzert mit anderen Methoden wie Histologie, Transkriptom und Proteomics, sehr informativ ist. Aufgrund von Schwankungen Hybridisierung Zeiten sowie die subjektive Zeiten während der Visualisierung ist die Intensität der Färbung Quantifizierung nicht leicht erreicht. Es ist verlockend zu sagen, dass eine Sonde höher exprimiert wird, wenn es größeren Intensität zeigt, aber aufgrund der Schwankungen in diesem Protokoll (z. B. die Menge der Frist für die Farbentwicklung) Gen Ausdruck Beträge nicht ermittelt werden kann.
Diese Technik ist keine neue Methode in der Biologie; Allerdings ist es eine nicht sehr oft auf Erwachsenen Korallen durchgeführt. Die Verwendung dieser Methode auf Erwachsenen Korallen ist sehr mächtig, weil es Genexpressionsdaten ein Gewebe Anker oder eine Zelle geben Sie11. Transkriptom und Genomik sind beliebte und leistungsstarke Werkzeuge in Korallen Biologie geworden; Diese Methoden sind jedoch in der Regel auf Homogenates des ganzen Tieres erfolgt. Dies macht es schwierig zu erkennen, welche Teile der Koralle die Gene von Interesse zum Ausdruck bringen, und somit schwieriger zu verstehen, die tatsächlichen Mechanismen. Durch den Einsatz von ISH zusammen mit Genexpressionsdaten lässt ein ganzheitlicherer Ansatz, wo und in welchem Umfang Gene exprimiert werden. Dies wird in das Verständnis der Mechanismen für verschiedene Stress Reaktion Wege in Erwachsenen Korallen sehr helfen.

Korallen sind kritische Ökosystem Bauherren und wichtig für die biologische Vielfalt in den Ozean und menschliche Gesundheit1,2,3. Sie sind bedroht durch Klimawandel und anderen anthropogenen Stressfaktoren, und viele Korallenarten gelten als vom Aussterben bedroht. Somit ist ein erheblicher Bedarf für Zelluläre und molekulare Werkzeuge zur diagnose von Korallen unter Stress. Außerdem ist es wenig über wo Gene innerhalb von Erwachsenen korallengewebes und daher wenig Verständnis für die Funktionen dieser Gene exprimiert werden verstanden. Um dieses Problem zu beheben, haben wir in Situ Hybridisierung (ISH), häufig verwendete Protokoll in der Humanmedizin und evolutionären Entwicklungsbiologie, für den Einsatz auf Paraffin-eingebetteten Gewebeproben von Erwachsenen Korallen angepasst. Diese Technik ist mächtigsten auf Erwachsenen Korallen verwendet, die ein belastendes Ereignis wie Hitzestress unterzogen wurden. Doch diese Technik kann auf eine Vielzahl von Geweben und Lebensphasen in Korallen verwendet werden und beschränkt sich nicht nur Wärme betonte Korallen4,6,7. Darüber hinaus kann diese Technik auf Gewebe oder Zellen von jeder riffbildende verwendet werden, solange gibt es cDNA-Sequenzinformationen.
Der Zweck dieser Methode ist, RNA-Sonden in Erwachsenen korallengewebe zu visualisieren, die bewahrt und in Paraffin eingebettet und auf Objektträger geschnitten. Diese Methode ist ein leistungsfähiges Diagnosetool, das für die Visualisierung von Nukleinsäuren in Erwachsenen korallengewebe ermöglicht. Ursprünglich wurde diese Methode für die medizinische Diagnostik entwickelt, und es ist seitdem ein beliebtes Hilfsmittel in Bereichen wie Entwicklungsbiologie und evolutionären Entwicklungsbiologie8,9,10. ISH ist auch eine kritische Methode, vor allem in nicht-Modellsysteme, wenn genomische und transkriptomischen Sequenzdaten sind verfügbar, aber räumliche gen Expressionsmuster sind unbekannt. Für die diagnostische Arbeit in nicht-Modellsystemen ist diese Technik mächtig, weil sie angeben kann, welche Zellen und Geweben ein Gen des Interesses Express und zu mehr zielgerichtete Therapieansätze8,9,10führen, 11,12. Zu guter Letzt ist diese Technik qualitativer und leistungsfähiger, wenn gepaart mit quantitativen Gen Ausdruck Daten11.
In diesem Papier skizzierte Ansatz werden von Interesse für Forscher, die bereits eine Digoxigenin (DIG) entworfen haben-mit der Bezeichnung RNA-Sonde (Sinn und Antisense-Sonden) und sind nun bereit, in Situ Hybridisierung der Sonden zu einer Probe durchführen. Um diese Methode durchzuführen, benötigt zwei Schnittserien eines Gewebes, Paraffin Korallen für jede Sonde getestet. Ein Teil wird für die Sinne-Sonde und die andere für die antisense-Sonde verwendet werden. Die Sinn-Sonde wird ein Steuerelement an unspezifischen Bindung sein. Wenn Färbung in der Sinn-Sonde beobachtet wird, ist die antisense-Sonde nicht spezifisch für die RNA von Interesse. Sonden können für jedes Gen ausgedrückt ausgelegt werden. In diesem Protokoll werden mehrere Beispiele verwendet, die bisher gefunden wurden, während Hitzestress in Korallen ausgedrückt werden: FBJ murinen Osteosarkom viral Oncogene Homolog B (Fos-B), Activator Protein (AP1) und Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor 41 (TNFR 41)11. ISH mit DIG-Label RNA-Sonden wird vorgezogen mit radioaktiven Sonden, weil deren Handhabung viel sicherer10ist. Darüber hinaus ist diese Technik ist sehr empfindlich und kann auf eine Vielzahl von Geweben und Embryonen über Wärme-gestressten Erwachsenen Korallen13,14,15,16durchgeführt werden.

<table><tbody><tr><td>Denhardt&#039;s solution</td><td>Affymetrix</td><td>70468 50 ML</td><td></td></tr><tr><td>Bioworld Alkaline phosphatase buffer</td><td>Fisher</td><td>50-198-724</td><td></td></tr><tr><td>Slide mailers</td><td>Fisher</td><td>12-587-17B</td><td></td></tr><tr><td>Bioworld Alkaline phosphatase buffer</td><td>Fisher</td><td>50-198-724</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon tubes</td><td>Fisher</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Salmon Sperm DNA solution</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>PBS - Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4</td><td>Invitrogen</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL</td><td>Invitrogen</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL</td><td>Invitrogen</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Salmon Sperm DNA solution</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Slide white apex superior adhesive</td><td>Leica Biosystems</td><td>3800080</td><td></td></tr><tr><td>PBS solution, pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010072</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Super Pap Pen Liquid Blocker</td><td>Promega</td><td>22309</td><td></td></tr><tr><td>DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>BM Purple, 100 mL</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>DIG Wash and Block Buffer Set</td><td>Roche</td><td>11585762001</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP</td><td>Roche</td><td>11681451001</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde solution, 500 mL size</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-500ML</td><td></td></tr><tr><td>SSC Buffer 20X concentration</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639-1L</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Anhydride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320102-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47670-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Triethanolamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90279-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td></td></tr><tr><td>Xylenes, AR (ACS), For Histological Use</td><td>VWR</td><td>MK866806</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>EM-EX0276-4S</td><td></td></tr><tr><td>TE buffer</td><td>VWR</td><td>PAV6232</td><td></td></tr><tr><td>hybridization oven</td><td>VWR</td><td>97005-252, 97005-254</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>VWR</td><td>89032-088</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples

Korallen sind wichtige Ozean Wirbellosen, die entscheidend für die allgemeine Gesundheit der Meere sowie die menschliche Gesundheit sind. Korallen sind jedoch durch menschliche Einflüsse wie steigenden Meerestemperaturen und Versauerung bedroht. Um diese Herausforderungen zu bewältigen, erwiesen Fortschritte in der Zell- und Molekularbiologie sich für die Gesundheit der Korallen Diagnose von entscheidender Bedeutung. Ändern einige der häufig in der Humanmedizin verwendet Techniken könnte erheblich verbessern Forscher Fähigkeit Korallen zu behandeln. Um dieses Problem anzugehen, wurde ein Protokoll zur in Situ Hybridisierung verwendet, vor allem in der Humanmedizin und evolutionären Entwicklungsbiologie angepasst für den Einsatz in Erwachsenen Korallen unter Stress.
Der Zweck dieser Methode ist den räumliche Ausdruck einer RNA-Sonde in Erwachsenen korallengewebe zu visualisieren, die in Paraffin eingebettet und auf Objektträger geschnitten wurde. Diese Methode konzentriert sich auf die Entfernung des Paraffins und Rehydrierung der Probe, Vorbehandlung der Probe zur Durchlässigkeit der Probe, Pre-Hybridisierung Inkubation, Hybridisierung der RNA-Sonde und Visualisierung der RNA-Sonde zu gewährleisten. Dies ist eine leistungsfähige Methode, wenn nicht Modellorganismen mit um zu entdecken, wo bestimmte Gene exprimiert, und das Protokoll kann für andere Modellorganismen leicht angepasst werden. Die Methode ist jedoch beschränkt, dass es sich in erster Linie qualitative, da Ausdruck Intensität, abhängig von der Höhe der Zeit während der Visualisierung Schritt und die Konzentration der Sonde verwendet variieren kann. Darüber hinaus ist Geduld erforderlich, da dieses Protokoll bis zu 5 Tagen (und in vielen Fällen länger) abhängig von der verwendeten Sonde nehmen kann. Zu guter Letzt unspezifische Hintergrundfärbung ist üblich, aber diese Einschränkung überwunden werden kann.

Nach Abschluss dieses Protokolls, erfolgt die Identifikation von Zellen und Geweben, die die RNA-Sonde von Interesse zum Ausdruck bringen. Die repräsentativen Ergebnisse für dieses Protokoll sind für AP-1, FosB und TNFR41. Diese Ergebnisse, zuvor von Traylor-Knowles Et Al. veröffentlicht 11, Sonden zeigen räumliche Ausdruck der RNA auf Erwachsenen Korallen, die Hitze-Stress ausgesetzt waren. Zwei Beispiele verschiedener Färbung sind in Abbildung 1dargestellt. Abbildung 1A ist ein Beispiel der diffusen Gewebe Färbung. Der Fleck wird durch das Gewebe, nicht nur in bestimmten Zellen gefunden. Hier ist der Ausdruck der Gegenstrang AP-1 in der Epidermis und der mündlichen Gastrodermis11 (Abb. 1A). Die Färbung ist diffus und nicht auf eine bestimmte Zelle getrennt. Für diese Art der Färbung ist es besonders kritisch, eine Sinn-Steuerelement zur gleichen Zeit auszuführen, wie einige der Ergebnisse möglicherweise aufgrund unspezifischer Färbung.
Die zweite Art der Färbung ist zellspezifische, in denen der Fleck nur in bestimmten Zelltypen gefunden wird. FosB (Abbildung 1 b) und TNFR41 (Abbildung 1) diese Art der Färbung zeigen. Beide diese Sonden waren an Gewebeproben von Erwachsenen Korallen verwendet, die eine Hitze-Stress-11ausgesetzt waren. Im Bereich Anti-Sense ist eine lila Färbung beobachtet. TNFR41 drückte sich in verschiedenen Arten von Cnidocytes, einer Familie von Zelltypen, die nur innerhalb von Nesseltieren (Abbildung 1) gefunden wird. Insbesondere Flecken es Nematocytes, die die Microbasic Mastigophore Organellen (an) zu produzieren und Spirocytes, die Spirocysts, alle gefundenen innerhalb der Epidermis des korallengewebes produzieren. Nematocytes finden sich auch in anderen Gewebeschichten der Korallen, wie z. B. die Calicodermis; durch den Schnitt auf diesem speziellen Beispiel durchgeführt, könnten diese Informationen nicht gesammelt werden. FosB auch Cnidocytes gebeizt und wurde speziell für Spirocytes und Nematocytes. Für beide diese Sonden zeigte das Sinn-Steuerelement keine Färbung, darauf hinweist, dass die Färbung für die Anti-Sense-Sonde in der Tat bestimmte war. Dies sind nur zwei Arten von repräsentativen Ergebnissen (diffuse Gewebe Färbung und zellspezifische Färbung) der befleckenden Techniken, die mit verschiedenen Arten von Sonden vorhanden sein können. Aufgrund dieser Variabilität ist es wichtig, eine Sinn-Steuerelement verwenden, um unspezifische Färbung bestimmen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57853/57853fig1.jpg"> Abbildung 1: Repräsentative Ergebnisse der ISH, die bestimmte Zellen befleckt. (A) im ersten Bereich zeigt Sinn-Steuerung für die AP-1-Sonde, dass kleine Flecken auf der Folie vorliegt. Im zweiten Panel zeigt die Anti-Sense-Sonde für AP-1, dass Färbung mit dieser Sonde diffus durch das Gewebe. Der Fleck ist spezifisch für die mündliche Gastrodermis und Epidermis. Mit dieser Art der Färbung ist es wichtig, laufen ein Sinn-Steuerelement, um sicherzustellen, dass die beobachteten Beflecken spezifisch ist. (B) ein Sinn-Steuerelement für die FosB-Sonde im ersten Fenster zeigt wenig Färbung vorhanden. Im zweiten Panel zeigt die Anti-Sense-Sonde für FosB Färbung speziell für die Spirocytes und Nematocytes, mit diffusen Färbung in der Epidermis und Oral Gastrodermis. (C) in der ersten Platte zeigt die Sinn-Steuerung für die TNFR 41-Sonde, dass kleine Flecken auf der Folie vorhanden ist. Im zweiten Panel zeigt die Anti-Sense-Sonde für TNFR 41 spezifische Färbung innerhalb der Spirocytes, Nematocytes und Microblastic Mastigophores. Abkürzungen: Spirocytes (SP), Symbiodium (SY), Nematocyte (NE), Microbasic Mastigophores (MM), Symbiont-haltigen Gastrodermal Zellen (SU). Diese Zahl wurde mit Erlaubnis11wiedergegeben. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57853/57853fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">
Hinweis: Alle Verdünnungen sollten mit sterilen, RNase freies Wasser im Autoklaven Glaswaren erfolgen.</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Prehybe Puffer (50 mL)</td>
			<td>HINZUFÜGEN</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Formamid</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">20 X SSC (pH 4,5)</td>
			<td>12,5 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">20 mg/mL heparin</td>
			<td>0,1 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">50 X Denhardts</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">20 % Tween-20</td>
			<td>0,5 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">20 % SDS</td>
			<td>0,5 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">10 mg/mL Lachs Samenzellen DNA (denaturieren bevor Sie hinzufügen)</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">RNase freies Wasser</td>
			<td>4,4 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">
Hinweis: Lösung kann in einem Wegwerfkameras 50 mL Röhrchen erfolgen. Lachs Sperma sollte durch Kochen auf einem Heizblock für 5 Minuten vor dem Hinzufügen zur Lösung denaturiert werden.</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Hybridisierung Puffer (47 mL)</td>
			<td>HINZUFÜGEN</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Formamid</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">20 X SSC (pH 4,5)</td>
			<td>12,5 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">20 mg/mL heparin</td>
			<td>0,1 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">50 X Denhardts</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">20 % Tween-20</td>
			<td>0,5 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">20 % SDS</td>
			<td>0,5 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">10 mg/mL Lachs Samenzellen DNA (denaturieren bevor Sie hinzufügen)</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">RNase freies Wasser</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">
Hinweis: Lösung kann in einem Wegwerfkameras 50 mL Röhrchen erfolgen. Lachs Sperma sollte durch Kochen auf einem Heizblock für 5 Minuten vor dem Hinzufügen zur Lösung denaturiert werden.</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">10 X PBS (1,0 L)</td>
			<td>HINZUFÜGEN</td>
		</tr><tr><td colspan="3">18,6 mM NaH2PO4
</td>
			<td>2,56 g</td>
		</tr><tr><td colspan="3">84,1 mM Na2HPO4
</td>
			<td>11,94 g</td>
		</tr><tr><td colspan="3">1.750 mM NaCl</td>
			<td>102,2 g</td>
		</tr><tr><td colspan="3">
Noten: Mischen Sie Phosphate in ca. 800 mL Wasser ein Volumen von 1,0 L. Überprüfen Sie pH. Sollte es 7,4 ± 0,4. Ansonsten stellen Sie pH auf 7,4 mit NaOH HCl. hinzufügen NaCl und Rest Wasser. Nach pH-Wert angepasste Autoklav ist.</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">20 X SSC (1,0 L)</td>
			<td>HINZUFÜGEN</td>
		</tr><tr><td colspan="3">3 M NaCl</td>
			<td>175,3 g</td>
		</tr><tr><td colspan="3">0,3 M Na-Citrat</td>
			<td>88,2 g</td>
		</tr><tr><td colspan="3">
Noten: Mischen Sie in etwa 800 mL RNase freies Wasser 1,0 L Volumen bringen. Stellen Sie pH 4.5 und Autoklaven.</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Alkalische Phosphatase (AP) Puffer w/o MgCl2 (50 mL)</td>
			<td>HINZUFÜGEN</td>
		</tr><tr><td colspan="3">1 M NaCl</td>
			<td>5,0 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">1 M Tris, pH 9,5</td>
			<td>5,0 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">20 % Tween-20</td>
			<td>1,25 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">RNase freies Wasser</td>
			<td>38,75 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">
Noten: Bereiten Sie einfach vor der Verwendung in einer 50 mL-Tube.</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Alkalische Phosphatase (AP) Puffer (100 mL)</td>
			<td>HINZUFÜGEN</td>
		</tr><tr><td colspan="3">1 M NaCl</td>
			<td>10,0 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">1 M MgCl2
</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">1 M Tris, pH 9,5</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">20 % Tween-20</td>
			<td>2,5 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">RNase freies Wasser</td>
			<td>72,5 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">
Notizen: bereiten Sie nur vor der Verwendung in einer 50 mL-Tube. Die Lösung trüb nach ein paar Stunden und wird nicht mehr Arbeit für die enzymatische Reaktion.</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">AP-Substratlösung</td>
			<td>HINZUFÜGEN</td>
		</tr><tr><td colspan="3">AP-Puffer</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">NBT</td>
			<td>82,5 uL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">BCIP</td>
			<td>82,5 uL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">
Anmerkungen: Dies kann verwendet werden, anstelle von BM lila. Bereiten Sie einfach vor der Verwendung in einer 50 mL-Tube. Halten Sie diese Lösung in der Dunkelheit durch die Röhre in Folie und Vorbereitung bei schwachem Licht.</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Proteinase K-Stammlösung (10 mg/mL)</td>
			<td>HINZUFÜGEN</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Proteinase K</td>
			<td>10 mg</td>
		</tr><tr><td colspan="3">RNase freies Wasser</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">
Noten: Aliquoten und Store bei-20 ° C.</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Proteinase K-Lösung arbeiten</td>
			<td>HINZUFÜGEN</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Proteinase K-Stammlösung</td>
			<td>90 ul</td>
		</tr><tr><td colspan="3">1 X PBS</td>
			<td>18 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">
Noten: Stellen Sie einfach vor dem Gebrauch die besten Ergebnisse erzielen.</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">0,2 % Glycin-PBS-Lösung</td>
			<td>HINZUFÜGEN</td>
		</tr><tr><td colspan="3">10 X PBS</td>
			<td>45 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">RNase freies Wasser</td>
			<td>405 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Glycin</td>
			<td>1 g</td>
		</tr><tr><td colspan="3">
Notizen: in autoklaviert Glasbehälter vorzubereiten. Mischen Sie bei Raumtemperatur auf einem Stirer Teller bis Glycin vollständig aufgelöst ist.</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Boehringer Mannheim blockieren Puffer (30 mL) (Teil der DIG-Waschanlagen und Block-Puffer-Set)</td>
			<td>HINZUFÜGEN</td>
		</tr><tr><td colspan="3">10 x blockiert Lösung</td>
			<td>3 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">1 x Maleic Acid Puffer</td>
			<td>27 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">
Notizen: machen Sie nur vor dem Gebrauch die besten Ergebnisse erzielen. Blocking-Stammlösung und Maleic Acid Puffer dienten aus der "DIG-Waschanlagen und Block-Puffer-Set".</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">4 X SSC – 50 % Formamid (30 mL)</td>
			<td>HINZUFÜGEN</td>
		</tr><tr><td colspan="3">20 X SSC</td>
			<td>6 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">50 % Formamid</td>
			<td>24 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">
Noten: Bereiten Sie einfach vor dem Gebrauch in 50 mL-Tube. Bereiten Sie unter Labor-Haube.</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Glycerin-Montage-Medien</td>
			<td>HINZUFÜGEN</td>
		</tr><tr><td colspan="3">50 mM Tris, pH 8,4</td>
			<td>80 ΜL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Glycerin</td>
			<td>20 ΜL</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Lager-Lösungen für die Durchführung von in situ Hybridisierung. Die Tabelle enthält eine Liste der verschiedenen Lager Lösungen für dieses Protokoll benötigt. Summe der Beträge sind für eine Leistung von ca. 2 Folie Mailer geschätzt. Es empfiehlt sich, passen Gesamtbeträge bezogen auf die Menge der Dias, die verarbeitet werden.

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In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

Das Ziel dieses Protokolls ist in Situ Hybridisierung auf Erwachsenen Korallen Proben durchführen, die in Paraffin eingebettet und auf Objektträger geschnitten wurden. Dies ist eine qualitative Methode zur Visualisierung des räumlichen Ausdrucks einer RNA Gegenstrang Sonde in Paraffin-eingebetteten Gewebe verwendet.

In Situ Hybridisierung Techniken für Paraffin-eingebetteten Erwachsenen Korallen Proben

Corals are important ocean invertebrates that are critical for overall ocean health as well as human health. However, due to human impacts such as rising ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Environment

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

7.0K Aufrufe.  University of Miami, Rosenstiel School of Marine and Atmospheric Sciences. Das Ziel dieses Protokolls ist in Situ Hybridisierung auf Erwachsenen Korallen Proben durchführen, die in Paraffin eingebettet und auf Objektträger geschnitten wurden. Dies ist eine qualitative Methode zur Visualisierung des räumlichen Ausdrucks einer RNA Gegenstrang Sonde in Paraffin-eingebetteten Gewebe verwendet.

Serie: In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues comprising the Caribbean reef building corals Montastraeaannularis and M. faveolata. These approaches include fluorescence microscopy (FM), serial block face imaging (SBFI), and two-photon confocal laser scanning microscopy (TPLSM). SBFI provides deep tissue imaging after physical sectioning; it details the tissue surface texture and 3D visualization to tissue depths of more than 2 mm. Complementary FM and TPLSM yield ultra-high resolution images of tissue cellular structure. Results have: (1) identified previously unreported lobate tissue morphologies on the outer wall of individual coral polyps&#160;and (2) created the first surface maps of the 3D distribution and tissue density of chromatophores and algae-like dinoflagellate zooxanthellae endosymbionts. Spectral absorption peaks of 500 nm and 675 nm, respectively, suggest that M. annularis and M. faveolata contain similar types of chlorophyll and chromatophores. However, M. annularis and M. faveolata exhibit significant differences in the tissue density and 3D distribution of these key cellular components. This study focusing on imaging methods indicates that SBFI is extremely useful for analysis of large mm-scale samples of decalcified coral tissues. Complimentary FM and TPLSM reveal subtle submillimeter&#160;scale changes in cellular distribution and density in nondecalcified coral tissue samples. The TPLSM technique affords: (1) minimally invasive sample preparation,&#160;(2) superior optical sectioning ability,&#160;and (3) minimal light absorption and scattering, while still permitting deep tissue imaging.

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine polyp morphology and tissue structure in the Caribbean corals Montastraeaannularis and M. faveolata. Fluorescence, serial block face,&#160;and two-photon confocal laser scanning microscopy have identified lobate structure, polyp walls, and estimated chromatophore and zooxanthellae densities and distributions.

Multimodale Optische Mikroskopie Methoden Reveal Polyp Gewebemorphologie und Struktur in der Karibik Korallen-Riff-Gebäude

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues ...

Forschung

Umwelt

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal. Such analysis of two or more genes needs to be complemented with in situ hybridization of other genes, or immunohistochemistry of their proteins, both in whole mounted developing organs or sections for detailed resolution of the cellular and tissue expression alterations. Combining multiple gene alterations requires the use of cre or flipase to conditionally delete genes and avoid embryonic lethality. Required breeding schemes dramatically enhance effort and cost proportional to the number of genes mutated, with an outcome of very few animals with the full repertoire of genetic modifications desired. Amortizing the vast amount of effort and time to obtain these few precious specimens that are carrying multiple mutations necessitates tissue optimization. Moreover, investigating a single animal with multiple techniques makes it easier to correlate gene deletion defects with expression profiles. We have developed a technique to obtain a more thorough analysis of a given animal; with the ability to analyze several different histologically recognizable structures as well as gene and protein expression all from the same specimen in both whole mounted organs and sections. Although mice have been utilized to demonstrate the effectiveness of this technique it can be applied to a wide array of animals. To do this we combine lipophilic dye tracing, whole mount in situ hybridization, immunohistochemistry, and histology to extract the maximal possible amount of data.

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

A combination of different techniques to maximize data collection from mouse tissue is presented.

Die Kombination lipophiler Farbstoff, In situ Hybridisierung, Immunhistochemie und Histologie

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Neurowissenschaften

Verbesserung der FISH-Analyse auf onkogene Treiber in Krebsgewebeproben

Robust Detection of Gene Amplification in Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Samples by Fluorescence In Situ Hybridization

Focal gene amplification, such as extrachromosomal DNA (ecDNA), plays an important role in cancer development and therapy resistance. While sequencing-based methodologies enable an unbiased identification of ecDNA, cytogenetic-based techniques, such as fluorescence in situ hybridization (FISH), remain time and cost-effective for identifying ecDNA in clinical specimens. The application of FISH in formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue samples offers a unique avenue for detecting amplified genes, particularly when viable specimens are not available for karyotype examination. However, there is a lack of consensus procedures for this technique. This protocol provides comprehensive, fully optimized, step-by-step instructions for conducting FISH to detect gene amplification, including ecDNA, in FFPE tissue samples which present unique challenges that this protocol aims to overcome and standardize. By following this protocol, researchers can reproducibly acquire high-quality imaging data to assess gene amplification.

Autor im Rampenlicht: FISH als Werkzeug für die präzise Bewertung der Genamplifikation in Krebsproben

This protocol provides a reproducible method to visualize gene amplification in formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue specimens.

Robuster Nachweis der Genamplifikation in formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Proben durch Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung

Focal gene amplification, such as extrachromosomal DNA (ecDNA), plays an important role in cancer development and therapy resistance. While ...

Krebsforschung

Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum

Cnidarians, including sea anemones, corals, and jellyfish, exhibit diverse morphology and lifestyles that are manifested in sessile polyps and free-swimming medusae. As exemplified in established models such as Hydra and Nematostella, stem cells and/or proliferative cells contribute to the development and regeneration of cnidarian polyps. However, the underlying cellular mechanisms in most jellyfish, particularly at the medusa stage, are largely unclear, and, thus, developing a robust method for identifying specific cell types is critical. This paper describes a protocol for visualizing stem-like proliferating cells in the hydrozoan jellyfish Cladonema pacificum. Cladonema medusae possess branched tentacles that continuously grow and maintain regenerative capacity throughout their adult stage, providing a unique platform with which to study the cellular mechanisms orchestrated by proliferating and/or stem-like cells. Whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) using a stem cell marker allows for the detection of stem-like cells, while pulse labeling with 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU), an S phase marker, enables the identification of proliferating cells. Combining both FISH and EdU labeling, we can detect actively proliferating stem-like cells on fixed animals, and this technique can be broadly applied to other animals, including non-model jellyfish species.

Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum

Here, we describe a protocol for visualizing stem-like proliferating cells in the jellyfish Cladonema. Whole-mount fluorescent in situ hybridization with a stem cell marker allows for the detection of stem-like cells, and 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine labeling enables the identification of proliferating cells. Together, actively proliferating stem-like cells can be detected.&#160;

Fluoreszierende In situ Hybridisierung und 5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin-Markierung für stammähnliche Zellen in der Hydrozoenqualle Cladonema pacificum

Cnidarians, including sea anemones, corals, and jellyfish, exhibit diverse morphology and lifestyles that are manifested in sessile polyps and ...

Entwicklungsbiologie

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Ganze Berge In-situ Hybridisierung von E8.5 bis E11.5 Maus Embryonen

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Biologie

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene expression. Microarray and next generation sequencing approaches are being used to investigate developmental, physiological and stress response processes, dissect epigenetic and small RNA pathways, and build large gene regulatory networks1-3. While these techniques facilitate the simultaneous analysis of large gene sets, they typically provide a very limited spatiotemporal resolution of gene expression changes. This limitation can be partially overcome by using either profiling method in conjunction with lasermicrodissection or fluorescence-activated cell sorting4-7. However, to fully understand the biological role of a gene, knowledge of its spatiotemporal pattern of expression at a cellular resolution is essential. Particularly, when studying development or the effects of environmental stimuli and mutants can the detailed analysis of a gene's expression pattern become essential. For instance, subtle quantitative differences in the expression levels of key regulatory genes can lead to dramatic phenotypes when associated with the loss or gain of expression in specific cell types. 
Several methods are routinely used for the detailed examination of gene expression patterns. One is through analysis of transgenic reporter lines. Such analysis can, however, become time-consuming when analyzing multiple genes or working in plants recalcitrant to transformation. Moreover, an independent validation to ensure that the transgene expression pattern mimics that of the endogenous gene is typically required. Immunohistochemical protein localization or mRNA in situ hybridization present relatively fast alternatives for the direct visualization of gene expression within cells and tissues. The latter has the distinct advantage that it can be readily used on any gene of interest. In situ hybridization allows detection of target mRNAs in cells by hybridization with a labeled anti-sense RNA probe obtained by in vitro transcription of the gene of interest. 
Here we outline a protocol for the in situ localization of gene expression in plants that is highly sensitivity and specific. It is optimized for use with paraformaldehyde fixed, paraffin-embedded sections, which give excellent preservation of histology, and DIG-labeled probes that are visualized by immuno-detection and alkaline-phosphatase colorimetric reaction. This protocol has been successfully applied to a number of tissues from a wide range of plant species, and can be used to analyze expression of mRNAs as well as small RNAs8-14.

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

The in situ hybridization protocol described here allows a direct localization of mRNA and small RNA expression at the cellular level with high sensitivity and specificity. The procedure is optimized for paraffin-embedded plant tissue sections, is applicable to a wide range of plants and tissues, and can be completed within ten days.

In-situ-Hybridisierung für die genaue Lokalisierung der Transkripte in Pflanzen

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung in whole mount Embryonen und Histologie für Marine Elasmobranchs Angepasst

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a model for human diseases. Gene function study is based on the detection of gene expression patterns. Although immunohistochemistry offers a powerful way to assay protein expression, the limited number of commercially available antibodies in zebrafish restricts the application of costaining. In situ hybridization is widely used in zebrafish embryos to detect mRNA expression. This protocol describes how to obtain images by combining in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish embryo sections. In situ hybridization was performed prior to cryosectioning, followed by antibody staining. Immunohistochemistry and the imaging of a single cryosection were performed after in situ hybridization. The protocol is helpful to unravel the expression pattern of two genes, first by in situ transcript detection and then by immunohistochemistry against a protein in the same section.

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

This protocol describes how to obtain images by combining in situ hybridization and immunohistochemistry of zebrafish embryonic sections. In situ hybridization was performed prior to cryosectioning, followed by antibody staining. It is useful to detect the expression patterns of two genes in zebrafish if there is a paucity of antibodies.

In situ Hybridisierung kombiniert mit Immunhistochemie in kryogeschnittenen Zebrafischembryonen

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a ...

In Situ Hybridisierung Techniken für Paraffin-eingebetteten Erwachsenen Korallen Proben

Zusammenfassung

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Multimodale Optische Mikroskopie Methoden Reveal Polyp Gewebemorphologie und Struktur in der Karibik Korallen-Riff-Gebäude

Die Kombination lipophiler Farbstoff, In situ Hybridisierung, Immunhistochemie und Histologie

Robuster Nachweis der Genamplifikation in formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Proben durch Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung

Robuster Nachweis der Genamplifikation in formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Proben durch Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung

Robuster Nachweis der Genamplifikation in formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Proben durch Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung

Fluoreszierende In situ Hybridisierung und 5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin-Markierung für stammähnliche Zellen in der Hydrozoenqualle Cladonema pacificum

Ganze Berge In-situ Hybridisierung von E8.5 bis E11.5 Maus Embryonen

In-situ-Hybridisierung für die genaue Lokalisierung der Transkripte in Pflanzen

RNA

In situ Hybridisierung kombiniert mit Immunhistochemie in kryogeschnittenen Zebrafischembryonen