אנו מודים Naojiro ד ר אמסטרדם (אוניברסיטת קיוטו) על מתן העכברים Oog1pro3.9 . מחקר זה נתמך על ידי את JSPS (KAKENHI # JP15H06275) ושל קרן Nitto.

עכברים שוכנו בחדר לסביבה מבוקרת על 23 ±1 ° C עם 12 שעות אור/12 h מחזור כהה. פרוטוקולי טיפול בבעלי חיים, ניסויים נערכו בהתאם להנחיות לניסויים בבעלי חיים-איצ'י הרפואי האוניברסיטאי, אושרו על ידי טיפול בעלי חיים היוצא ועל שימוש הוועדה.
1. הכנת תרבות בינוני ומנות
<ol><li>כדי להכין בינוני תרבות בסיסיים, להוסיף סרום שור עוברית (FBS, 5% v/v), FSH (100 mIU/mL), LH (10 מו/mL), ו פניצילין-סטרפטומיצין (פניצילין, 100 U/mL; סטרפטומיצין, 100 מ"ג/מ"ל) אלפא בינוני חיוני מינימלי (MEM-אלפא), לערבב צינורות 50 מ ל. הערה: כרכים הכולל של מדיה תרבות הנדרשים משתנים בין ניסויים, אבל 1 מ"ל של תרבות בינוני מספיקה בדרך כלל 3.5 ס"מ זכוכית-התחתון תרבות מנות.</li>
	<li>שופכים 1 מ"ל aliquots מעורב בינוני תרבות לתוך 3.5 ס"מ זכוכית-התחתון תרבות מנות וקבע במקום 30 מ מ תא תרבות מוסיף לתוך מנות. לחמם מדיה ומנות בתוך אינקובטור (5% CO2 ו- 37 מעלות צלזיוס).</li>
</ol>2. הכנת רקמות השחלה
<ol><li>פוספט חם מראש buffered תמיסת מלח (PBS) (−) ו MEM-אלפא המכילה 5% FBS, פניצילין U/mL 100 ו- 100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין בתוך אינקובטור (5% CO2 ו- 37 מעלות צלזיוס). הערה: לגבי 3 מ"ל aliquots של PBS (−) לאדם שחלה מספיק לשימוש במהלך ניתוח שחלה הינם 1 מ"ל aliquots של מאמ-אלפא מספיקים עבור אחסון ארעי של השחלות בודד במנות 3.5 ס"מ.</li>
	<li>
בלו השחלות של עכברים ICR (על שם אחרי המכון לחקר הסרטן) נקבה 4 - בן שבועיים, לקצץ את הרקמות הסובבות את השחלה באמצעות פינצטה תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי ומספריים. להזמין את השחלות שהוסר במדיום תרבות (ראה שלב 2.1) עד השימוש.
	<ol>
<li>מקום בודד שחלות על גבי נייר סינון בסוידיש מראש חימם PBS (−) (ראה שלב 2.1) פרוסה לחתיכות 4 באמצעות סכין מיקרוטום תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי. הערה: השחלות של עכברים ICR 4 - בן שבועיים הן בערך 2 מ מ קוטר. מספר חתיכות תלוי בגודל השחלה; עם זאת, כ-500 מיקרומטר חתיכות עבות לאפשר זקיק נאות תצפיות (בחלקים עבה יותר 500 מ מ, שקיפות הרקמות הוא ירד; בחתיכות דק יותר 500 מ מ, זקיקים רבים antral הם שבור ואיבד).</li>
		<li>לאחר ניתוח, למקם את דגימות השחלה הפרוס בינוני תרבות ומחוממת מראש במנות 3.5 ס"מ (ראה שלב 2.1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. השחלה תרביות רקמה
<ol><li>זרוק כ 0.5 µL של תרבות בינוני לכל פרוסים רקמות השחלה על תותב התרבות התא שבו רקמת השחלה יהיה להגדיר משתמש של micropipette.</li>
	<li>למקם את הדגימה הפרוס בכל טיפה של תרבות בינוני על התוספות התרבות התא באמצעות פינצטה.</li>
	<li>תרבות רקמות השחלה 5% CO2 ב 37 º C.</li>
	<li>החלף המדיום תרבות בינוני ומחוממת מראש טרי כל יומיים. הערה: לוח הזמנים עבור שינויים בינונית עבור התרבות של השחלה מקטעים של עכברים ICR 4 - בן שבועיים מוצג באיור1.<ol>
<li>כדי להתרבות גל LH, פנקו בתרבית השחלות עכברים ICR 4 - בן שבועיים עם המדיום המכיל 100 מו/mL FSH ו- LH במשך 12 שעות מדי 4 ימים (איור 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. מיקרוסקופ תמונות של השחלות בתרבית
<ol><li>להתחיל הדמיה השחלות בתרבית לאחר יום 1 כאשר הרקמות יש דבקה על התוספות התרבות תאים, ולבצע ניתוחים מיקרוסקופ קונפוקלי או הפוך במרווחי 24 שעות כדי לאפשר מספיק זקיק צמיחה בין נקודות זמן. הערה: מיקרוסקופיה קונפוקלית עדיפה מיקרוסקופ הפוכה להתבוננות זקיקים של השחלות לגמרי בתרבית.</li>
</ol>5. זמן לשגות הדמיה של השחלות בתרבית
<ol><li>
למטב את התנאים הדמיה בצילום מואץ, כולל עוצמות לייזר ו פעמים חשיפה, עבור מערכת הדמיה (טבלה 1).
	<ol>
<li>בחר השחלה לזווג דגימות עכברים יחיד לשימוש כקבוצות טיפול ובקרה. משתנים בעוצמות לייזר וזמן חשיפה כדי להשיג את התמונות הטובות ביותר (טבלה 1).</li>
		<li>השווה זקיק צמיחה תחת כל תנאי התרבות על ידי מדידת תחומים זקיק בתמונות של דגימות הבקרה במרווחי זמן 24 שעות זמן לשגות דגימות הדמיה (ראה שלב 6). במקביל, לספור את מספר oocytes ovulated בערכת כל השחלה ובחרו את תנאים אופטימליים הדמיה בצילום מואץ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לכידת תמונות במרווחי 30 דקות באמצעות מערכת הדמיה בצילום מואץ בכפוף לתנאים נחוש (טבלה 1).</li>
</ol>6. זקיק צמיחה ניתוח
<ol><li>
כדי לנתח את הפיתוח זקיק, למדוד את האזורים זקיק של תמונות שנלכדו באמצעות תוכנת ImageJ (http://resbweb.nih.gov/ij/).
	<ol>
<li>בתחילה, להגדיר את קנה המידה של התמונה על ידי לחיצה על "הגדרת סולם" תחת 'נתח' בסרגל כלי. הזן את אורכי בצד בתמונה שנלכדה והמספרים התואמים של פיקסלים בשדות הריקים של "מרחק ידוע", "מרחק בפיקסלים", בהתאמה.</li>
		<li>לחץ על "יד חופשית" בסרגל כלי ומיתאר הזקיקים של תמונות שנלכדו שדה בהיר.</li>
		<li>לחץ על "מדד" תחת 'נתח' בסרגל כלי. הערה: אם נתוני מדידה אחרים הם הרצויה, לחץ על "מדידה קבע" תחת 'נתח' בסרגל כלי ובדוק בתיבות המתאימות ברשימה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. ניתוח התפתחות זקיק באמצעות העכברים הטרנסגניים
<ol><li>לאסוף השחלות כמחנכת ימים 0 ו- 4 (P0, P4) נקבה העכברים הטרנסגניים המכיל transgenes Oog1pro3.9 R26-ויזת עבודה H2B-mCherrואת תרבות על הוספת כפי שמתואר צעדים 1.1 – 3.2, חוץ מזה לא פרוסה P0, P4 השחלות.</li>
	<li>החלף את המדיום תרבות בינוני טריים, ומחוממת מראש במנות 3.5 ס"מ בתוך אינקובטור המכילה 5% CO2 ב 37 ° C כל יומיים. הערה: הריכוז של LH במדיום תרבות P0, P4 השחלות יכול להישאר קבוע בגלל עליות LH לא מתרחשות בעכברים P0, P4.</li>
	<li>הגדר את המיקרוסקופ להמחיש רק AcGFP1-חיוביות זקיקים העיקרי P4 בתרבית השחלות (טבלה 1). הערה: רק הקדמוני, ראשי זקיקי נמצאים P4 העכבר הנשי השחלות.</li>
	<li>לכידת תמונות של P0 בתרבית Oog1pro3.9/R26-ויזת עבודה H2B-mCherry השחלות העכברים הטרנסגניים במרווחים של 30 דקות שימוש את ההגדרות המשמשות P4 השחלות (ראה שלב 5.2).</li>
	<li>לאתר ולנתח זקיק פיתוח באמצעות אותות AcGFP1, ויזת עבודה H2B-mCHerry.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+quantifying+follicular+numbers+within+the+mouse+ovary.">Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary.</a> Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).</li><li>Adams, G. P., Jaiswal, R., Singh, J., Malhi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+understanding+ovarian+follicular+dynamics+in+cattle.">Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle.</a> Theriogenology. 69 (1), 72-80 (2008).</li><li>Palma, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+biotechnology+of+follicle+development.">Biology and biotechnology of follicle development.</a> Sci World J. , (2012).</li><li>Knight, P. G., Glister, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+superfamily+members+and+ovarian+follicle+development.">TGF-beta superfamily members and ovarian follicle development.</a> Reproduction. 132 (2), 191-206 (2006).</li><li>Picton, H. M., Harris, S. E., Muruvi, W., Chambers, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+growth+and+maturation+of+follicles.">The in vitro growth and maturation of follicles.</a> Reproduction. 136 (6), 703-715 (2008).</li><li>Spears, N., de Bruin, J. P., Gosden, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+establishment+of+follicular+dominance+in+co-cultured+mouse+ovarian+follicles.">The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles.</a> J Reprod Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).</li><li>Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+effect+of+follicle-follicle+interactions+and+declining+follicle-stimulating+hormone+on+murine+follicle+health+in+vitro.">Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro.</a> Biol Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).</li><li>Komatsu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Effect+of+Leukemia+Inhibitory+Factor+on+Follicular+Growth+in+Cultured+Murine+Ovarian+Tissue.">Analysis of the Effect of Leukemia Inhibitory Factor on Follicular Growth in Cultured Murine Ovarian Tissue.</a> Biol Reprod. 93 (1), 18 (2015).</li><li>Komatsu, K., Masubuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+concentration-dependent+effect+of+progesterone+on+follicle+growth+in+the+mouse+ovary.">The concentration-dependent effect of progesterone on follicle growth in the mouse ovary.</a> J Reprod Dev. 63 (3), 271-277 (2017).</li><li>Murase, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicle+dynamics:+visualization+and+analysis+of+follicle+growth+and+maturation+using+murine+ovarian+tissue+culture.">Follicle dynamics: visualization and analysis of follicle growth and maturation using murine ovarian tissue culture.</a> J Assist Reprod Genet. , 1-5 (2017).</li><li>Ishida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promoter+of+the+oocyte-specific+gene,+Oog1,+functions+in+both+male+and+female+meiotic+germ+cells+in+transgenic+mice.">The promoter of the oocyte-specific gene, Oog1, functions in both male and female meiotic germ cells in transgenic mice.</a> PLoS One. 8 (7), 68686 (2013).</li><li>Minami, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesin+is+a+novel+mouse+protein+expressed+in+oocytes+and+early+cleavage-stage+embryos.">Oogenesin is a novel mouse protein expressed in oocytes and early cleavage-stage embryos.</a> Biol Reprod. 69 (5), 1736-1742 (2003).</li><li>Nilsson, E. E., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+differentiation+factor-9+stimulates+progression+of+early+primary+but+not+primordial+rat+ovarian+follicle+development.">Growth and differentiation factor-9 stimulates progression of early primary but not primordial rat ovarian follicle development.</a> Biol Reprod. 67 (3), 1018-1024 (2002).</li><li>Nilsson, E. E., Kezele, P., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukemia+inhibitory+factor+(LIF)+promotes+the+primordial+to+primary+follicle+transition+in+rat+ovaries.">Leukemia inhibitory factor (LIF) promotes the primordial to primary follicle transition in rat ovaries.</a> Mol Cell Endocrinol. 188 (1-2), 65-73 (2002).</li><li>Nilsson, E. E., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+protein-4+acts+as+an+ovarian+follicle+survival+factor+and+promotes+primordial+follicle+development.">Bone morphogenetic protein-4 acts as an ovarian follicle survival factor and promotes primordial follicle development.</a> Biol Reprod. 69 (4), 1265-1272 (2003).</li><li>Nilsson, E. E., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kit+ligand+and+basic+fibroblast+growth+factor+interactions+in+the+induction+of+ovarian+primordial+to+primary+follicle+transition.">Kit ligand and basic fibroblast growth factor interactions in the induction of ovarian primordial to primary follicle transition.</a> Mol Cell Endocrinol. 214 (1-2), 19-25 (2004).</li><li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditional+reporter+mouse+lines+at+ROSA26+locus+for+live+cell+imaging.">Establishment of conditional reporter mouse lines at ROSA26 locus for live cell imaging.</a> Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).</li><li>Lan, Z. J., Xu, X., Cooney, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+oocyte-specific+expression+of+Cre+recombinase+activity+in+GDF-9-iCre,+Zp3cre,+and+Msx2Cre+transgenic+mice.">Differential oocyte-specific expression of Cre recombinase activity in GDF-9-iCre, Zp3cre, and Msx2Cre transgenic mice.</a> Biol Reprod. 71 (5), 1469-1474 (2004).</li><li>Payer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stella-GFP+transgenic+mice:+a+novel+tool+to+study+germ+cell+development.">Generation of stella-GFP transgenic mice: a novel tool to study germ cell development.</a> Genesis. 44 (2), 75-83 (2006).</li><li>Ohinata, Y., Sano, M., Shigeta, M., Yamanaka, K., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive,+non-invasive+visualization+of+primordial+germ+cell+development+in+mice+by+the+Prdm1-mVenus+and+Dppa3-ECFP+double+transgenic+reporter.">A comprehensive, non-invasive visualization of primordial germ cell development in mice by the Prdm1-mVenus and Dppa3-ECFP double transgenic reporter.</a> Reproduction. 136 (4), 503-514 (2008).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

במחקר זה, פיתחנו שתי שיטות חדשות ללימוד פיתוח זקיק של העכבר השחלות. השיטה הראשונה כרוכה תרבות של רקמות הפרוס עכברים בוגרים השחלות ואחריו ניתוח התפתחות זקיק, השנייה כרוכה בשימוש הדמיה בצילום מואץ להמחיש את התפתחות מוקדמת זקיק בשלב גונדוטרופין עצמאית. בעבר, אנחנו להשתמש בשיטת תרביות רקמה השחלה הנוכחי כדי להעריך את ההשפעה של לוקמיה מעכבות פקטור ופרוגסטרון על זקיק פיתוח8,9, ולא הראה כי ההשפעות שלהם משתנות עם שלב הריכוז ואת זקיק. במחקר הנוכחי, פרוסים רקמות השחלה הציג זקיק דינמיקה, המצדיקים עוד ניתוחים של מנגנון התפתחות זקיק השחלות באמצעות מודל זה.
השחלות של עכברים של יותר מ 5 שבועות של גיל מכילים lutea קורפוס הכשילה תצפיות מיקרוסקופיות. לפיכך, בת 4 בשבוע העכבר השחלות עדיפים תצפיות של פיתוח זקיק ו ביוץ, עוקבות מאוחר זקיקים ראשי, משני, antral נבדלים בקלות רבה יותר באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהיר. השיטות שלנו מציעים השוואות של ההשפעות של גורמי גדילה וסמים בתקשורת תרבות, בשינויים ניכרת בהתפתחות זקיק בין השחלות שטופלו באופן שונה (איור 3).
העכברים הטרנסגניים המבטאים חלבונים Cre או fluorescein ב oocytes תוארו מחקרים קודמים18,19,20. עם זאת, שלב הזקיקים סיווג תלוי היסטולוגית מאפיינים כולל granulosa תא צורות, מספרים granulosa תא שכבות, אם תאי theca נוצרות. לפיכך, הבחנות בין זקיקי הקדמוני, ראשי עלולה להיות מוגבלת של תצפיות של oocytes לבד. במסמך זה, אנחנו נעשה שימוש העכברים הטרנסגניים המכילות את Oog1pro3.9 ואת R26-ויזת עבודה H2B-mCherry transgenes11,17 והמחש התפתחות זקיק מוקדמת מן הקדמונים כדי זקיק משני שלבים של השחלות בתרבית. Oog1 הביטוי הופך לזיהוי ב- oocytes במהלך השלב הבראשיתי זקיק, הוא גדל במידה ניכרת בתוך זקיקי העיקרי. לפיכך, עוצמות האות AcGFP1 ב oocytes קשורים עם זקיק הבמה (איור 5), שימשו להתבונן מעברים זקיק הבראשיתי-יסודי (איור 4, 2 הסרט משלים). גרעין התא מוכתמים באדום R26-ויזת עבודה H2B-mCherry העכברים הטרנסגניים (איור 4, השלמה סרט 2ו- 3 הסרט משלים), דבר המאפשר תצפיות של זקיק שלבים לפי המספרים של granulosa תאים ( איור 5). לכן, באופן קולקטיבי השיטות לאפשר ניתוח של זקיק להתפתחות של הקדמונים דרך ביוץ באמצעות Oog1pro3.9/ העכברים הטרנסגנייםR26-ויזת עבודה H2B-mCherry . יתר על כן, מכיוון אפופטוטיים להיפגע בתא כרומטין צפוף, mCherry אותות של זקיקים atretic הם חזקים יותר מאשר אלה של זקיקי שיער רגיל (3 הסרט משלים).
בין דקויות מתודולוגי, עוביים הנכון של רקמות הפרוס נדרשים עבור culturing מוצלח, עם מות תאים מוגברת השחלה הפרוסות עבות מדי, הפסדים גדולים antral זקיקי השחלה הפרוסות דקים מדי. מהירות הצמיחה זקיק היא איטית. לפיכך, קל לאתר ולנתח את התהליך של כל זקיק דרך התבוננות מרווח זמן של 24 שעות ביממה. מיקרוסקופ קונפוקלי נוכח הגדרת, כולל לייזר בעוצמה, מרווח הזמן, הגברה דיגיטלית, תלויות מצב מיקרוסקופ, אך הם קריטיים לשקול בעת קבלת תמונות בצילום מואץ. בפרט, עוצמות לייזר חזק, הרבה פעמים חשיפה נדרשים כדי ללכוד תמונות ברורות, אך יכולים להשפיע על תאים בתרבית. ומכאן, מתינות מהגדרות אלה כדי להימנע phototoxicity הוא קריטי. יכול להיות תרבותי הפרוס רקמות השחלה של עכברים בת 4 בשבוע במשך כ- 4 שבועות, בעוד זקיקי הקדמוני, ראשי להיות נוכח כתוצאה מכך, הם אינם גדלים. לעומת זאת, P0, P4 השחלות יכול להיות תרבותי עבור-10 ימים, במהלכם זקיקים הקדמוני, ראשי להתפתח זקיקי ראשית או משנית, בהתאמה. עם זאת, באזור השחלות P0, P4 בתרבית לא להתפתח זקיקים antral. לכן, הכריתה של השחלות נדרשת בשלבים שונים ללימודים של מנגנוני הרגולציה הקשורים להתפתחות הזקיק בשחלה כל.

העכבר הנשי השחלות מכילות אלף זקיקים מספר1ולאחר הביוץ תקופתיים מבשיל כ 10 oocytes-בכל מחזור ייחום. זקיקים מסווגים לתוך מספר שלבים התפתחותיים: הבראשיתי, ראשי, משני, antral, ו Graafian זקיקים, תלוי בצורת שכבה תאית granulosa המקיפה כל oocyte. רוב הזקיקים הקדמוני רדום, חלקם מופעלים ולגדול לתוך ראשי זקיקי-כל מחזור ייחום2. לאחר שלב הזקיקים המשני, התפתחות זקיק מוסדר בעיקר על ידי gonadotropins, הזקיקים מגרה הורמון (FSH), הורמון מחלמן (LH). עם זאת, התפתחות זקיק הקדמוני, ראשי היא עצמאית של גונדוטרופין, מנגנוני הרגולציה המפקחים על השלבים האלה נשארים גרוע inderstood3,4,5. בנוסף, גורמי גדילה והורמונים זקיק הקדמוני, ראשי מוסדר על ידי האינטראקציות בין זקיקי6,7. לכן, עלינו לבצע ניתוחים של זקיק dynamics ברקמות השחלה העכבר, חקרה את מנגנוני הרגולציה המשויך שימוש בתרביות רקמה השחלות8,9,10.
במסמך זה, נסקור שתי שיטות דגם השחלות תרביות רקמה. הראשון משמש כדי לנתח זקיק פיתוח על ידי מדידה של אזורים הזקיקים, והשני משמש כדי ללמוד את מנגנון רגולטורי במהלך התפתחות זקיק מוקדמת מן הקדמונים לשלב זקיק משני עם העכברים הטרנסגניים. לצורך ניתוח התפתחות זקיק, בעיקר השתמשנו השחלות של עכברים נקבה 4 - בן שבועיים כי הם מאפשרים קל ויזואליזציה של זקיקים. לזירוז ביוץ תקופתיים ופיתוח מודל ויוו זקיק, אנחנו לשכפל מנחשולים LH ו ביוץ שנצפה זקיק בהכנת, הפרשת אסטרדיול בתנאים תרביות רקמה. תמונות של השחלות בתרבית נלכדו, תהליכי התפתחות של זקיק נותחו על ידי מעקב אחר שינויים באזור הזקיקים. אולם, בניתוח מיקרוסקופיית שדה בהיר, ההבחנה בין הקדמונים ותחילת זקיקים העיקרי היה לא ברור. לכן, פיתחנו שיטת עבודה זקיקים קטנים, ויוכל להבדיל בין הבראשיתי, העיקרית, ותרבותית זקיק המשני של רקמות השחלות באמצעות Oogenesin1 (Oog1) pro3. 9, השחלות העכברים הטרנסגניים R26-ויזת עבודה H2B-mCherry ימים 0 ו- 4 אחרי הלידה11. הביטוי Oog1 לזיהוי ב oocytes לאחר כניסתו מיוזה, והוא עולה בהדרגה עם התפתחות זקיק, המאפשר התבוננות המעבר הבראשיתי זקיקים הראשי באמצעות תמונות בצילום מואץ של רקמת השחלה בתרבית11 ,12. למרות בשיטות מורפולוגיות שימשו ללמוד הגורמים המפעילים הקדמוני זקיקים רדומים13,14,15,16, התפתחות זקיק פיזיולוגיים של השחלות הוא קשה לצפות, ולהישאר ההשפעות של גורמים שונים uncharacterized. השיטות תרבות נוכח נועדו כתובת זו במחסור בזמן אמת בניתוח הגורמים היעד.
במחקר הנוכחי, אנו מעקב אחר התפתחות הזקיקים באמצעות שיטת הדמיה בצילום מואץ, שאפיינה את תהליך התפתחות זקיק. השיטות הרומן שלנו מציעים כלי חסר תקדים עבור חוקר הפיזיולוגיה של השחלות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1176px;" width="1175">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Follicle stimulating hormone from human pituitary</td>
			<td style="width:224px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">F4021</td>
			<td style="width:451px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lutenizing hormone from equine pituitary</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>L9773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-streptomycin solution</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>168-23191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM a, GlutaMax, no nucleotides</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>32561037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td>35mm dish, No. 0 coverslip, 10mm glass diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Millicell cell culture insert</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td>Diameter: 315 mm, pore size: 0.4 mm, material: hydrophilic PTTE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">3.5cm cell culture dishes</td>
			<td style="width:224px;">greiner bio-one</td>
			<td style="width:119px;">627160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">50ml / centrifuge tube with triple seal cap</td>
			<td style="width:224px;">IWAKI</td>
			<td style="width:119px;">2345-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Low-profile disposable blades 819</td>
			<td style="width:224px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">14035838925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSM 710</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellVoyager, CV1000</td>
			<td>Yokogawa Electric Corporation</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Time-lapse imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BZ-X700</td>
			<td>KEYENCE</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Time-lapse imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ovarian tissue culture to visualize phenomena in mouse ovary

נקבות יונקים מעת לעת הביוץ הוא מספר כמעט קבוע של oocytes במהלך כל מחזור ייחום. כדי לקיים כזה בהתמדה ובהחלטיות, תקופתיות, רגולציה מתרחש ברמת הציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-האשכים והן על פיתוח זקיקים בשחלה. למרות מחקרים פעילים, מנגנוני התפתחות זקיק אינם ברורים בשל מספר הצעדים הכרוכים מהפעלה זקיק הקדמוני רדום עד הביוץ, ובשל במורכבות הרגולציה השונה בכל אחד מהשלבים הזקיקים. כדי לחקור את מנגנוני התפתחות זקיק, ואת הדינמיקה של זקיקים במהלך מחזור ייחום, פיתחנו מודל תרביות רקמה השחלות העכבר יכול לשמש כדי לבחון התפתחות זקיק באמצעות מיקרוסקופ. זקיק שיטתית, כתב-העת ביוץ ופיתוח זקיק בהכנת כל מגורמיה במודל השחלה בתרבית, התנאים תרבות יכולה להיות מאופנן השפעול. . הנה, נדגים את התועלת של שיטה זו של לימוד מנגנוני הרגולציה של התפתחות זקיק ושאר התופעות השחלות.

איור 1 מציג את הפרוטוקול עבור השינויים בתקשורת במהלך השחלות תרביות רקמה. בעקבות תוכנית זו, בת 4 בשבוע ICR עכברים השחלות תרבותי, עם תמונה במרווחי 24 שעות ביממה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית (איור 2). במהלך תרבות של רקמות השחלה למשך 3 שבועות, זקיקים antral ומשני ביותר היו מנוון מאת בהכנת זקיק, חלקם היו ovulated (איור 2D ו לטבלה 2). בניתוח של זקיק אזורים באמצעות ImageJ (איור 3), פיתח כמה זקיקים בקבוצות במהלך כל מחזור מנחשולים LH (איור 3B ו- 1 הסרט משלים). יתר על כן, הביוץ התרחש כמעט בו זמנית השחלות בתרבית נפרד מן השחלות מימין ומשמאל של עכברים יחיד. ואילו, העיתוי של ביוץ ומספרים של ovulated oocytes (טבלה 2) שונה בין השחלות העכבר (נתונים לא מוצג), הביוץ מן השחלות בתרבית בעיקר אירעה בתוך 48 שעות של עליות LH(איור 3ו- Supplementary סרט 1). עם זאת, לא כל oocytes ovulated שוחרר גופות הקוטב הראשון לאחר הביוץ (איור 2E ו לטבלה 2), למרות ovulated oocytes יכולה להיות מופרית, פיתוח נפסקה ב השלב 4 תאים (נתונים לא מוצג). התירי מנגנון שבאמצעותו הקדמוני זקיקים רדומים מופעלים העכבר השחלות, הבחנו זקיק הקדמוני הפעלה ברקמות בתרבית של העכברים הטרנסגניים נושאת Oog1pro3.9 ו- R26-ויזת עבודה H2B-mCherry (transgenes איור 4, איור 5 והסרט משלים 2). Oocytes אקספרס רמות נמוכות מאוד של הגן Oog1 מן השלב הבראשיתי זקיק, הדמיה בצילום מואץ נבדל זקיקים הקדמוני לבטא AcGFP1 נמוכה גבוהה לבטא AcGFP1 הראשית זקיקי. זקיקים הקדמוני, ראשי נוכחים בו זמנית של השחלות העכבר P4, ואילו רק הקדמונים זקיקים קיימים של השחלות P0 (איור 4A, B). לפיכך, אנו אופטימיזציה זמן לשגות תנאים הדמיה לזהות רק ראשי זקיקים P4 בתרבית השחלות (איור 4C). לאחר מכן, אנחנו בשבי תמונות של השחלות P0 בתרבית למשך 10 ימים בבאותם התנאים (איור 4D-G). AcGFP1 יכול לשמש מדד של זקיקי ראשי אלה העכברים הטרנסגניים והיו זקיקים הראשית AcGFP1-חיוביות לזיהוי של השחלות P0 בתרבית לאחר 30-40 h תרבות (איור 4, איור 5A-F, ו- Supplementary הסרט 2). זקיקים הקדמוני, ראשי של השחלות בתרבית היו מכובדים גם על ידי mCherry-חיוביות הגרעינים של תאים granulosa (איור 5B, E). באופן ספציפי, mCherry אותות מצביעים על צורות של זקיקי ולאפשר התבוננות זקיק שלבים של השחלות בתרבית (איור 5B, E, ו- H). לכן, מערכת תרבות זו באמצעות השחלות מ Oog1pro3.9/ עכבריםR26-ויזת עבודה H2B-mCherry חשף את התהליך של התפתחות זקיק מוקדמת מ הבראשיתי כדי זקיק משני שלבים. שיטות אלה יקל על מחקרים של מנגנוני הרגולציה של התפתחות עצמאית גונדוטרופין זקיק.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57794/57794fig1.jpg"> איור 1 : כמובן זמן של שינויים בינונית. א בינוני מכיל 5% FBS, 100-mU FSH, LH 10-mU, פניצילין 100-U/mL ו- 100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין MEM-אלפא. בינוני B מכיל 5% FBS, 100-mU FSH, LH 100-mU, פניצילין 100-U/mL ו- 100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין MEM-אלפא. בינוני B שימש כדי לייצר LH עליות בכל 4. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57794/57794fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57794/57794fig2.jpg"> איור 2 : תמונות של רקמות השחלה בתרבית. תמונות נלכדו במרווחי 24 שעות ביממה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. (א) תרבות יום א'; (B) תרבות יום 5; (ג) תרבות יום 10; (ד) תרבות יום 13; (E) Magnified תמונה של האזור שצוין על-ידי הריבוע ב (ד); oocytes ברה היו ovulated מן הזקיקים המסומנים על ידי חצים ב B, C וד Oocyte (F) משחררים גוף קוטב לאחר הביוץ; סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57794/57794fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57794/57794fig3.jpg"> איור 3 : מדידות של זקיק באזורים השחלות בתרבית. (א) התמונה של השחלה מתורבתות; קווים מנוקדים לייצג את האזור נמדדת ImageJ. (B) באזורים הזקיקים בשחלה בתרבית לאחר 3 שבועות; קווים אפורים לייצג את תקופת תרבות בין התוספת של 100 מ מ LH (LH גל). קווים להציג את שלבי ההתפתחות בכל זקיק בשחלה מתורבתות; סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57794/57794fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="files/ftp_upload/57794/57794fig4.jpg"> איור 4 : Hematoxylin אאוזין (H & E) צביעת תמונות של השחלות P0, P4 והדמיה זמן לשגות. (א) H & E מכתים של השחלה P0; (B) H & E מכתים של השחלה P4; (ג) תמונה של השחלה P4 מכל עכבר הטרנסגניים Oog1pro3.6 לאחר 10שע תרבות. החץ מראה זקיק ראשוני של AcGFP1-חיוביות. (D-G) תמונות של השחלות P0 מן העכברים הטרנסגניים לבטא Oog1pro3.9 ו- R26-ויזת עבודה H2B-mCherry; אותות ירוק ואדום ב D ו- F מייצגים AcGFP1, mCherry, בהתאמה. לבן אותות ב E ו- G מייצגים AcGFP1 ב D ו- F, בהתאמה. E ו- D הם תמונות של השחלות בתרבית לאחר 0.5 h תרבות. F ו- G להראות שחלות לאחר 180 h תרבות; סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57794/57794fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="files/ftp_upload/57794/57794fig5.jpg"> איור 5: תמונות של זקיקים הקדמוני, והמשניים של השחלות בתרבית מ oog1pro3.9/R26-ויזת עבודה H2B-mCherry עכברים. (A–C) תמונות של זקיקים הקדמוני של השחלות P0 מתורבתות; (נד–) תמונות של ראשי זקיקי השחלה בתרבית P0; (HG–) תמונות של זקיקי המשני של העכבר בת 4 שבוע תרבותי השחלות. A, D, ו- G הם התמונות הממוזגות של B, C, E, F, ו- H ואני, בהתאמה. גרין, AcGFP1; . רד, mCherry; סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. <a href="https://wwww-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57794/57794fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>מיקרוסקופ</td>
			<td>המטרה עדשה</td>
			<td>לייזר</td>
			<td>חשיפה (ms)</td>
			<td>רווח</td>
			<td>מרווח זמן</td>
			<td>z-מחסנית</td>
			<td>אחרים</td>
			<td>ספרות וסרטים</td>
		</tr>
<tr>
<td>CV1000</td>
			<td>X10</td>
			<td>488 ננומטר: 30, 561 nm: 20</td>
			<td>488 ננומטר: 700, 561 nm: 600</td>
			<td>488 ננומטר: 90, 561nm: 20</td>
			<td>30 דקות</td>
			<td>5 מ מ</td>
			<td></td>
			<td>איור 4C-G, סרט 1 ו- 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>BZ-X700</td>
			<td>X20 (עם צווארון אוסף)</td>
			<td>40%</td>
			<td>אוטומטי</td>
			<td>X4</td>
			<td>30 דקות</td>
			<td>10 מ מ</td>
			<td>binning 3 x 3</td>
			<td>הסרט 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>LSM710</td>
			<td>X10</td>
			<td>488 ננומטר: 6%, 564 nm: 5%</td>
			<td>מצלמת מהירות: 4</td>
			<td>488 ננומטר: 850, 564 nm: 850</td>
			<td>h 24 שעות ביממה</td>
			<td>10 מ מ</td>
			<td>דיגיטלי לזכות, 488 ננומטר: 2, 564 nm:1</td>
			<td>איור 2, 3 ו-5</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: זמן לשגות הדמיה תנאים. תנאי הדמיה בצילום מואץ מיקרוסקופ קונפוקלי ובהיר שדה.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>שחלה לא.</td>
			<td>המספר של סה כ oocytes ovulated</td>
			<td>מספר MII oocytes</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>7</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>19</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>14</td>
			<td>6</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>7</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>12</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>15</td>
			<td>6</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>25</td>
			<td>11</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>13</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>11</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>19</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>18</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>7</td>
			<td>1</td>
		</tr>
</tbody></table>בטבלה 2: מספר oocytes ovulated בתרבית השחלות. מספרים של oocytes ovulated מן השחלות בתרבית 12; MII מציין את מספר oocytes ovulated שפורסמו גופות הקוטב הראשון לאחר הביוץ.
<img alt="Supplementary Movie 1" src="files/ftp_upload/57794/57794movie1.jpg"> משלים סרט 1: הסרט בצילום מואץ של השחלה בתרבית. השחלות היו שנאספו עכברים 4 - בן שבועיים, ולא היו פרוסים, תרבותי למשך 3 שבועות. הסרט משתרע על פני תקופה תרבות של 0-200 h 10 מסגרות/ס <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57794/movie_1.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)</a>
<img alt="Supplementary Movie 2" src="files/ftp_upload/57794/57794movie2.jpg"> 2 הסרט משלים: הסרט בצילום מואץ השחלה P0 בתרבית של עכבר. גרין, AcGFP1; . רד, mCherry. הסרט משתרע על פני תקופה תרבות של 0-180 h 10 מסגרות/ס <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57794/Movie_2.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)</a>
<img alt="Supplementary Movie 3" src="files/ftp_upload/57794/57794movie3.jpg"> הסרט משלים 3: הסרט בצילום מואץ השחלה בתרבית של עכבר בן 4 בשבוע. גרין, AcGFP1; אדום; mCherry; הסרט משתרע על פני תקופה תרבות של 9-13 ימים תרבות-10 מסגרות/s. החיצים בתמונה הראשונה לציין זקיקים ב בהכנת אשר התרחשו במהלך תרבות. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57794/Movie_3.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary at JoVE.com

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

תרביות רקמה השחלות כדי לחזות תופעות העכבר השחלה

בתרביות רקמה השחלות יכול לשמש דגמים של זקיק פיתוח, הביוץ זקיק בהכנת ולציין את מנגנוני הרגולציה של תהליכים דינאמיים השחלות.

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

ovarian-tissue-culture-to-visualize-phenomena-in-mouse-ovary

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.6K Views.  Aichi Medical University. בתרביות רקמה השחלות יכול לשמש דגמים של זקיק פיתוח, הביוץ זקיק בהכנת ולציין את מנגנוני הרגולציה של תהליכים דינאמיים השחלות.

Video: Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together within a basement membrane. A finite pool of follicles is laid down during embryonic development, when oocytes in meiotic arrest form a close association with flattened granulosa cells, forming primordial follicles. By or shortly after birth, mammalian ovaries contain their lifetime&#8217;s supply of primordial follicles, from which point onwards there is a steady release of follicles into the growing follicular pool.
The ovary is particularly amenable to development in vitro, with follicles growing in a highly physiological manner in culture. This work describes the culture of whole neonatal ovaries containing primordial follicles, and the culture of individual ovarian follicles, a method which can support the development of follicles from an immature through to the preovulatory stage, after which their oocytes are able to undergo fertilization in vitro. The work outlined here uses culture systems to determine how the ovary is affected by exposure to external compounds. We also describe a co-culture system, which allows investigation of the interactions that occur between growing follicles and the non-growing pool of primordial follicles.

This protocol describes the primary culture/co-culture of mouse ovarian tissue, using ovaries from neonatal mice and individual ovarian follicles from prepubertal mice. The culture techniques support development in a highly physiological manner, allowing investigation of the effect of extrinsic agents on the ovary, and of interactions between ovarian follicles.

תרבות ושיתוף התרבות של עכבר שחלות וזקיקים בשחלות

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

Ex הרחם Electroporation וOrganotypic Slice תרבות של רקמות העכבר בהיפוקמפוס

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Loss- ו-של-פונקצית רווח גישה לחקר תא מוקדם קובעי גורל preimplantation עכבר עובר

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global DNA methylation level of chondrocytes is considered to be a suitable biomarker for the loss of the chondrocyte phenotype. However, results based on different experimental methods can be inconsistent. Therefore, it is important to establish a precise, simple, and rapid method to quantify global DNA methylation levels during chondrocyte dedifferentiation.
Current genome-wide methylation analysis techniques largely rely on bisulfite genomic sequencing. Due to DNA degradation during bisulfite conversion, these methods typically require a large sample volume. Other methods used to quantify global DNA methylation levels include high-performance liquid chromatography (HPLC). However, HPLC requires complete digestion of genomic DNA. Additionally, the prohibitively high cost of HPLC instruments limits HPLC&#39;s wider application.
In this study, genomic DNA (gDNA) was extracted from human chondrocytes cultured with varying number of passages. The gDNA methylation level was detected using a methylation-specific dot blot assay. In this dot blot approach, a gDNA mixture containing the methylated DNA to be detected was spotted directly onto an N+ membrane as a dot inside a previously drawn circular template pattern. Compared with other gel electrophoresis-based blotting approaches and other complex blotting procedures, the dot blot method saves significant time. In addition, dot blots can detect overall DNA methylation level using a commercially available 5-mC antibody. We found that the DNA methylation level differed between the monolayer subcultures, and therefore could play a key role in chondrocyte dedifferentiation. The 5-mC dot blot is a reliable, simple, and rapid method to detect the general DNA methylation level to evaluate chondrocyte phenotype.

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

We present a method to quantify DNA methylation based on the 5-methylcytosine (5-mC) dot blot. We determined the 5-mC levels during chondrocyte dedifferentiation. This simple technique could be used to quickly determine the chondrocyte phenotype in ACI treatment.

5-mc נקודה כתם Assay לכמת את מתילציה DNA רמת Chondrocyte Dedifiationiation<em&gt; במבחנה</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

הדמיה חיה של עכבר משניים פיוז &#39;ן

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and differentiation. Typically, pHi dynamics are determined in cultured cells, which are amenable to measuring and experimentally manipulating pHi. However, the recent development of new tools and methodologies has made it possible to study pHi dynamics within intact, live tissue. For Drosophila research, one important development was the generation of a transgenic line carrying a pHi biosensor, mCherry::pHluorin. Here, we describe a protocol that we routinely use for imaging live Drosophila ovarioles to measure pHi in the epithelial follicle stem cell (FSC) lineage in mCherry::pHluorin transgenic wild type lines; however, the methods described here can be easily adapted for other tissues, including the wing discs and eye epithelium. We describe techniques for expressing mCherry::pHluorin in the FSC lineage, maintaining ovarian tissue during live imaging, and acquiring and analyzing images to obtain pHi values.

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

We provide a protocol for imaging intracellular pH of an epithelial stem cell lineage in live Drosophila ovarian tissue. We describe methods to generate transgenic flies expressing a pH biosensor, mCherry::pHluorin, image the biosensor using quantitative fluorescence imaging, generate standard curves, and convert fluorescence intensity values to pH values.

שיטות הדמיה תאיים pH של השושלת תאי זקיק ברקמת השחלה דרוזופילה בשידור חי

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Orthotopic Ovarian Transplantation Procedures to Investigate the Life- and Health-span Influence of Ovarian Senescence in Female Mice

Ovarian transplantation was first conducted at Utah State University in 1963. In more recent work, heterochronic transplantation of mammalian ovaries is being used to investigate the health-protective effects of young ovaries in young females. The current procedures employ an orthotopic transplantation method, where allogenic ovaries are transplanted back to their original position in the ovarian bursa. This is in contrast to the more commonly used heterotopic transplantation of ovaries/ovarian tissue subcutaneously or under the kidney capsule. All three locations provide efficient revascularization of the transplanted tissues. However, orthotopic transplantation provides the ovary with the most natural signaling environment and is the only procedure that provides the opportunity for the animal to reproduce naturally post-operatively. One must take care to remove all endogenous ovarian tissue during the ovariectomy procedure. If any endogenous tissue remains or if only one ovary is removed, the transplanted tissue will remain dormant until the existing tissue becomes senescent. While revascularization of the transplanted ovaries occurs very quickly, the transplant recipient can take a considerable amount of time to adapt to a new hypothalamic/pituitary/gonadal/adrenal (HPG/A) axis signaling regime associated with the transplanted tissue. This normally takes about 100 days in the mouse. Therefore, transplantation experiments should be designed to accommodate this adaptation period. Typical results with ovarian transplantation will include changes in the health of the recipient that reflect the age of the transplanted ovary, rather than the chronological age of the recipient.

Described here are orthotopic ovarian transplantation protocols for modifying ovarian influence on the physiology of the recipient mouse. This surgical procedure is used to expose female mice to various types of ovarian influence and may include heterochronic transplantations and transplantation of ovaries that have undergone various ex vivo treatments.

נהלים השתלת השחלות Orthotopic לחקור את ההשפעה ואת בריאות-תוחלת החיים של השחלות הזדקנות ביולוגית בעכברים הנשי

Ovarian transplantation was first conducted at Utah State University in 1963. In more recent work, heterochronic transplantation of mammalian ovaries is ...

A Hyperandrogenic Mouse Model to Study Polycystic Ovary Syndrome

Hyperandrogenemia plays a critical role in reproductive and metabolic function in females and is the hallmark of polycystic ovary syndrome. Developing a lean PCOS-like mouse model that mimics women with PCOS is clinically meaningful. In this protocol, we describe such a model. By inserting a 4 mm length of DHT (dihydrotestosterone) crystal powder pellet (total length of pellet is 8 mm), and replacing it monthly, we are able to produce a PCOS-like mouse model with serum DHT levels 2 fold higher than mice not implanted with DHT (no-DHT). We observed reproductive and metabolic dysfunction without changing body weight and body composition. While exhibiting a high degree of infertility, a small subset of these PCOS-like female mice can get pregnant and their offspring show delayed puberty and increased testosterone as adults. This PCOS-like lean mouse model is a useful tool to study the pathophysiology of PCOS and the offspring from these PCOS-like dams.

We describe the development of a lean PCOS-like mouse model with&#160;dihydrotestosterone pellet to study the pathophysiology of PCOS and the offspring from these PCOS-like dams.

מודל Hyperandrogenic העכבר ללמוד תסמונת השחלות הפוליציסטיות

Hyperandrogenemia plays a critical role in reproductive and metabolic function in females and is the hallmark of polycystic ovary syndrome. Developing a ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational health hazard. Here, we demonstrate the exposure of primary stem cells from the mouse ocular surface to UV-C radiation. Reactive oxygen species (ROS) formation is the readout of the extent of oxidative stress/damage. In an experimental in vitro setting, it is also essential to assess the percentage of dead cells generated due to oxidative stress. In this article, we will demonstrate the 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) staining of UV-C exposed mouse primary ocular surface stem cells and their quantification based on the fluorescent images of DCFDA staining. DCFDA staining directly corresponds to ROS generation. We also demonstrate the quantification of dead and live cells by simultaneous staining with propidium iodide (PI) and Hoechst 3332 respectively and the percentage of DCFDA (ROS positive) and PI positive cells.

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

This protocol demonstrates the simultaneous detection of reactive oxygen species (ROS), live cells, and dead cells in live primary cultures from mouse ocular surface cells. 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodide, and Hoechst staining are used to assess the ROS, dead cells, and live cells, respectively, followed by imaging and analysis.

הערכה של נזק חמצוני בעכבר הראשי פני השטח העינית/תאים גזע בתגובה אולטרה סגול (UV-C) נזק

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of cardiovascular disease. ADSCs derived from different adipose tissues show distinct features, and those from the PVAT have not been well characterized. In a recent study, we reported that some ADSCs in the periaortic arch adipose tissue (PAAT) descend from the neural crest cells (NCCs), a transient population of migratory cells originating from the ectoderm.
In this paper, we describe a protocol for isolating red fluorescent protein (RFP)-labeled NCCs from the PAAT of Wnt-1 Cre+/-;Rosa26RFP/+ mice and inducing their adipogenic differentiation in vitro. Briefly, the stromal vascular fraction (SVF) is enzymatically dissociated from the PAAT, and the RFP+ neural crest derived ADSCs (NCADSCs) are isolated by fluorescence activated cell sorting (FACS). The NCADSCs differentiate into both brown and white adipocytes, can be cryopreserved, and retain their adipogenic potential for ~3&#8211;5 passages. Our protocol can generate abundant ADSCs from the PVAT for modeling PVAT adipogenesis or lipogenesis in vitro. Thus, these NCADSCs can provide a valuable system for studying the molecular switches involved in PVAT differentiation.

We present a protocol for the isolation, culture, and adipogenic induction of neural crest derived adipose-derived stem cells (NCADSCs) from the periaortic adipose tissue of Wnt-1 Cre+/-;Rosa26RFP/+ mice. The NCADSCs can be an easily accessible source of ADSCs for modeling adipogenesis or lipogenesis in vitro.

בידוד, תרבות, והשראה של הרכס העצבי המקורי אדיפוז-תאי גזע שמקורם ברקמת אדיפוז

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...