מחקר זה נתמך באופן מלא על ידי חלוקה של מגזר המחקר של במכון הלאומי סיעוד למחקר של NIH, בת'סדה, מרילנד.

המחקר הנוכחי (NCT00852111) אושרה על-ידי המוסדיים סקירה לוח (IRB) של במכון הלאומי של בריאות (NIH), בת'סדה, מרילנד. המשתתפים שהשתתפו במחקר זה היו גברים euthymic, 18 שנה ומעלה, אשר אובחנו עם סרטן הערמונית-גרורתי עם או בלי prostatectomy מוקדמת, היו אמורים לקבל טיפול קרינתי חיצוני קרן (EBRT). המשתתפים הפוטנציאליים שוחררנו אם היה להם מחלה פרוגרסיבית אשר עלול לגרום עייפות משמעותית, היה מחלה פסיכיאטרית מתוך חמש השנים האחרונות, היו שלא תוקנו בלוטת התריס או אנמיה, או היה גידול ממאיר השני. יחידים אשר השתמשו בכדורי שינה, סטרואידים או סוכנים אנטי דלקתיות לא סטרואידיות היו גם לא נכלל. דגימות דם בקרה בריאים התקבלו לרפואה NIH המחלקה של עירוי דם מתורמים בריאים תחת פרוטוקול שאושרו על-ידי IRB (NCT00001846). כל המשתתפים הם גייסו מגנוסון קלינית במרכז המחקר ב- NIH. ההסכמות מידיעה בכתב חתום התקבלו לפני ההשתתפות במחקר.
1. מיטוכונדריאלי פונקציה מדידה הכנה (יום 1 של הניסוי)
<ol><li>מימה חיישן מחסנית (ראה טבלה של חומרים; משך משוער: 5 דקות).<ol>
<li>הסר את חיישן מחסנית של החבילה. להוסיף 200 μL Calibrant פתרון לבאר כל צלחת השירות ולאחר מכן למלא כל חפיר עם פתרון Calibrant μL 400.</li>
		<li>לחזור חיישן צלחת הצלחת השירות, עכשיו שיש פתרון Calibrant בו. מימה את המחסנית חממה 37 ° C-CO2 בן לילה. הערה: חיישן מחסנית צריך להיות להתייבש מינימום של 4 שעות, לכל היותר 72 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הכנת הדוגמא קלינית (יום 2 של הניסוי)
<ol><li>למדוד עייפות בעזרת 13-פריט פונקציונאלי הערכה של כרונית מחלות הטיפול - עייפות (FACIT-F)2,23,24 -בסיסית (לפני EBRT חניכה), נקודת האמצע והשלמה של EBRT ולאחר שנה אחת פוסט-EBRT.<ol>
<li>להשתמש 0 - מידה 4 עבור כל פריט תגובה, כאשר 0 מייצג "". בכלל לא- ו 4 מציין כי המשיב מתייחס המשפט המתאים "תודה רבה" הציונים הכלליים צריך לנוע בין 16-53, עם ציונים נמוכים המשקף בעוצמה גבוהה עייפות.</li>
		<li>להגדיר עייפות כמו ציון FACIT-F נמוך יותר 43, עם ציון FACIT-F של ≥43 המציין היעדר או עייפות לא-משמעותיים קלינית2. הערה: ציון FACIT-F של 43 הטוב ביותר מחלק ציונים עייפות של חולי סרטן, את האוכלוסייה הכללית2.</li>
		<li>כוללים את הפריטים הבאים 13 בסולם עייפות FACIT: 1) אני מרגיש עייף; 2). אני מרגישה חלשה בכל מקום; 3) אני מרגישה תשושה ("נשטף החוצה"); 4) אני מרגיש עייף; 5) אני מתקשה מתחיל דברים כי אני עייפה; 6) אני מתקשה לסיים דברים כי אני עייפה; 7) יש לי אנרגיה; 8). אני מסוגל לעשות פעילויות הרגיל שלי; 9) אני צריכה לישון במהלך היום; 10). אני עייפה מדי לאכול; 11) אני צריך עזרה עושה פעילויות הרגיל שלי; 12) אני אני מתוסכל בגלל היותו עייף מדי כדי לעשות את הדברים שאני רוצה לעשות; ו 13) אני צריך להגביל את פעילות חברתית כי אני עייפה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לבודד PBMC של דגימות דם טרי שנאספו (משך משוער: 1 h).<ol>
<li>לאסוף 8 מ של דם לתוך צינור הכנה תאי תאי (ראה טבלה של חומרים). הערה: דגימות דם צריך להיות מעובד בתוך שעתיים של אוסף. עלולה לסכן את איכות PBMCs אם דגימות דם מעובדים יותר מ 2 h לאחר איסוף הדגימה.</li>
		<li>צנטריפוגה ב g x 1,750 למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (18-25 ° C). להעביר את השכבה מעונן צינור חרוטי 15 מ"ל. להוסיף עד 15 מ"ל ל- PBS, היפוך 5 פעמים.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 300 x g במשך 15 דקות ב 4 º C. בזהירות להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע ללא גלולה מטרידה. מחדש להשעות את צניפה על-ידי הוספת עד 10 מ"ל PBS, היפוך 5 פעמים.</li>
		<li>צנטריפוגה-300 גרם x 10 דקות ב 4 º C. למחוק את הנוזל supernatant והשהה מחדש תאים 1 מ"ל PBS. להעביר את PBMCs צינור microfuge 1.5 mL.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 610 x g במשך 10 דקות. להסיר את תגובת שיקוע ובזהירות resuspend צנפה ב RPMI מלאה-1640 (RPMI-1640 בתוספת 10% FBS, 10 מ מ פניצילין/סטרפטומיצין).</li>
	</ol>
</li>
	<li>מעיל תא לוחות עבור תאים שאינם מחסידי (משך משוער: 30 דקות).<ol>
<li>להכין פתרון דבק תאים ורקמות (ראה טבלה של חומרים) על ידי דילול הפתרון מניות ב- 0.1 M סודיום ביקרבונט pH 8.0. הפתרון עובד צריך להיות μg/cm 3.52 של פני השטח. הערה: פתרון זה מכיל חלבונים polyphenolic מופק גברת ימיים, Mytilus אדאליס. חלבונים אלה הם רכיבי מפתח של הדבק מופרש על ידי גברת לעגן את עצמה משטחים. אנו מוצאים כי התא-טאק עובד הכי טוב עם PBMCs.</li>
		<li>להוסיף 100 μL של הפתרון מדולל דבק מכל קידוח, תקופת דגירה של פחות 20 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף שלוש פעמים עם די מים ואוויר יבש.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. מיטוכונדריאלי פונקציה מדידה
<ol><li>הכנת Assay מדיה (משך משוער: 10 דקות). הערה: המדיה Assay צריך להיות טרי מוכן ביום של הניסוי.<ol>
<li>הוסף-גלוטמין פירובט, גלוקוז לבסיס המדיה (באותו המרכיבים כמו בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco), אך ללא כל סודיום ביקרבונט, גלוקוז, גלוטמין או נתרן פירובט) כדי להפוך assay מדיה. לחמם מדיה 37 מעלות, ואז להתאים את ה-pH ל 7.4. הערה: ריכוזי-גלוטמין פירובט, גלוקוז בדרך כלל זהה ריכוזים בתקשורת הצמיחה רגילה, אך ניתן להתאים בהתאם וזמינותו.</li>
	</ol>
</li>
	<li>היכונו PBMCs במבחן Mito הלחץ (משך משוער: 2 h).<ol>
<li>צלחת מספיק PBMCs משלב 2 כל טוב להגיע confluency 80-90%. מניסיוננו, 1.5 x 105 תאים/טוב הניבו את התוצאות הכי עקבי. הערה: בארות A ו- H רקע בארות, צריך להכיל רק assay מדיה עם אין תאים. בבארות B ל גרם, אנו ממליצים על ציפוי לפחות 3-6 בארות לאדם החולה מדגם כהתאמה ליניאריים.</li>
		<li>מסובבת צלחות למטה ב g x 200 למשך 2 דקות לאפשר תאים לדבוק בתחתית הבארות. לשטוף את התאים פעם אחת עם התקשורת וזמינותו. שלב זה מסיר סרום, סודיום ביקרבונט מהתקשורת צמיחה. הערה: מניסיוננו, הצעד כביסה בדרך כלל מסירה 20-30% של תאים.</li>
		<li>להוסיף 180 μL Assay מדיה לתוך כל טוב, כולל רקע בארות א' וה' Incubate חממה 37 ° C-CO2 למשך 45-60 דקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הבדיקה מתח Mito<ol>
<li>לשקם סמים בערכה מתח Mito עם מדיה assay כדלקמן:<ol>
<li>Oligomycin: להוסיף 252 μL assay מדיה לתוך המבחנה כדי ליצור פתרון מניות ב- 50 μM.</li>
			<li>FCCP: להוסיף 288 μL assay מדיה לתוך הבקבוקון כדי ליצור פתרון מניות ב- 50 μM.</li>
			<li>Antimycin A / Rotenone: להוסיף 216 μL של המדיה assay לתוך המבחנה כדי ליצור פתרון מניות ב 25 μM.</li>
		</ol>
</li>
		<li>מערבולת מחדש סמים כדקה בערך. לדלל לתוך העבודה פתרונות. הערה: ריכוזים של פתרונות עבודה צריך להיות טיטרציה וקבעה מראש לפני הניסוי בהתאם לסוג התא. עבור PBMCs, אנו מוצאים את μM 1 של Oligomycin 1 μM FCCP, 0.5 μM antimycin A / Rotenone פועלות באופן הטוב ביותר.</li>
		<li>Pipette הסמים ליציאת כל במחסנית חיישן ברצף:<ol>
<li>ת: יציאה μL 20 פיפטה של 10 μM Oligomycin, עבור ריכוז סופי כל היטב של 1 μM.</li>
			<li>יציאה b: μL 22 פיפטה של 10 μM FCCP, עבור ריכוז סופי כל היטב של 1 μM.</li>
			<li>C: יציאה μL 25 פיפטה של μM 5 antimycin A / rotenone עבור ריכוז סופי כל היטב של 0.5 μM.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>בחר "בדיקת המאמץ Mito" על כלי שטף חוץ-תאית. בצע כלי שורת, הכנס את מיכל הדיו חיישן. הכלי יבצע באופן אוטומטי חיישן כיול. הוסף תאים בצלחת לאחר כיול חיישן, לבין הכלי יסיים את שאר וזמינותו. דינמיקה חמצן נמדד ב- 530 ננומטר (עירור) / 650nm (פליטת), פרוטון הריכוז נמדדת ב- 470 nm (עירור) / 530 ננומטר (פליטה).</li>
</ol>4. נרמול נתונים פונקציה מיטוכונדריאלי
<ol><li>להכין פתרון תא התפשטות Assay (משך משוער: 5 דקות).<ol>
<li>להוסיף 48 μL חומצת גרעין הכתם (500 x) משתיק קול רקע 240 μL מ"ל 11.7 PBS (2x). חומצת גרעין הכתם הוא צבע DNA מחייב תא-permeant, משתיק קול רקע צבע המסיכה אשר חוסם תאים מתים או תאים עם קרום התא פרוץ שלמות של להיות מוכתם. שילוב לצבוע דנ א מחייב עם משתיק קול על רקע מבטיחה כי תאים חיים רק מוכתמים.</li>
		<li>להוסיף נפח שווה 2 x הפתרון עובד (180 μL) ישירות לתוך המדיום היטב כל לאחר השלמת במבחן הלחץ Mito.</li>
	</ol>
</li>
	<li>דגירה התאים בנוכחות תא התפשטות assay פתרון חממה 37 מעלות צלזיוס במשך 45-60 דק Quantify מספר תאים חיים (פלורסנט) על קורא צלחת-508 nm (עירור) / 527 nm (פליטת), באופן שיטתי נתונים OCR (משך משוער: 10 דקות) . הערה: בנוסף תאים חיים, מספר המשתמשים לבחור גם לנרמל את הנתונים שלהם עם המספר הכולל של תאים, כמות חומצת גרעין, ריכוז חלבון, וכו '.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Berger, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-Related+Fatigue,+Version+2.2015.">Cancer-Related Fatigue, Version 2.2015.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 13 (8), 1012-1039 (2015).</li><li>Feng, L. R., Dickinson, K., Kline, N., Saligan, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+phenotyping+approaches+lead+to+dissimilar+biologic+profiles+in+men+with+chronic+fatigue+following+radiation+therapy.">Different phenotyping approaches lead to dissimilar biologic profiles in men with chronic fatigue following radiation therapy.</a> Journal of Pain and Symptom Management. 52 (6), 832-840 (2016).</li><li>Feng, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Predictors+of+Fatigue+in+Men+With+Non-Metastatic+Prostate+Cancer+Receiving+External+Beam+Radiation+Therapy.">Clinical Predictors of Fatigue in Men With Non-Metastatic Prostate Cancer Receiving External Beam Radiation Therapy.</a> Clinical Journal of Oncology Nursing. 19 (6), 744-750 (2015).</li><li>Feng, L. R., Wolff, B. S., Lukkahatai, N., Espina, A., Saligan, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploratory+Investigation+of+Early+Biomarkers+for+Chronic+Fatigue+in+Prostate+Cancer+Patients+Following+Radiation+Therapy.">Exploratory Investigation of Early Biomarkers for Chronic Fatigue in Prostate Cancer Patients Following Radiation Therapy.</a> Cancer Nursing. 40 (3), 184-193 (2017).</li><li>Myhill, S., Booth, N. E., McLaren-Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+fatigue+syndrome+and+mitochondrial+dysfunction.">Chronic fatigue syndrome and mitochondrial dysfunction.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 2 (1), 1-16 (2009).</li><li>Pernas, L., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mito-Morphosis:+Mitochondrial+Fusion,+Fission,+and+Cristae+Remodeling+as+Key+Mediators+of+Cellular+Function.">Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function.</a> Annual Review of Physiology. 78 (1), 505-531 (2016).</li><li>Vecchiet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+characterization+of+somatic+parietal+tissues+in+humans+with+chronic+fatigue+syndrome.">Sensory characterization of somatic parietal tissues in humans with chronic fatigue syndrome.</a> Neuroscience Letters. 208 (2), 117-120 (1996).</li><li>Jones, D. E. J., Hollingsworth, K. G., Taylor, R., Blamire, A. M., Newton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormalities+in+pH+handling+by+peripheral+muscle+and+potential+regulation+by+the+autonomic+nervous+system+in+chronic+fatigue+syndrome.">Abnormalities in pH handling by peripheral muscle and potential regulation by the autonomic nervous system in chronic fatigue syndrome.</a> Journal of Internal Medicine. 267 (4), 394-401 (2010).</li><li>Feng, L. R., Suy, S., Collins, S. P., Saligan, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+TRAIL+in+fatigue+induced+by+repeated+stress+from+radiotherapy.">The role of TRAIL in fatigue induced by repeated stress from radiotherapy.</a> Journal of Psychiatric Research. 91, 130-138 (2017).</li><li>Karamercan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+peripheral+blood+mononuclear+cells+be+used+as+a+proxy+for+mitochondrial+dysfunction+in+vital+organs+during+hemorrhagic+shock+and+resuscitation.">Can peripheral blood mononuclear cells be used as a proxy for mitochondrial dysfunction in vital organs during hemorrhagic shock and resuscitation.</a> Shock. 40 (6), (2013).</li><li>Ijsselmuiden, A. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+white+blood+cells+and+platelets+amplify+oxidative+stress+in+heart+failure.">Circulating white blood cells and platelets amplify oxidative stress in heart failure.</a> Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine. 5, 811 (2008).</li><li>Kong, C. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+mitochondrial+alterations+after+cardiac+surgery+involving+cardiopulmonary+bypass:+Clinical+correlations.">Leukocyte mitochondrial alterations after cardiac surgery involving cardiopulmonary bypass: Clinical correlations.</a> Shock. 21 (4), 315-319 (2004).</li><li>Straub, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain+and+immune+system+prompt+energy+shortage+in+chronic+inflammation+and+ageing.">The brain and immune system prompt energy shortage in chronic inflammation and ageing.</a> Nature Reviews Rheumatology. 13, 743 (2017).</li><li>Kuhnke, A., Burmester, G., Krauss, S., Buttgereit, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetics+of+immune+cells+to+assess+rheumatic+disease+activity+and+efficacy+of+glucocorticoid+treatment.">Bioenergetics of immune cells to assess rheumatic disease activity and efficacy of glucocorticoid treatment.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 62 (2), 133-139 (2003).</li><li>Kramer, P. A., Ravi, S., Chacko, B., Johnson, M. S., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+mitochondrial+and+glycolytic+metabolism+in+human+platelets+and+leukocytes:+Implications+for+their+use+as+bioenergetic+biomarkers.">A review of the mitochondrial and glycolytic metabolism in human platelets and leukocytes: Implications for their use as bioenergetic biomarkers.</a> Redox Biology. 2, 206-210 (2014).</li><li>Garrabou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effects+of+Sepsis+on+Mitochondria.">The Effects of Sepsis on Mitochondria.</a> The Journal of Infectious Diseases. 205 (3), 392-400 (2012).</li><li>Mittal, M., Siddiqui, M. R., Tran, K., Reddy, S. P., Malik, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+in+inflammation+and+tissue+injury.">Reactive oxygen species in inflammation and tissue injury.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 20 (7), 1126-1167 (2014).</li><li>Adrie, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Membrane+Potential+and+Apoptosis+Peripheral+Blood+Monocytes+in+Severe+Human+Sepsis.">Mitochondrial Membrane Potential and Apoptosis Peripheral Blood Monocytes in Severe Human Sepsis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164 (3), 389-395 (2001).</li><li>Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+protocol+to+analyze+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+in+lymphocytes.">An optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54918 (2016).</li><li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (46), e2511 (2010).</li><li>Van den Bossche, J., Baardman, J., de Winther, M. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+characterization+of+polarized+M1+and+M2+bone+marrow-derived+macrophages+using+real-time+extracellular+flux+analysis.">Metabolic characterization of polarized M1 and M2 bone marrow-derived macrophages using real-time extracellular flux analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53424 (2015).</li><li>Boutagy, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+isolated+mitochondria+from+minimal+quantities+of+mouse+skeletal+muscle+for+high+throughput+microplate+respiratory+measurements.">Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements.</a> Journal of Visualized Experiments. (104), e53216 (2015).</li><li>Yellen, S. B., Cella, D. F., Webster, K., Blendowski, C., Kaplan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+fatigue+and+other+anemia-related+symptoms+with+the+Functional+Assessment+of+Cancer+Therapy+(FACT)+measurement+system.">Measuring fatigue and other anemia-related symptoms with the Functional Assessment of Cancer Therapy (FACT) measurement system.</a> Journal of Pain and Symptom Management. 13 (2), 63-74 (1997).</li><li>Yost, K. J., Eton, D. T., Garcia, S. F., Cella, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimally+important+differences+were+estimated+for+six+Patient-Reported+Outcomes+Measurement+Information+System-Cancer+scales+in+advanced-stage+cancer+patients.">Minimally important differences were estimated for six Patient-Reported Outcomes Measurement Information System-Cancer scales in advanced-stage cancer patients.</a> Journal of Clinical Epidemiology. 64 (5), 507-516 (2011).</li><li>Kang, J. -. G., Wang, P. -. y., Hwang, P. M., Galluzzi, L., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 542, 209-221 (2014).</li><li>Chacko, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+defining+distinct+bioenergetic+profiles+in+platelets,+lymphocytes,+monocytes,+and+neutrophils,+and+the+oxidative+burst+from+human+blood.">Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood.</a> Laboratory Investigation. 93 (6), 690-700 (2013).</li><li>Jones, L. J., Gray, M., Yue, S. T., Haugland, R. P., Singer, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+determination+of+cell+number+using+the+CyQUANT&#174;+cell+proliferation+assay.">Sensitive determination of cell number using the CyQUANT&#174; cell proliferation assay.</a> Journal of Immunological Methods. 254 (1), 85-98 (2001).</li><li>Hartman, M. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relation+of+mitochondrial+oxygen+consumption+in+peripheral+blood+mononuclear+cells+to+vascular+function+in+type+2+diabetes+mellitus.">Relation of mitochondrial oxygen consumption in peripheral blood mononuclear cells to vascular function in type 2 diabetes mellitus.</a> Vascular Medicine. 19 (1), 67-74 (2014).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

עייפות אצל חולי סרטן היא מחלה מתישה אינה מוגדרת היטב או מאופיין1. אבחון של עייפות כולו מתבסס על דיווח סובייקטיבי, אין תקן הנוכחי אבחון או טיפול עבור תנאי זה, בעיקר בשל חוסר ההבנה שלו pathobiology2. מנגנוני המוצעת שבבסיס עייפות אצל חולי סרטן, ליקוי בתפקוד מיטוכונדריאלי הוא אחד המסלולים הכי רפואית targetable. לכן, פיתחנו שיטה מעשית ומהירה למדידת תפקוד מיטוכונדריאלי בדגימות קליניות יכול לשמש באופן יזום לזהות חולים בסיכון לפתח סרטן הקשורות לטיפול רעילות כולל עייפות, זה כל-כך מוקדם ניהול יכול תיערך.
השטף חוץ-תאית הטכנולוגיה בשילוב עם הזרקת רציפים של מעכבי נשימה לאפשר הערכה של המצב התפקודי מיטוכונדריאלי, שימש במשך שני במבחנה , ויוו מודלים19, 20,21. אנו מורחב בגוף העבודה הקיימת, פיתח שיטת אופטימיזציה עבור בחינת תפקוד מיטוכונדריאלי בדגימות קליניות. יתרון של המחקר הוא הניצול של מנתח קומפקטי השטף חוץ-תאית. כפי הראו, העיתוי של הניסוי הוא קריטי לאחר ניתוקה של PBMCs טריים של דם אנושי. בעוד בתבנית גדולה יותר (96-ובכן או 24-ובכן תבנית) היא הבחירה האידיאלית עבור ניסוי תפוקה גבוהה, מערכת קומפקטית השטף חוץ-תאית, אשר מכיל 8 בארות, מאפשר הערכה אישית של כל החולה מדגם19. שיטה זו היא מעשית יותר וחסכונית (הן לגבי המכשיר עצמו והן של ריאגנטים המשמש לביצוע וזמינותו), כי דוגמה מהאוסף לחולים שונים נוטים להתרחש במועדים שונים בימים שונים.
הניצול של PBMCs כדי להעריך את הפונקציה מיטוכונדריאלי בחולי סרטן עייף יש כמה יתרונות: 1) ביופסיה של רקמות כגון שרירי השלד עשוי להיות מעשי לפעמים; 2) PBMCs הינם זמינים בקלות, בקלות ניתן לבודד באמצעות צינורות הכנה תא, אשר מציע יתרון מעשי בסביבה קלינית; ו 3) הראו כי הפונקציה מיטוכונדריאלי פוחתת לאחר תאים מבודדים טרי בתרבות כבר יותר משלוש שעות, לבודד את סוגי תאים ספציפיים בדרך כלל לוקח כמה שעות (יותר מ- 3 שעות). PBMCs ניתן להכין תוך שעה, ובכך להבטיח את הדיוק של מדידת תפקוד מיטוכונדריאלי בזמן אמת. בעוד אנו ממליצים להשתמש PBMCs עבור החקירה קליני ראשוני באוכלוסיות החולה בעבר uncharacterized, סוגי תאים אחרים כגון T לימפוציטים, טסיות, נויטרופילים ומונוציטים יכול לשמש גם עם פרוטוקול הנוכחי לאחר אופטימיזציה של ציפוי צפיפות, מעכבי נשימה ריכוזים15,25,26.
לפני בדיקות תפקוד מיטוכונדריאלי מערכת חדשה, חשוב תחילה לקבוע את צפיפות תא אופטימלית וריכוזי FCCP. מניסיוננו, ציפוי 1.5 x 105 תאים לכל טוב מבטיחה את צפיפות התאים ואחרי ציפוי confluent 80-90% את הכביסה שלב שרידים. בנוסף, חשוב לקבוע ריכוז FCCP האופטימלי עבור כל סוג התא. ריכוזים טווח של FCCP צריך להיבדק, ריכוז FCCP שמייצר OCR מקסימלי מבלי להתפשר על הבריאות של תא אמור לשמש. בריכוזים שנבדקו, 1 μM של FCCP כתוצאה בנשימה מקסימלי ב- PBMCs. עוד צעד קריטי הוא התזמון של הניסוי, כמו נשימה מיטוכונדריאלי טיפות בתלילות 3 שעות לאחר בידוד PBMC. משמעות הדבר היא כי במבחן הלחץ mito צריכה להתבצע בתוך 3 שעות לאחר המדגם אוסף ללכוד במדויק את הפונקציה מיטוכונדריאלי במדגם קליניים. זה שווה מדגישה כי חוקרים רבים יש גישה רק דוגמאות קפוא. בדקנו בעבר PBMCs לאחר הקפאה והפשרה של, הפונקציות מיטוכונדריאלי של תאים אלה נחשפים במידה רבה. לכן, מומלץ שימוש טרי מבודד PBMCs במחקרים קליניים, כאשר זה ריאלי.
היבט חשוב נוסף של יצירת לשחזור נתונים היא השיטה של נרמול נתונים. בעוד כמה מעבדות היו הצלחה באמצעות כימות חלבון BCA לנרמל את הנשימה מיטוכונדריאלי נתונים, אנו מוצאים שזה לא תמיד ריאלי במיוחד על צפיפות נמוכה התא. השיטה נורמליזציה שמתואר פרוטוקול זה מסתמך על המתאם ליניארי בין מספרי הטלפון הנייד את פליטת קרינה פלואורסצנטית צבען-nucleic מתחמי חומצה, יכולים לכמת במדויק 10 עד 50 אלף תאים27. בנוסף, נורמליזציה באמצעות שילוב של חומצות גרעין פלורסנט הכתם, קורא צלחת פלורסנט מאפשר כימות מהירה של תאים חיים לאחר סיום הניסוי. בנוסף, שיטה זו אינה דורשת trypsinization של תאים חסיד או באמצעות המגרד של התא.
אזהרה של הפרוטוקול זה כי אנחנו לא נפרד PBMCs תא ספציפי סוגים לפני ביצוע אנליזה פונקציונלית מיטוכונדריאלי. כמו, הראו נשימה מיטוכונדריאלי יורדת במהירות לאורך זמן לאחר בידוד PBMC. זה מרמז כי ההבדלים בין חולים עשוי להיות לא מדויק אם הניסוי בוצע לאחר בידוד אוכלוסיות תאים שונים, אשר בדרך כלל לוקח כמה שעות. אף-על-פי לומד אוכלוסיות מעורבות כגון PBMCs אינו חושף מידע ספציפי סוג התא חשוב, מהמידע המתקבל ניסויים באמצעות PBMCs יכול לעזור מדריך חקירות מכניסטית העתיד התמקדו סוגי תאים ספציפיים. PBMCs לשמש proxy עבור לקוי של מיטוכונדריאלי, אשר רלוונטית הפרעות מערכתיות כגון סרטן עייפות10,28. פרוטוקול המתואר בכתב היד הנוכחי מספק רק מדידה גסה של תפקוד מיטוכונדריאלי מבלי לאתר את הגורם התצפית. לכן, ממצאים באמצעות הליך וטכנולוגיה זו יש לפרש בזהירות, יש לקחת בחשבון את אופי multifactorial עייפות, כגון התרחשותו שיתוף עם התנהגויות אחרות (למשל, דיכאון, שינה, פגיעה קוגניטיבית), תנאים (למשל, ריאות מצב, polypharmacy). מחקרים עתידיים יש לבחון שינויים בפונקציות מיטוכונדריאלי סוגי תאים ספציפיים (למשל, תאים רוצח טבעי, T לימפוציטים ומונוציטים), אוכלוסיות קליניות שונות (למשל, חולי סרטן עייף/הלא-עייף, פקדי בריא). אמנם זה מעבר להיקף של כתב היד הנוכחי, נקבע את השיוכים בין חומרת עייפות סרטן בתפקוד מיטוכונדריאלי, כמו גם המתאם בין פונקציה מיטוכונדריאלי מדידות ובדיקות גופניות עייפות כגון מבחן 6 דקות הליכה, חקירות בעתיד. יתר על כן, מחקרים עתידיים יבחנו גם בתפקוד מיטוכונדריאלי בסוגי סרטן אחרים על מנת לקבוע אם עייפות על פני סוגי סרטן שונים קשורה בתפקוד מיטוכונדריאלי. לסיכום, פיתחנו פרוטוקול אופטימיזציה עבור הערכה מהירה של כללית בתפקוד מיטוכונדריאלי באמצעות דגימות קליניות. בהמשך ניתן לבצע חקירות מכניסטית כדי להצביע על המעורבות של מסלולים ספציפיים ב המתיש הזה.

עייפות היא מצב נפוץ ומצערת זה יש השפעה שלילית על איכות החיים של חולי סרטן1. מועד זה, סרטן נשאר גרוע מוגדר ועייפות מסתמך רק על דיווח סובייקטיבי על-ידי חולים2. לכן, יש צורך דחוף לזהות ניסוי מעבדה אבחון להתאמה בקלות לאפיין באופן אובייקטיבי עייפות3,בקביעת קליני4.
מנגנונים כבסיס מרובות, כולל תפקוד המיטוכונדריה, הוצעו כדי לגרום לעייפות5. המיטוכונדריה הם organelles תחנת כוח, מתן 95% צרכי האנרגיה התאית באמצעות זרחון חמצוני, ולשחק תפקיד חשוב סידן איתות אפופטוזיס, המערכת החיסונית איתות, ויסות תאיים אחרים איתות האירועים6 . בהתאם לכך, ביואנרגיה מיטוכונדריאלי לקוי, פגמים בייצור אנרגיה עשויים לתרום עייפות. תמיכה השערה זו, מחקרים קודמים מקיימות מוטציות ב- DNA מיטוכונדריאלי בחולים עם תסמונת התשישות הכרונית7. אמנם עדיין לא ברור אם מקור pathophysiological עייפות טמון בתוך מערכת העצבים המרכזית או רקמות היקפיים, כגון שרירי השלד8,9, יש כיום אין שיטה ישירה להעריך במדויק תפקוד לקוי של מיטוכונדריאלי הקשורים עייפות בתאים חיים, respiring.
באמצעות תאי תאי דם היקפיים (PBMCs) ללמוד פונקציה מיטוכונדריאלי מציע מספר יתרונות. ראשית, PBMCs זמינים בהגדרת קליניים באמצעות דם ורידי רגיל, ניתן לבודד במהירות באמצעות טכניקות מעבדה בסיסית. שנית, איסוף דם הוא פחות פולשניים איסוף לרקמות אחרות כגון ביופסיה של השריר. לפיכך, דגימות דם ניתן לאסוף מן המטופל אותו שוב ושוב לאורך זמן, אשר מקלה על הערכת האורך של השפעות הטיפול. מעניין, פונקציית מיטוכונדריאלי PBMCs הופיע טוב בקורלציה עם כליות מצב מיטוכונדריאלי במודל חיה10. יתר על כן, תא החיסון המיטוכונדריה שימשו כמדד לזיהוי שינויים מערכתית תחת מחלות שונות בתנאים11,12. המיטוכונדריה במחזור תאים חיסוניים הם רגישים לשינויי פונקציות החיסונית במיוחד ואת המערכת החיסונית איתות מולקולות כגון ציטוקינים13,14,15. לדוגמה, זה נצפתה PBMCs של חולים עם מחלות דלקתיות פרקים חריפה התערוכה צריכת חמצן בסיסית גבוהה14. לעומת זאת, צריכת חמצן צומצם ב PBMCs מבודדים מחולים עם התנאים דלקתית מערכתית כולל אלח דם16. תחת תנאים דלקתיים, רדיקלים חופשיים המיוצר על ידי המיטוכונדריה לקוי עשוי נוספת לתרום סטרס חמצוני גבוהות ו דלקת ממושכת17. התפקיד המרכזי של המיטוכונדריה בהפקת אנרגיה, כמו גם כמו סטרס חמצוני מציע השירות פוטנציאל של שימוש ב- function מיטוכונדריאלי כמדד ללמוד עייפות חולי סרטן 13.
מחקרים קודמים בחינת תפקוד מיטוכונדריאלי מנוצל טכניקות הביוכימי, מדידת פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלי או בידוד של אוכלוסיות תאים מסוים עשוי להיות לא ברצון וישימה בקביעת קליני5, 14,18. בשנים האחרונות, ההתפתחות של מבחני חוץ-תאית השטף איפשר לחוקרים בקלות ולבחון באופן מדויק שינויי קצב צריכת החמצן (OCR) בתגובה זריקות אוטומטיות של מעכבי נשימה19,20 , 21 , 22. עם זאת, רוב המחקרים הללו תוכננו עבור סוגי תאים ספציפיים ולא בפורמט גדול תפוקה גבוהה ניתן החלים בסביבה קלינית. כתב יד זה, אנו מתארים פרוטוקול ממוטבת לבחינת תפקוד מיטוכונדריאלי לשימוש קליני.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:876px;" width="875">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:331px;">CPT Mononuclear Cells Preparation Tube&#160;</td>
			<td style="width:123px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:165px;">362761</td>
			<td style="width:257px;">For isolating PBMCs following phlebotomy</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RPMI-1640&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040</td>
			<td>For making growth media for PBMCs</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td>For making growth media for PBMCs</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>For making growth media for PBMCs</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354240</td>
			<td>Cell and Tissue adhesive solution; allows suspension cells to adhere to the surface</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Seahorse XF Calibrant Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103059-000</td>
			<td>For hydrating cartridges</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">XFp Fluxpak (miniplates and sensor cartridges)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103022-100</td>
			<td>Contains XFp cell culture miniplates and sensor cartridges</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">XF base media</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103335-100</td>
			<td>For making XF assay media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">45% cell culture D-(+)-Glucose solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-037-CI</td>
			<td>For making XF assay media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium pyruvate solution</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>25-000-CI</td>
			<td>For making XF assay media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-glutamine solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td>For making XF assay media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Seahorse XFp Mito Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103010-100</td>
			<td>Contains oligomycin, FCCP, antimycin A/rotenone</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C35011</td>
			<td>For quantification of live cells and data normalization</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Seahorse XFp Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S7802AEA</td>
			<td>For measuring mitochondrial function in live cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (or any instrument that can quantify fluorescent cells in a plate)</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BTCYT5PV</td>
			<td>For quantification of live cells and data normalization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating the role of mitochondrial function in cancer-related fatigue

עייפות היא משותפת, מתישה מצב זה משפיע על חולי סרטן. עד כה, עייפות נשאר גרוע מאופיין עם אבחון לא מבחן אובייקטיבי מודדים את חומרת המצב הזה. כאן נתאר שיטת אופטימיזציה להערכת תפקוד מיטוכונדריאלי של PBMCs שנאסף חולי סרטן עייף. באמצעות מערכת קומפקטית השטף חוץ-תאית הזרקה רציפים של מעכבי נשימה, נבחנו המצב התפקודי מיטוכונדריאלי PBMC על ידי מדידת נשימה מיטוכונדריאלי הבזליים לקיבולת בדרכי הנשימה, אנרגיה פנוטיפ, המתאר מסלול אנרגיה מועדף להגיב על הלחץ. PBMCs טריים זמינים בהגדרת קליניים באמצעות דם ורידי רגיל. וזמינותו כולו שמתואר פרוטוקול זה יכולה להסתיים תוך פחות מ 4 שעות ללא המעורבות של טכניקות הביוכימי מורכבים. בנוסף, אנו מתארים שיטה לנרמול הדרוש להשגת לשחזור נתונים. השיטות הליך ונורמליזציה פשוטה הציג מאפשרים איסוף הדגימה חוזרות ונשנות מן החולה באותו הדור לשחזור נתונים ניתן להשוואה בין נקודות זמן כדי להעריך את תופעות הטיפול האפשריות.

במבחן הלחץ Mito מסתמך על מדידת קצב צריכת החמצן (OCR) לאחר ההזרקה רציפים של מעכבי נשימה שונים כדי למפות פרופיל מיטוכונדריאלי שלם. מדידות OCR לאחר הזרקת סמים כל יכול לשמש כדי לחשב את הפרמטרים הבאים הקשורים לבריאות מיטוכונדריאלי: OCR הבזליים נמדד לראשונה לפני כל זריקה סמים כדי להעריך את צריכת החמצן. צריך לפגוש נח רמת הביקוש ATP. נשימה הבזליים מחושבת על-ידי חיסור קצב הנשימה הלא-מיטוכונדריאלי מקו OCR לפני הזרקת oligomycin. בשלב הבא, oligomycin מוזרק לעכב ערוץ פרוטון של ATP סינתאז (V מורכבים). הירידה OCR עוקבות אחרי הזרקת oligomycin מייצג את צריכת החמצן הקשורות לייצור ATP. FCCP (קרבוניל ציאניד 4-[trifluoromethoxy] phenylhydrazone), ionophore נהגה לשבש את מעבר פרוטון ואת פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלי, משמש לאחר מכן שמעודדים צריכת חמצן מירבית. נשימה מקסימלי מחושבת על-ידי חיסור נשימה מיטוכונדריאלי מ OCR המרבי לאחר ההזרקה FCCP. יכולת הנשימה חילוף ההבדל בין נשימה מקסימלית וללא הבזליים. לבסוף, antimycin (מתחם השלישי מעכב) ו rotenone (מתחם אני מעכב) מוזרקים באותו הזמן לנתק את השרשרת אלקטרון תחבורה. לפי ההגדרה, נשימה מיטוכונדריאלי עצמאי בשרשרת האלקטרונים תחבורה (למשל, שאינם מיטוכונדריאלי nadph ל אוקסידאז מקרופאגים, וכו '.), מיוצג כערכים OCR לאחר antimycin A / rotenone הזרקה. צימוד יעילות מתאר את השבר של צריכת חמצן הבזליים מיטוכונדריאלי משמש סינתזת ATP, מחושב כ- 100% x (OCR הקשורות לייצור ATP) /(basal respiration rate).
צריך להיות מוטבת תא צפיפות עבור כל תנאי culturing לפני ביצוע בדיקת מאמץ mito. מניסיוננו, 80-90% confluency מושגת על ידי ציפוי 1.5 x 105 תאים/טוב של PBMCs טרי מבודד של דם אנושי (איור 1א'). זו צפיפות ציפוי חשבונות עבור השלב כביסה שמתואר בשלב 3.2.3. בנוסף לקביעת צפיפות ציפוי אופטימלית, FCCP טיטור יש לבצע כדי לקבוע את הריכוז הדרוש כדי ליצור OCR מקסימלי. ב FCCP ריכוזי נבדק - 0.125 μM, 0.25 μM, 0.5 μM, 1 μM ו- 2 μM - OCR גדל עם ריכוז FCCP להגיע מישור ב 1 μM, אך ירד ב 2 μM (איור 1B). זה מציין כי μM 1 ריכוז FCCP אופטימלית צריך לשמש לבחינת תפקוד מיטוכונדריאלי PBMC.
בדקנו מיטוכונדריאלי פונקציה מאותה אצווה של תאי דם באותו מדגם שנאספו מתורם בריא בנקודות זמן שונות לאחר בידוד PBMC. צריכת החמצן הבזליים, כמו גם OCR מקסימלי ירד כמו מוקדם ככל 3 והמשיך כדי להקטין ב- h 5 ו 8 לאחר בידוד PBMC (איור 2א). לאחר 3 שעות, מקסימלי נשימה שהפיק הזרקת FCCP (נקודות זמן 7-9) לא יעלה על OCR הבזליים, רומז כי אפילו בתאים חיים, המיטוכונדריה לוותר על יכולת הנשימה יורדת במהירות לאורך זמן. קצב חוץ-תאית acidification (ECAR) נמדדה בו זמנית על כלי שטף חוץ-תאית. מאז oligomycin מעכב מיטוכונדריאלי ATP סינתאז, גליקוליזה הוא גויס בתוך דקות כדי לענות על הדרישה אנרגיה וכדי לפצות על העדר ATP ייצור באמצעות זרחון חמצוני, כפי שמתואר על ידי העלייה המהירה ברמת ECAR לאחר oligomycin זריקה. מוקדם ככל h 3 לאחר בידוד PBMC, חלה ירידה ECAR, כמו גם OCR (איור 2B). למרות שאנו לא צופים כל שינוי הבולטים ב תא הכדאיות ב 1, 3, 5 ו- 8 שעות לאחר בידוד PBMC, הפונקציה מיטוכונדריאלי ירד במהירות, רומז. התזמון הוא המפתח כדי ללכוד את הפרופיל מיטוכונדריאלי של חיים, respiring PBMCs.
החולה מדגם אוספים נוטים להתרחש במועדים שונים בימים נפרדים; לכן, זה הכרחי לנרמל את הנתונים כדי להשוות בין נקודות זמן ודוגמאות שונות. בעוד שיטות נרמול אחרות כגון חלבון assay כימות חומצת גרעין עשוי לשמש, אנו מוצאים כי צביעת תאים חיים עם דנ א מחייב לצבוע, כימות של תאים ניאון ירוק היטב כל הוא הכי יעיל ואמין נירמול השיטה. נציג נתונים של PBMCs אסף מתורמים בריאים שונים שני על יומיים נפרדים מוצגים באיור3. הזחה הוא דמות ייצוגית של צלחת תא מציג היטב הכולל תאים (שלב חדות) ותאים חיים מוכתם לצבוע דנ א מחייב (ירוק ניאון) לאחר בדיקת המאמץ mito. קצב צריכת החמצן הבזליים, כמו גם צריכת חמצן לאחר הזרקת סמים כל מנורמל לחיות תאים היו דומים שונה בריאים שאינם עייף בגיטרה (איור 3).
הפונקציה מיטוכונדריאלי נציג נתונים של נושא עייף (ציון FACIT-F < 43) עם סרטן הערמונית (אדום), גיל/מין/גזע-מתאימים עייף שאינו בריא תורמת (כחול) מוצגים באיור4. למרות שלא נתבונן כל הבדל OCR הבזליים (איור 4B), הנושא עייף הציג ירד צריכת חמצן מירבית, כמו גם יכולת הנשימה חילוף בהשוואה הפקד (איור 4C, D). עייפות הופיע להיות קשורה להפחתת מתוקף הנשימה חילוף, כי היו שם אין הבדלים שנמצאו צריכת חמצן מיטוכונדריאלי (איור 4E), צריכת חמצן הקשורים ל- ATP (איור 4F), או צימוד יעילות (איור 4G). נתוני התוכנית הבסיסית (לפני כל זריקה סמים) וגברה מקסימלי נשימה לאחר הזרקת FCCP ניתן לאבחן באמצעות עלילה פנוטיפ של אנרגיה, אשר חושף את מסלול מועדף (OCR זרחון חמצוני לעומת ECAR גליקוליזה) רכוש האנרגיה הביקוש (איור 4H). משבצות ריקות מציינות אנרגיה הבזליים פנוטיפ ולציין ריבועי מוצק של פנוטיפ אנרגיה בתגובה מקסימליים הביקושים ATP. המרחק בין הבסיס (ריבוע ריק) מקסימלי (ריבוע מוצק) מציין קיבולת רזרבית, בעוד המדרון מצביע על העדפה הסלולר כלפי זרחון חמצוני לעומת גליקוליזה. כפי שמוצג באיור 4H, יכולת חילוף בנושא עייפות ירד לעומת הפקד בריאים שאינם עייף. בנוסף, פנוטיפ אנרגיה בתגובה הביקוש ATP מוטה כלפי גליקוליזה בנושא עייף בהשוואה הפקד בריא (איור 4H).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57736/57736fig1.jpg"> איור 1 : PBMC יופיצ צפיפות, עקומת מנה-תגובה FCCP. (א) טרי מבודד PBMCs מצופים ב- 1.5 x 105 תאים/באר תא מצופה CellTak התרבות miniplates. לאחר הרחצה, מדיה לשנות, תאים חולקו באופן שווה על 80-90% confluency. סרגל קנה מידה = 100 μm. (B) OCR גדלה עם הגדלת ריכוזי FCCP 0.125 μM, 0.25 μM, μM 0.5, OCR להשיג שיא ב 1 μM. OCR תועיגמ 2 μM, המציין שאת μM 1 הוא המינון האופטימלי שמעודדים נשימה מקסימלי בברים PBMCs.Error מציינות סטיית התקן של 3 מדידות רציפות אחרי הזריקה סמים הראשונית. <a href="/files/ftp_upload/57736/57736fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57736/57736fig2.jpg"> איור 2 : נשימה מיטוכונדריאלי יורד במשך הזמן ב- PBMCs טרי מבודד. OCR (א) , כמו גם ECAR (B) ירד במהירות לאורך זמן לאחר בידוד PBMC. <a href="/files/ftp_upload/57736/57736fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57736/57736fig3.jpg"> איור 3 : הנשימה מיטוכונדריאלי נציג נתונים עם נורמליזציה. בדיקת המאמץ Mito בוצעה באמצעות PBMCs טריים מבודד שני מתנדבים בריאים שונה בימים שונים, מנורמל בעזרת כתם חומצת גרעין פלורסנט לכמת על קורא צלחת פלורסנט. שיבוץ: תמונת הנציגה של תאים חיים (ירוק), סה כ תאים (שלב חדות) בבאר. סרגל קנה מידה = 1,000 μm <a href="/files/ftp_upload/57736/57736fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57736/57736fig4.jpg"> איור 4 : ניתוח ייצוגית של נושא עייף בהשוואה פקד בריא. (א) נציג Mito מתח הבדיקה OCR גרף של נושא עייף לעומת גיל/מין/גזע-מתאימים עייף שאינו בריא פקד. גרפים המתארים הבזליים OCR (B), נשימה מקסימלי (C), לוותר על יכולת הנשימה (D), צריכת חמצן מיטוכונדריאלי (E), ייצור ATP (נ)ויעילות צימוד (G) מוצגים. העלילה פנוטיפ אנרגיה של הנושא עייף, בקרה בריאים מוצג (H). משבצות ריקות מציינות פנוטיפ אנרגיה בסיסית, מוצק וריבועים מייצגים אנרגיה לחוץ פנוטיפ נמדד לאחר ההזרקה FCCP. קווי שגיאה מציינות סטיית תקן של 3 בארות שונות לכל משתתף במחקר. <a href="/files/ftp_upload/57736/57736fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue at JoVE.com

Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue

המטרה שלנו הייתה לפתח פרוטוקול מעשית להערכת תפקוד מיטוכונדריאלי המשויך עייפות אצל חולי סרטן. פרוטוקול זה חדשני ממוטב רגיל רק שימוש קליני מעורבים עם דם ורידי ונהלים מעבדה בסיסית.

הערכת תפקידה של פונקציית מיטוכונדריאלי עייפות הקשורים לסרטן

Fatigue is a common and debilitating condition that affects most cancer patients. To date, fatigue remains poorly characterized with no diagnostic test to ...

evaluating-role-mitochondrial-function-cancer-related

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.1K Views.  National Institutes of Health. המטרה שלנו הייתה לפתח פרוטוקול מעשית להערכת תפקוד מיטוכונדריאלי המשויך עייפות אצל חולי סרטן. פרוטוקול זה חדשני ממוטב רגיל רק שימוש קליני מעורבים עם דם ורידי ונהלים מעבדה בסיסית.

Video: Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue

Ultrasonographic Evaluation of Breast Cancer-related Lymphedema

Lymphedema is one of the most common complications after breast cancer surgery. There are many diagnostic tools for lymphedema, but no standard method yet exists. Progressive Resistance Exercise (PRE) is expected to improve lymphedema without additional swelling. This study showed the therapeutic effects of PRE on lymphedema by using ultrasonography to measure the change in thickness of the muscle and subcutaneous tissue. The thickness of subcutaneous tissue decreased more in the PRE group than in the non-PRE group. Ultrasonography is widely used in many clinics because of its easy accessibility, safety, and inexpensiveness. Ultrasound is one of the best tools for diagnosing and determining treatment efficacy on breast cancer-related lymphedema (BCRL).

This study utilized ultrasonography for diagnosis and follow-up tests to confirm treatment efficacy of Progressive Resistance Exercise (PRE) in breast cancer-related lymphedema (BCRL). Ultrasonography can be applied effectively to ensure diagnosis and treatment of lymphedema.

הערכת Ultrasonographic של Lymphedema סרטן הקשורים השד

Lymphedema is one of the most common complications after breast cancer surgery. There are many diagnostic tools for lymphedema, but no standard method yet ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. Here we describe a method using targeted peripheral irradiation to induce fatigue-like behavior in mice. With appropriate shielding, the irradiation targets the lower abdominal/pelvic region of the mouse, sparing the brain, in an effort to model radiation treatment received by individuals with pelvic cancers. We deliver an irradiation dose that is sufficient to induce fatigue-like behavior in mice, measured by voluntary wheel-running activity (VWRA), without causing obvious morbidity. Since wheel running is a normal, voluntary behavior in mice, its use should have little confounding effect on other behavioral tests or biological measures. Hence, wheel running can be used as a feasible outcome measure in understanding the behavioral and biological correlates of fatigue. CRF is a complex condition with frequent comorbidities, and likely has causes related both to cancer and its various treatments. The methods described in this paper are useful for investigating radiation-induced changes that contribute to the development of CRF and, more generally, to explore the biological networks that can explain the development and persistence of a peripherally-triggered but centrally-driven behavior like fatigue.

We describe a method using targeted peripheral irradiation to induce fatigue-like behavior in mice. The selected non-lethal irradiation dose leads to a week-long reduction in voluntary wheel-running activity.

במודל עכבר של עייפות הנגרם על ידי הקרנה ההיקפית

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer therapies, such as radio- and chemotherapy, introduce enormous amount of additional DNA damage, leading to cell cycle arrest and apoptosis to limit cancer progression. Quantitative assessment of DNA damage during experimental cancer therapy is a key step to justify the effectiveness of a genotoxic agent. In this study, we focus on a single cell electrophoresis assay, also known as the comet assay, which can quantify single and double-strand DNA breaks in vitro. The comet assay is a DNA damage quantification method that is efficient and easy to perform, and has low time/budget demands and high reproducibility. Here, we highlight the utility of the comet assay for a preclinical study by evaluating the genotoxic effect of olaparib/temozolomide combination therapy to U251 glioma cells.

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

The comet assay is an efficient method to detect DNA damage including single and double-stranded DNA breaks. We describe alkaline and neutral comet assays to measure DNA damage in cancer cells to evaluate the therapeutic effect of chemotherapy.

הערכת במבחנה נזק לדנ א שימוש Assay שביט

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, a small population of cells does not respond to TKI treatment, resulting in minimal residual disease (MRD); even the most potent TKIs fail to eradicate these cells. These MRD cells serve as a reservoir to develop resistance to therapy. Why TKI treatment is ineffective against MRD cells is not known. Growth factor signaling is implicated in supporting the survival of MRD cells during TKI treatment, but a mechanistic understanding is lacking. Recent studies demonstrated that an elevated c-Fos and Dusp1 expression as a result of convergent oncogenic and growth factor signaling in MRD cells mediate TKI resistance. The genetic and chemical inhibition of c-Fos and Dusp1 renders CML exquisitely sensitive to TKIs and cures CML in both genetic and humanized mouse models. We identified these target genes using multiple microarrays from TKI-sensitive and -resistant cells. Here, we provide methods for target validation using in vitro and in vivo mouse models. These methods can easily be applied to any target for genetic validation and therapeutic development.

Here, we describe protocols for the genetic and chemical validation of c-Fos and Dusp1 as a drug target in leukemia using in vitro and in vivo genetic and humanized mouse models. This method can be applied to any target for genetic validation and therapeutic development.

שיטות להערכת את התפקיד של c-פוס, Dusp1 התלות אונקוגן

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with diagnostic or prognostic difficulties. OS comprises genotypically and phenotypically heterogeneous cancer cells. Bone microenvironment elements are proved to account for tumor heterogeneity and disease progression. Bone extracellular matrix (BEM) retains the microstructural matrices and biochemical components of native extracellular matrix. This tissue-specific niche provides a favorable and long-term scaffold for OS cell seeding and proliferation. This article provides a protocol for the preparation of BEM model and its further experimental application. OS cells can grow and differentiate into multiple phenotypes consistent with the histopathological complexity of OS clinical specimens. The model also allows visualization of diverse morphologies and their association with genetic alterations and underlying regulatory mechanisms. As homologous to human OS, this BEM-OS model can be developed and applied to the pathology and clinical research of OS.

The bone extracellular matrix (BEM) model for osteosarcoma (OS) is well established and shown here. It can be used as a suitable scaffold for mimicking primary tumor growth in vitro and providing an ideal model for studying the histologic and cytogenic heterogeneity of OS.

עצם תלת-ממדי מטריצה חוץ-תאית מודל אוסטאוסרקומה

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from healthy mice as well as mice with AML driven by MLL-AF9. Specifically, we describe a two-step cell staining process, whereby healthy or leukemia BM cells are first stained with a fluorogenic dye that detects mitochondrial superoxides, followed by staining with fluorochrome-linked monoclonal antibodies that are used to distinguish various healthy and malignant hematopoietic progenitor populations. We also provide a strategy for acquiring and analyzing the samples by flow cytometry. The entire protocol can be carried out in a timeframe as short as 3-4 h. We also highlight the key variables to consider as well as the advantages and limitations of monitoring ROS production in the mitochondrial compartment of live hematopoietic and leukemia stem and progenitor subpopulations using fluorogenic dyes by flow cytometry. Furthermore, we present data that mitochondrial ROS abundance varies among distinct healthy HSPC sub-populations and leukemia progenitors and discuss the possible applications of this technique in hematologic research.

We describe a method for using multiparameter flow cytometry to detect mitochondrial reactive oxygen species (ROS) in murine healthy hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and leukemia cells from a mouse model of acute myeloid leukemia (AML) driven by MLL-AF9.

הזרמת כדוריות הדם של מיני חמצן מיטוכונדריאלי מורטין בגזע ובתאי מחולל ולוקמיה מונחה AF9

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation capacity of mouse prostate basal and luminal cells during development, tissue-regeneration and transformation. However, evaluating cell-intrinsic and extrinsic regulators of prostate epithelial differentiation capacity using a lineage tracing approach often requires extensive breeding and can be cost-prohibitive. In the prostate organoid assay, basal and luminal cells generate prostatic epithelium ex vivo. Importantly, primary epithelial cells can be isolated from mice of any genetic background or mice treated with any number of small molecules prior to, or after, plating into three-dimensional (3D) culture. Sufficient material for evaluation of differentiation capacity is generated after 7-10 days. Collection of basal-derived and luminal-derived organoids for (1) protein analysis by Western blot and (2) immunohistochemical analysis of intact organoids by whole-mount confocal microscopy enables researchers to evaluate the ex vivo differentiation capacity of prostate epithelial cells. When used in combination, these two approaches provide complementary information about the differentiation capacity of prostate basal and luminal cells in response to genetic or pharmacological manipulation.

Mouse prostate organoids represent a promising context to evaluate mechanisms that regulate differentiation. This paper describes an improved approach to establish prostate organoids, and introduces methods to (1) collect protein lysate from organoids, and (2) fix and stain organoids for whole-mount confocal microscopy.

הערכת יכולת בידול של העכבר תאים אפיתל הערמונית באמצעות תרבות אורגאיד

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

Integration of Bioinformatics Approaches and Experimental Validations to Understand the Role of Notch Signaling in Ovarian Cancer

Notch signaling is a highly conserved regulatory pathway involved in many cellular processes. Dysregulation of this signaling pathway often leads to interference with proper development and may even result in initiation or progression of cancers in certain cases. Because this pathway serves complex and versatile functions, it can be studied extensively through many different approaches. Of these, bioinformatics provides an undeniably cost-efficient, approachable, and user-friendly method of study. Bioinformatics is a useful way to extract smaller pieces of information from large-scale datasets. Through the implementation of various bioinformatics approaches, researchers can quickly, reliably, and efficiently interpret these large datasets, yielding insightful applications and scientific discoveries. Here, a protocol is presented for integration of bioinformatics approaches to investigate the role of Notch signaling in ovarian cancer. Furthermore, bioinformatics findings are validated through experimentation.

Bioinformatics is a useful way to process large-scale datasets. Through the implementation of bioinformatics approaches, researchers can quickly, reliably, and efficiently obtain insightful applications and scientific discoveries. This article demonstrates the utilization of bioinformatics in ovarian cancer research. It also successfully validates bioinformatics findings through experimentation.

אינטגרציה של גישות ביואינפורמטיקה ואימותים ניסיוניים כדי להבין את תפקיד האיתות החריץ בסרטן השחלות

Notch signaling is a highly conserved regulatory pathway involved in many cellular processes. Dysregulation of this signaling pathway often leads to ...

Measuring the Motor Aspect of Cancer-Related Fatigue using a Handheld Dynamometer

Cancer-related fatigue (CRF) is commonly reported by patients both during and after receiving treatment for cancer. Current CRF diagnoses rely on self-report questionnaires which are subject to report and recall biases. Objective measurements using a handheld dynamometer, or handgrip device, have been shown in recent studies to correlate significantly with subjective self-reported fatigue scores. However, variations of both the handgrip fatigue test and fatigue index calculations exist in the literature. The lack of standardized methods limits the utilization of the handgrip fatigue test in the clinical and research settings. In this study, we provide detailed methods for administering the physical fatigue test and calculating the fatigue index. These methods should supplement existing self-reported fatigue questionnaires and help clinicians assess fatigue symptom severity in an objective and quantitative manner.

Simple and accessible methods were developed to measure the motor aspect of cancer-related fatigue objectively and quantitatively. We describe, in detail, ways to administer the physical fatigue test using a simple handgrip device as well as methods to calculate fatigue indices.

מדידת ההיבט המוטורי של עייפות הקשורה לסרטן באמצעות מדידת דינמיות של כף-יד

Cancer-related fatigue (CRF) is commonly reported by patients both during and after receiving treatment for cancer. Current CRF diagnoses rely on ...

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these proteins contain an intrinsically disordered domain (IDD) fused with the DNA-binding domain (DBD) of another protein and orchestrate widespread transcriptional changes to promote malignancy. These fusions are often the sole recurring genomic aberration in the cancers they cause, making them attractive therapeutic targets. However, targeting oncogenic transcription factors requires a better understanding of the mechanistic role that low-complexity, IDDs play in their function. The N-terminal domain of EWSR1 is an IDD involved in a variety of oncogenic fusion transcription factors, including EWS/FLI, EWS/ATF, and EWS/WT1. Here, we use RNA-sequencing to investigate the structural features of the EWS domain important for transcriptional function of EWS/FLI in Ewing sarcoma. First shRNA-mediated depletion of the endogenous fusion from Ewing sarcoma cells paired with ectopic expression of a variety of EWS-mutant constructs is performed. Then RNA-sequencing is used to analyze the transcriptomes of cells expressing these constructs to characterize the functional deficits associated with mutations in the EWS domain. By integrating the transcriptomic analyses with previously published information about EWS/FLI DNA binding motifs, and genomic localization, as well as functional assays for transforming ability, we were able to identify structural features of EWS/FLI important for oncogenesis and define a novel set of EWS/FLI target genes critical for Ewing sarcoma. This paper demonstrates the use of RNA-sequencing as a method to map the structure-function relationship of the intrinsically disordered domain of oncogenic transcription factors.

Intrinsically disordered domains are important for oncogenic fusion transcription factor function. To therapeutically target these proteins, a more detailed understanding of the regulatory mechanisms employed by these domains is required. Here, we use transcriptomics to map important structural features of the intrinsically disordered EWS domain in Ewing sarcoma.

מיפוי קשרי מבנה-פונקציה של גורמי שעתוק אונקוגניים מופרעים באמצעות ניתוח תמלול

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...