يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البحوث الحسية، مثل nociception المحيطية. الميزة الرئيسية لهذا التقنية هو أن التحقيق في آلية الخلوية من الخلايا العصبية الحسية مع النموذج الذي يحاكي معظم للحالة الفسيولوجية. جمع ganglia الجذر الظهري من جذع الجرذ من العمر أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع.
تبدأ من خلال إجراء شقين على طول جانبي العمود الفقري وقطع واحد الجانبي للاحتفال المدى الرسترالي للعمود الفقري القطني. ثم استخدم ملقط قطع العظام لإزالة العضلات الظهرية للعمود الفقري. بعد ذلك، قم بإزالة الجزء الظهري من الفقرات وفضح الحبل الشوكي.
ثم استخدام مقص التشريح ملقط لإزالة الحبل الشوكي. تحديد DRG القطنية عن طريق عد الفقرات من الضلع الأخير. يوضح هذا الرسم التخطيطي مواضع الفقرات.
استخدام مقص صغير لجمع 12 ثنائية 12 11 1 1 1 1100000000000000000000000000000000000000000000000 إزالة أي ألياف الخلايا العصبية المرفقة لتحسين نقاء الثقافة. نقل كل DRG القطنية إلى طبق ثقافة 35 ملليمتر تحتوي على ملليلتر من الجليد الباردة مصل المتوسطة الخالية. نقل طبق DRG التي تحتوي على 35 ملليمتر في غطاء محرك السيارة، وغسل DRG مع المتوسطة خالية من المصل ثلاث مرات عن طريق ماصات.
استخدام ملاقط معقمة لنقل DRGs إلى جديد 35 ملليمتر طبق الثقافة التي تحتوي على مليلتر اثنين من الكولاجين العقيمة نوع 1A. وضع الأنسجة في حل الكولاجيناز في 37 درجة مئوية حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 30 دقيقة لبدء تفكك الخلايا. بعد الحضانة، وإزالة محلول الكولاجيناز وغسل DRG ثلاث مرات في ملليلتر من محلول الملح هانك متوازنة.
بعد ذلك، أضف ملليلترين من 0.05٪ من التربسين EDTA مسبقًا إلى الطبق، وهضم DRG في الحاضنة لمدة 30 دقيقة كما كان من قبل. بعد الهضم، استخدم ماصة زجاجية لنقل ميليلترين من محلول يحتوي على DRG إلى أنبوب طرد مركزي 15 ملليلتر. قد تلتزم DRG بالميصة الزجاجية لذلك يجب إجراء هذه الخطوة بعناية.
يمكن تجنب الخسارة الفعلية عن طريق الحفاظ على حل يحتوي على DRG في نهاية الماصات الزجاجية ، ونقل الحل إلى أنبوب الطرد المركزي ببطء ولكن دون توقف. بعد ذلك، الطرد المركزي الحل في 290 مرة G لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي، وإزالة عظمى وإضافة ملليلترين أخرى من المتوسطة خالية من المصل لإعادة drsuspend DRG.
كرر غسل مرتين، وذلك باستخدام مليلترين من ثقافة ما قبل الاحتياف المتوسطة لإعادة تعليق الأنسجة بعد الطرد المركزي النهائي. استخدام الماصات المصات المُعَمَّل المُعدّة مسبقًا ل triturate يدوياً في DRG حوالي 60 مرة. بعد ذلك، قم بإزالة لوحة بولي-إل-ليسين المغلفة 24 بئر تحتوي على ملليلتر واحد من الثقافة المتوسطة في البئر من حاضنة ثاني أكسيد الكربون.
التعرق الثقافة المحتضنة المتوسطة من الطبق. بذور خلايا DRG من فأر واحد في أربعة من الآبار. وهذا يعطي كثافة البذر من حوالي 500،000 الخلايا في البئر.
في اليوم التالي، استبدل الوسط الثقافي بـ"متوسط" مكمّل بـ 10 ميكرومولار آراك، و100 نانوغرام لكل ملليلتر NGF. في اليوم الثالث بعد طلاء الخلايا، قم بتغيير الوسيط إلى 0.5 ملليلتر من الوسيط الخالي من المصل مسبقًا، واحتضان لمدة ساعة واحدة. خلال الحضانة، إضافة 50 ملليمولار سيرنا في ميكرولتر واحد من المياه الخالية من RNase إلى 12.5 ميكرولترات من المتوسطة خالية من المصل لكل عملية نقل.
ثم ماص 2.5 ميكرولترات من مُشفر transfection إلى 10 ميكرولترات من وسيط خال من المصل لكل عملية نقل. اخلط كلا الحلين بواسطة الماصات، وحضن هذا الحل المختلط لـ 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد 10 دقائق، أضف محلول الانتقال إلى آبار لوحة DRG التي تحتوي على 24 بئرًا واخلطها عن طريق الاهتزاز بلطف.
بعد فترة حضانة لمدة ست ساعات، أضف 0.5 ملليلتر من الاستزراع المتوسط مع 20٪ FBS، و10 ميكرومولار آراك، و100 نانوغرام لكل ملليلتر NGF في كل بئر من الخلايا. وأخيراً، احتضان DRG في حاضنة CO2 37 درجة مئوية لمدة 66 ساعة أخرى. في اليوم السادس بعد الطلاء، وبعد 72 ساعة من نقل الرنا، قم بتغيير متوسط الثقافة إلى 200 ميكرولترات من المتوسطة الخالية من المصل.
بعد 30 دقيقة الحضانة، إضافة ميكرولتر واحد من المواد الكيميائية التحفيز ومزيج بلطف عن طريق الأنابيب. يتم استخدام ناهض NPFFR2، dNPA، والسيارة المقابلة هنا. بعد احتضان للفترة المطلوبة، وجمع المتوسطة الثقافة من طبق الثقافة، والطرد المركزي في 5000 مرات G لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية لإزالة أي الشوائب المعلقة.
جمع عظمى من الطرد المركزي وتمييع مع المالحة الفوسفات المخزنة حسب الحاجة. اختبار مستويات الناقلات العصبية مع مجموعات المناعة الانزيم المتاحة تجاريا. في اليوم الأول، تم إرفاق جسم الخلية من الخلايا العصبية واحدة المشار إليها من قبل السهم على الجزء السفلي من طبق.
توجد أيضاً خلية ذبقية تشير إليها رأس سهم. الخلايا الدبقية مكررة ووسعت العمليات لتحيط الجسم الخلية من الخلايا العصبية الحسية في اليوم الثاني، وهي العملية التي كانت أكثر بروزا في اليوم الثالث. في ثقافة أخرى، كان بروتين CGRP ملطخًا للكشف عن شكل الخلايا العصبية.
يظهر تلطيخ بروتين CGRP في السيتوبلازم والمحاور العصبية الحسية. و morphologies النووية من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية هي متميزة عندما ملطخة DAPI. الخلايا العصبية لديها نواة أكبر وأكثر تقريب من الخلايا الدبقية.
وعلى سبيل المقارنة، نواة من الدبقية هي أكثر بيضاوية في الشكل. مرة واحدة يتقن، يمكن أن يتم هذا الأسلوب في ساعتين ونصف إذا تم تنفيذها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تشريح وثقافة ganglion جذر الظهرية، واستخدامه كأداة للتحقيق في الوظائف الفسيولوجية الكامنة.
لا تنس أن العمل مع الخلايا الأساسية يمكن أن يكون أكثر صعوبة من العمل مع خطوط الخلايا العادية، ويجري لطيف هو دائما أفضل وسيلة عند تنفيذ هذه العملية.
