1. תרבויות cerevisiae ס וביטוי חלבונים
הערה: גרסאות Aβ התערוכה מספק שלעצמו צבירת היחסי שונה עקב מוטציה בגן משקע אחד במיקום 19 (Phe19) של פפטיד Aβ42 (איור 1 א'). גרסאות פפטיד אלה מתויגות עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), אשר משמש כתב (איור 1) צבירת29.
<ol><li>להפוך פלסמידים קידוד עבור 20 Aβ42-GFP משתנים לתוך תאי שמרים עם BY4741 רקע הורים (מאטה שלו3Δ1 leu2Δ0 פגש את15Δ0 ura3Δ0)30. כל פלסמיד מקודד עבור מוטציה Aβ42 דבוקה GFP באמצעות מקשר GSSGSSG. פלסמידים הינם pESC(-URA) וכוללים דה מרקר לבחירה URA329.<ol>
<li>להכין המדיום מלאה סינתטי ללא אורציל (SC-עורה) עם הרכיבים הבאים: 1.9 גרם/ליטר חנקן שמרים בסיסי ללא אורציל, 5 g/L אמוניום סולפט, 900 מל של ddH2O בשילוב עם 100 מ של גלוקוז 20% (w/v).</li>
		<li>מכניסים המושבה אחד של תאי שמרים טרנספורמציה 20 מ"ל של המדיום SC-עורה המכיל 2% גלוקוז ולגדול התרבויות בין לילה ב 30 ° C תחת עצבנות-210 סל ד.</li>
	</ol>
</li>
	<li>למחרת, לגדול תרבויות חדשות של תאי שמרים מאת לחסן 100 µL של התרבות לילה לתוך מ של מדיום SC-עורה צח.</li>
	<li>יתר590 של 0.5, centrifuge התרבויות ב x 3000 g למשך 4 דקות, למחוק את תגובת שיקוע ולאחר resuspend התאים באותו אמצעי אחסון בינוני SC-עורה צח המכיל 2% raffinose.</li>
	<li>דגירה ב 30 ° C תחת עצבנות-210 סל"ד למשך 30 דקות. לאחר מכן, centrifuge את התאים ב 3000 g x במשך 4 דקות וזורקים את תגובת שיקוע. Resuspend התאים במדיום SC-עורה צח המכיל 2% גלקטוז לזירוז הביטוי חלבון רקומביננטי.</li>
	<li>לאחר ה' 16 של גרימת ביטוי חלבון במדיום SC-עורה המכיל 2% גלקטוז, קציר 1 מ"ל של התאים המושרה צינורות סטרילי microcentrifuge על ידי צנטריפוגה ב 3000 g x במשך 4 דקות. הערה: ההבדלים הרלוונטיים ביותר להתרחש לאחר תקופה אינדוקציה של תאי שמרים המושרה ה 16 לבטא Aβ42-GFP משתנים, ניתן לאבחן על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ כדי לקבוע את התפלגות חלבון רקומביננטי בתוך התאים (איור 2B).</li>
</ol>2. התא מכתים
הערה: תאים שאינם-induced טריים נדרשים כפקד שלילי כדי לקבוע סף פלורסנט במהלך ניתוח FC.
<ol><li>לוקחים תאי שמרים h-induced 16 ולקבוע שלהם צפיפות אופטית-590 nm (OD590). לדלל אותם בתוך תמיסת סטרילית פוספט buffered (PBS) יתר590 של 0.1.<ol>
<li>להכין 1 x buffered פוספט תמיסת מלח כדלקמן: להוסיף 8 גרם של NaCl, 0.2 גרם אשלגן כלורי, 1.44 גר' נה2HPO4, ולמלא 0.24 גר'2פו ח'4 800 מ של ddH2O. הפתרון עד 1 L של ddH2O לאחר התאמת רמת ה-pH ל 7.4 עם HCl. לסנן את המאגר דרך מסנן 0.2 µm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להעביר את המתלים תא לביטוי כראוי שכותרתו צינורות (פוליסטירן 12 ממ עגול-התחתון × 75), להגן עליהם מפני אור. ודא כי הם מוכנים להיות טעון על cytometer זרימת לניתוח, יחד עם תאים שאינם-induced ו שאינו מוכתם.</li>
	<li>להוסיף החללית סטרס חמצוני (למשל, אדום עמוק CellROX) כל דגימה-ריכוז הסופי של 5 מיקרומטר, דגירה התאים ב 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בחושך.</li>
	<li>לאחר דגירה, לשטוף את התאים 3 פעמים עם 1 x PBS, resuspend אותם באמצעי האחסון באותו מאגר לפני ניתוח שלהם על ידי מועדון הכדורגל.</li>
</ol>3. לזרום Cytometry ניתוח
הערה: השתמש התקנה FC עם לייזרים המתאים ומסננים כדי לזהות GFP ושידור פלורסצנטיות בדיקה סטרס חמצוני. Cytometer זרימה מצוידים 488 ננומטר כחול בלייזר איתור GFP, לייזר nm אדום 635 איתור סטרס חמצוני בדיקה קרינה פלואורסצנטית יכול לשמש. רכישת פליטת קרינה פלואורסצנטית GFP, סטרס חמצוני בדיקה מבוצע עם 530/30 ננומטר BP מסנן, מסנן BP 660/20, בהתאמה (טבלה 1).
<ol><li>לחץ על פתיחת החלונית ' גליון עבודה חדש וליצור החלקות נקודה הרכישה הבאה.<ol>
<li>בחר את פיזור כלי מגרש מסרגל הכלים וליצור מגרש עם המשתנים לצד פיזור-אזור (האס-A) על ציר ה-y לעומת קדימה פיזור-אזור (FSC-A) בסרגל ליניארי של בציר ה-x.</li>
		<li>לחץ על פיזור כלי מגרש מסרגל הכלים וליצור מגרש עם המשתנים באזור FL1 (FITC)-ציר ה-x vs. FL3-האזור (APC) ב לוגריתמי בציר ה-y.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לחץ על הסמל הגדרות מכשירים . לחץ על הכרטיסיה פיצויים וקבע בכל רמות הפיצוי. לחץ על הכרטיסיה ייבוא , בחר את המספר הכולל של אירועים 20,000 שיירשמו.</li>
	<li>לחץ על הסמל קצב הזרימה כדי לעבור את קצב זרימה נמוכה.</li>
	<li>לחץ על הכרטיסיה ייבוא להתחיל לרוץ את התאים הלא-induced, מוכתם ולהתאים את המתח הגדרות המכשיר פארווערטס ואת פיזור בצד עד האוכלוסייה מופץ ברבע השמאלי האמצעי.<ol>
<li>לחץ על הסמל ' מצולע ' כדי להגדיר אזור R1 סביב האוכלוסייה תא למעט שאריות תאים, ולהשתמש אוכלוסייה מגודרת זו P1 = R1 עבור כל נקודה פלורסנט חלקות וייצוגי היסטוגרמה (איור 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>כדי להתאים את המתח PMT של האות פלורסצנטיות, להפעיל את התאים מוכתם העלילה נקודה FL1-FL3, כוונון של הרווח בכרטיסיה כלי ההגדרה , עד התאים מופצים ברבע השמאלי התחתון.</li>
	<li>לשנות את דגימת התאים המושרה למדידת קרינה פלואורסצנטית GFP. בכרטיסיה כלי ההגדרה , להגדיר את רווח FSC-A נ' FL1 (FITC) כאשר האוכלוסייה מופץ ברבע הימני התחתון. הגדרת האוכלוסייה תא חיובית עם שער (שער P2).</li>
	<li>שינוי הדוגמית להוכיח אי-induced מוכתם לתאים כדי להציג סטרס חמצוני זריחה על FSC-A נ' FL3 (APC) נקודה מגרש. מנגינה של הרווח עד האוכלוסייה תא מופץ ברבע השמאלי-עליון. שער אוכלוסיית תאים חיוביים P3.</li>
	<li>לעשות שני מגרשים היסטוגרמה עם סמל היסטוגרמה לייצג את פלורסצנטיות תא. כדי לייצג את עוצמת קרינה פלואורסצנטית, ודא FL1 (FITC) המייצג את פלורסצנטיות GFP ב ציר ה-x, FL3 (APC) המייצג את זריחה בציר ה-y, החלת P2, P3 אוכלוסיות בקנה מידה לוגריתמי, בהתאמה. הערה: כיסויי היסטוגרמה הם דרך טובה כדי להמחיש את ההבדלים בין הפרופילים זריחה של תאים לבטא את Aβ וריאציות שונות.</li>
</ol>4. Immunodetection חלבון רקומביננטי
<ol><li>כדי לקבוע רמות ביטוי החלבון, לקצור את התרבויות שמרים המושרה עבור 16 h על ידי צנטריפוגה-g 4,000 x עבור 6 דקות ואחסן את כדורי תא ב- 80 ° c<ol>
<li>Resuspend התאים שנאספו ביטוי חלבון רקומביננטי עבור 16 h ב- PBS. להכין 200 המתלים תא µL של כל מוטציה Aβ42-GFP יתר590 של 20.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לניתוח שבר מוחלט חלבון, לקצור 100 µL של כל מוטציה על ידי צנטריפוגה ב g 14,000 x במשך 20 דקות, resuspend כדורי תאים באותו אמצעי אחסון שמרים פירוק מאגר Y-לכל (50 מ מ טריס-HCl pH 8.0, 1% דימתיל סולפוקסיד, 200 מ"מ NaCl, המכיל 10 מ"ג/מ"ל (myr 14-SB3 EDTA 1 מ מ istyl sulfobetaine) בתוספת 1 מ"מ phenylmethylsulfonyl פלואוריד (PMSF)).<ol>
<li>דגירה הדגימות במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר תחת עצבנות קלה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לקבוע את הריכוז תמצית חלבון באמצעות וזמינותו ברדפורד. לטעון עד 5 µg של חלבון תמצית של כל מדגם on a ג'ל אלקטרופורזה מרחביות-דף 15% אקרילאמיד כתם על גבי קרום polyvinylidene difluoride (PVDF) ב- 100 וולט עבור 60 דקות.<ol>
<li>הכן של ברדפורד מגיב עם 100 מ ג של G-250 כחול מבריק Coomassie התפרקה ב 50 מ של 95% אתנול, להוסיף 100 מ של חומצה זרחתית 85% (w/v). לאחר מכן, כאשר לצבוע התפרקה לחלוטין, לדלל את התערובת עם ddH2O עד 1 ליטר, דרך נייר סינון תאית רק לפני השימוש. הערה: הכימית ברדפורד צריך להיות חום בהיר.</li>
		<li>להכין תקן של שור אלבומין (BSA) הנע בין 5 ל- 100 µg של חלבון ב- 1,000 µL מהתרכובת ברדפורד.</li>
		<li>להוסיף 1-10 µL של חלבון תמצית 1 מ"ל מהתרכובת ברדפורד, דגירה התערובת בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.</li>
		<li>למדוד את ספיגת תקנים ולחלץ החלבון דגימות-OD595.</li>
		<li>לניתוח, הופכים מגרש עם הערכים ספיגת שהתקבלו עבור הסטנדרטים vs. µg של חלבון. בהתבסס על העקומה סטנדרטי, לקבוע את ריכוזי הדגימות המקורי כמות של חלבון, בהתחשב בכך את נפח ואת דילול, אם בכלל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשטוף את הקרום עם 1 x באגירה טריס תמיסת מלח (TBS), 0.1% Tween 20 (TTBS), ולחסום אותו באמצעות חלב יבש ללא שומן 5% (w/v) ב- 1 x TTBS.<ol>
<li>להכנת 1 ליטר של 10 x TBS, להמיס 24 גר' טריס הבסיס ו- g 88 של NaCl ב 900 מל של2O Hdd ולהתאים את ה-pH ל 7.6. DdH2O להוסיף נפח סופי של 1 ל' פתרון 1 x, לערבב 1 חלק של מניות x 10 עם 9 חלקים של ddH2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>דגירה הקרום עבור h 1 עם 1:1,000 6E10 בדילול נוגדן ראשוני β-עמילואיד, לשעה בטמפרטורת החדר עם עז משני נוגדן אנטי עכבר IgG-HRP המספר המשלים מדולל 1:10, 000.</li>
	<li>לפתח ממברנות באמצעות 1 מ"ל של ריאגנט פלורסנט Luminata ולכמת להקות על ידי ניתוח densitometric, כפי שמתואר בשלב 5.2.</li>
</ol>5. ניתוח נתונים
<ol><li>כדי לנתח את הנתונים שבידי FC, ליצור טבלה מציג את עוצמת פלורסנט רשע (MFI), קרינה פלואורסצנטית החציוני לשגיאה הסטנדרטית המתאימים ו/או המקדם של השונות (CV) עבור קרינה פלואורסצנטית GFP ורמות סטרס חמצוני.<ol>
<li>לחץ על הכרטיסיה מפקח בסמל נתונים סטטיסטיים כדי להתאים אישית את נתונים סטטיסטיים הדרושים לכל ערוץ. הערה: בעת השוואת גרסאות חלבון, להמיר פלורסצנטיות ערכי הנתונים מקפלים-over רקע או מדד רזולוציה (RD): <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57470/57470eq1.jpg"> בהמדד, המדגם רשע הוא זריחה מתכוון הבעיה דוגמאות של הפקד רשע הוא זריחה אכזרי של תאים משמש פקד, הגרמנים הוא סטיית התקן של זריחה אומר. פקטור רואד הוא אינדקס מדויקת יותר מהערך MFI הוא לא רק מחשב את ההפרש בין דגימות, אלא גם חשבונות עבור הפצת הנתונים. חישוב זה רלוונטי במיוחד כאשר משווים נתונים שמקורם ניסויים שונים מתבצעת לאורך זמן. לאחר ה-RDs חושבו, השימוש של מבחן סטטיסטי מומלץ לאשר את משמעות ההבדלים שנצפה בין גרסאות חלבון.</li>
	</ol>
</li>
	<li>עבור חלבון immunodetection, לכמת את רמות חלבון רקומביננטי מאת תספיג באמצעות תוכנת ImageJ.<ol>
<li>לפני הניתוח densitometry, להמיר תמונות raw המקורי של קרום מפותחת תבנית קובץ JPEG ומצב בגווני אפור.</li>
		<li>להתאים את המקטע להגדיר מידות של התפריט נתח לערך גריי אומר.</li>
		<li>לחץ על הכלי מלבן של ImageJ ולהגדיר אזור בעל עניין (ROI) בגודל אחיד לניתוח densitometry הלהקה. מרכז כל הלהקה על התמונה ממברנה בתוך המסגרת מלבני נוצר והקלטה של מדידה אחת באמצעות Ctrl + M (הפקודה מדידה).</li>
		<li>למדוד את הרקע מקומי צמוד כל הלהקה, החלת רועי באותו האזור. לאחר המדידה, להחסיר הרקע המקומי המתאים כל הלהקה בודדים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Frydman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+newly+translated+proteins+in+vivo:+the+role+of+molecular+chaperones.">Folding of newly translated proteins in vivo: the role of molecular chaperones.</a> Annual Review of Biochemistry. 70, 603-647 (2001).</li><li>Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+chaperones+in+protein+folding+and+proteostasis.">Molecular chaperones in protein folding and proteostasis.</a> Nature. 475, 324-332 (2011).</li><li>Wong, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinants+of+selective+clearance+of+protein+inclusions+by+autophagy.">Molecular determinants of selective clearance of protein inclusions by autophagy.</a> Nature Communications. 3, (2012).</li><li>Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+networks+in+protein+disaggregation+and+prion+propagation.">Chaperone networks in protein disaggregation and prion propagation.</a> Journal of Structural Biology. 179, 152-160 (2012).</li><li>Glickman, M. H., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+proteolytic+pathway:+destruction+for+the+sake+of+construction.">The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: destruction for the sake of construction.</a> Physiological Reviews. 82, 373-428 (2002).</li><li>Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+out+of+shape.">Getting out of shape.</a> Nature. 418, 729-730 (2002).</li><li>Chiti, F., Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+misfolding,+functional+amyloid,+and+human+disease.">Protein misfolding, functional amyloid, and human disease.</a> Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).</li><li>Aguzzi, A., O'Connor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+diseases:+pathogenicity+and+therapeutic+perspectives.">Protein aggregation diseases: pathogenicity and therapeutic perspectives.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 9, 237-248 (2010).</li><li>Rapezzi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transthyretin-related+amyloidoses+and+the+heart:+a+clinical+overview.">Transthyretin-related amyloidoses and the heart: a clinical overview.</a> Nature Reviews Cardiology. 7, 398-408 (2010).</li><li>Deas, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+oligomers+interact+with+metal+ions+to+induce+oxidative+stress+and+neuronal+death+in+Parkinson's+disease.">Alpha-synuclein oligomers interact with metal ions to induce oxidative stress and neuronal death in Parkinson's disease.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 24, 376-391 (2016).</li><li>Brundin, P., Melki, R., Kopito, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-like+transmission+of+protein+aggregates+in+neurodegenerative+diseases.">Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 301-307 (2010).</li><li>Frost, B., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-like+mechanisms+in+neurodegenerative+diseases.">Prion-like mechanisms in neurodegenerative diseases.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 155-159 (2009).</li><li>Arrasate, M., Mitra, S., Schweitzer, E. S., Segal, M. R., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+body+formation+reduces+levels+of+mutant+huntingtin+and+the+risk+of+neuronal+death.">Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and the risk of neuronal death.</a> Nature. 431, 805-810 (2004).</li><li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opinion:+what+is+the+role+of+protein+aggregation+in+neurodegeneration?.">Opinion: what is the role of protein aggregation in neurodegeneration?.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 891-898 (2005).</li><li>Mishra, R., Sj&#246;lander, D., Hammarstr&#246;m, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectroscopic+characterization+of+diverse+amyloid+fibrils+in+vitro+by+the+fluorescent+dye+Nile+red.">Spectroscopic characterization of diverse amyloid fibrils in vitro by the fluorescent dye Nile red.</a> Molecular BioSystems. 7, 1232-1240 (2011).</li><li>Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+amyloid+by+congo+red+spectral+shift+assay.">Quantifying amyloid by congo red spectral shift assay.</a> Methods in Enzymology. 309, 285-305 (1999).</li><li>Khurana, V., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+neurodegeneration+in+Saccharomyces+cerevisiae:+why+cook+with+baker's+yeast?.">Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's yeast?.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 436-449 (2010).</li><li>Tenreiro, S., Outeiro, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+is+good:+yeast+models+of+neurodegeneration.">Simple is good: yeast models of neurodegeneration.</a> FEMS Yeast Research. 10, 970-979 (2010).</li><li>Moosavi, B., Mousavi, B., Macreadie, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+model+of+amyloid-&#946;+and+Tau+aggregation+in+Alzheimer's+disease.">Yeast model of amyloid-&#946; and Tau aggregation in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 47, 9-16 (2015).</li><li>Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+power+of+yeast+to+unravel+the+molecular+basis+of+neurodegeneration.">Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration.</a> Journal of Neurochemistry. 127, 438-452 (2013).</li><li>Yang, J., Hao, X., Cao, X., Liu, B., Nystr&#246;m, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+sequestration+and+detoxification+of+huntingtin+by+the+ribosome+quality+control+complex.">Spatial sequestration and detoxification of huntingtin by the ribosome quality control complex.</a> eLife. 5, (2016).</li><li>Braun, R. J., B&#252;ttner, S., Ring, J., Kroemer, G., Madeo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nervous+yeast:+modeling+neurotoxic+cell+death.">Nervous yeast: modeling neurotoxic cell death.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35, 135-144 (2010).</li><li>Figley, M. D., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+genetic+screen+reveals+novel+therapeutic+strategy+for+ALS.">Yeast genetic screen reveals novel therapeutic strategy for ALS.</a> Rare Diseases. 1, e24420 (2013).</li><li>Cooper, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+blocks+ER-Golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson's+models.">Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313, 324-328 (2006).</li><li>Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+TDP-43+proteinopathy+model:+exploring+the+molecular+determinants+of+TDP-43+aggregation+and+cellular+toxicity.">A yeast TDP-43 proteinopathy model: exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 6439-6444 (2008).</li><li>Bharathi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+ade1+and+ade2+mutations+for+development+of+a+versatile+red/white+color+assay+of+amyloid-induced+oxidative+stress+in+saccharomyces+cerevisiae.">Use of ade1 and ade2 mutations for development of a versatile red/white color assay of amyloid-induced oxidative stress in saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 33, 607-620 (2016).</li><li>Pallar&#232;s, I., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+prediction+of+protein+aggregation+propensity.">Advances in the prediction of protein aggregation propensity.</a> Current Medicinal Chemistry. , (2017).</li><li>Villar-Piqu&#233;, A., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+propensity+is+a+crucial+determinant+of+intracellular+inclusion+formation+and+quality+control+degradation.">Protein aggregation propensity is a crucial determinant of intracellular inclusion formation and quality control degradation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1833, 2714-2724 (2013).</li><li>Navarro, S., Villar-Piqu&#233;, A., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+against+toxic+aggregation-prone+protein+sequences+in+bacteria.">Selection against toxic aggregation-prone protein sequences in bacteria.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1843, 866-874 (2014).</li><li>Morell, M., de Groot, N. S., Vendrell, J., Avil&#233;s, F. X., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+amyloid+protein+aggregation+and+yeast+survival.">Linking amyloid protein aggregation and yeast survival.</a> Molecular BioSystems. 7, 1121-1128 (2011).</li><li>Conchillo-Sol&#233;, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AGGRESCAN:+a+server+for+the+prediction+and+evaluation+of+&amp;#34;hot+spots&amp;#34;+of+aggregation+in+polypeptides.">AGGRESCAN: a server for the prediction and evaluation of &amp;#34;hot spots&amp;#34; of aggregation in polypeptides.</a> BMC Bioinformatics. 8, 65 (2007).</li><li>Fernandez-Escamilla, A. M., Rousseau, F., Schymkowitz, J., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+sequence-dependent+and+mutational+effects+on+the+aggregation+of+peptides+and+proteins.">Prediction of sequence-dependent and mutational effects on the aggregation of peptides and proteins.</a> Nature Biotechnology. 22, 1302-1306 (2004).</li><li>Renner, M., Melki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+and+prionopathies.">Protein aggregation and prionopathies.</a> Pathologie Biologie.(Paris). 62, 162-168 (2014).</li><li>Carija, A., Navarro, S., de Groot, N. S., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+into+insoluble+deposits+protects+from+oxidative+stress.">Protein aggregation into insoluble deposits protects from oxidative stress.</a> Redox Biology. 12, 699-711 (2017).</li></ol>

מגוון רחב של מחלות קשורה להצטברות של חלבונים misfolded לתוך הסלולר פיקדונות6,7,8,33. מאמצים רבים נעשו כדי לפענח את המנגנונים המולקולריים המפעילות את התפרצות של מחלות אלו באמצעות גישות חישובית, אשר לא עשה חשבון חלבון ריכוזים, או במבחנה מתקרב, שבו ריכוז חלבון נשארת קבועה במהלך התגובה. עם זאת, בתוך התא, חלבונים נמצאים כל הזמן מסונתז והשפילו בסביבה צפופה, אי-הומוגניות. זה מסביר את הסתירות תכופים בין סיליקו, חוץ גופית בתוך, ויוו צבירת ומאפייני של חלבונים amyloidogenic.
ישנן מספר סיבות מדוע דגמי הסלולר פשוטים, כגון שמרים, הם בחירה סבירה ללמוד הצבירה משויך רעילות של חלבונים הקשורים למחלות ניווניות בהקשר ביולוגי יותר. למשל, הם נותנים לנו את האפשרות לנתח את השפעת חלבון צבירה misfolding על אוכלוסיה הסלולר שלם באמצעות ניתוח מהיר כמו זו מיושמת כאן. עם זאת, אנחנו צריכים לשקול כי רמות חמצון עשויים להיות שונים בין זני שמרים. לפיכך, כדי להשוות בין זנים או אפילו בין חלבונים שונים, חמצון ו reductants, כגון DTT diamine ב, אמור לשמש להקים בקנה מידה של חמצון/צמצום.
בדוגמה המומחשות במאמר זה, ניתוח bioinformatic, חלבון תאית כמת, חלבון לוקליזציה הדמיה וניתוח FC בו זמנית של פעילות ה-GFP רמות סטרס חמצוני משולבים כדי לזהות את מולקולרית מינים אחראי לנזק חימצוני שהפיק תגובות צבירת חלבון. התוצאות להפגין על גרסאות Aβ42 מסיס יותר, יותר מאשר את יותר צבירת מועדת, לקדם את סטרס חמצוני הגבוהה ביותר. זה מצביע על המין diffusible להיות מסוכן יותר Aβ42 מינים בתוך vivo. רעילות נמוכה יותר של צבירה גרסאות נראה להגיב גם על העובדה כי אלה הייצורים החיים הן מבודדות לתוך PI וגם כדי שפלותם מועדף על ידי המנגנון באיכות החלבון, וכתוצאה מכך רמות החלבון נמוכה יותר מזו של שלהם מסיסים עמיתיהם.
השיטה המתוארת אינה מוגבלת לניתוח של סטרס חמצוני המיוצר על ידי מינים המצטברים/מסיסים Aβ42 ולא ניתן להחיל גם ללמוד מגוון רחב של הפרעות צבירת חלבון. יתר על כן, הטכניקה עשוי להיות שימושי לנטר את ההשפעה של צבירת מעכבי על הסלולר סטרס חמצוני, המאפשר להתעלם ליישומים קליניים נוספים אלה מולקולות המקדמות ההצטברות של חלבון פעיל חמצוני מינים בסופו של דבר, כל עוד בדיקה fluorogenic זמין, הגישה מציעה הזדמנויות יוצא דופן כדי לזהות את הזן המולקולרי האחראי על אפקטים רעילים אחרים הקשורים צבירת חלבון ב מהיר דרך קלה, מתן נתונים כמותיים.

פרוטוסטאזיס הוא דטרמיננטה הבסיסית של כושר תא ותהליכי הזדקנות. תאים, חלבון הומאוסטזיס נשמר על ידי בקרת איכות החלבון המתוחכם רשתות שנועד להבטיח את נכונות refolding של חלבונים misfolded conformers מלווים ו/או proteolysis יישוב שלהם עם מספר מנגנונים שנשמרת היטב1 ,2,3,4,5. מספר רב של מחקרים מספקים תמיכה לקשר בין התפתחות והתקדמות של מגוון רחב של מחלות האדם וכישלון פרוטוסטאזיס, המוביל אל חלבון misfolding, צבירת. למשל, הנוכחות של חלבון פיקדונות נחשב סימן היכר פתולוגי של הפרעות ניווניות רבים, כמו אלצהיימר, פרקינסון, ו הנטינגטון מחלות6,7,8, מחלות prionogenic, amyloidoses ניוונית9. הוצע כי הרכבות oligomeric, protofibrillar מוקדמת בהתגובה צבירת הן elicitors הראשי של cytotoxicity, הקמת aberrant אינטראקציות עם חלבונים אחרים חצרו הסלולר צפוף10. בנוסף, חלבון הכללות (PI) יכול להיות מועבר בין תאים, הפצת שלהם השפעה רעילה11,12. לכן, זה יכול להיות כי היווצרות של PI אולי אכן מהווה מנגנון בעלת מגבילה את נוכחותם של מינים צבורים מסוכן למיקומים ספציפיים בתא, היכן ניתן לעבד או שנצבר ללא תופעות לוואי משמעותיות 13 , 14.
תקן במבחנה גישות הביוכימי סיפקו תובנות חשובות מינים שונים that לאכלס את צבירת תגובות ו15,שלהם מאפיינים16. עם זאת, תנאי שימוש אלה מבחני בבירור שונות מאלו המתרחשים בתוך התא ולתשאל, לכן, מאבדים רלבנטיות פיזיולוגיים. בגלל השימור הבולטים של מסלולים סלולריים כגון בקרת איכות חלבון, autophagy או ברגולציה של הסלולר חמצון-חיזור המדינה17,18 בין פרוקריוטים19,20,21 ,22,23, שמרים ניצני האפייה (cerevisiae ס) התפתחה מיוחס מודל הסלולר פשוט ללמוד על גורמים מולקולרית של צבירת חלבון והשפעתו המשויך ציטוטוקסיות סביבות ביולוגית רלוונטית24,25,26.
חלבון צבירת הנטייה היא תכונה מטבעו מקודד ברצף העיקרי. לפיכך, היווצרות עמילואיד-מבני ניתן לחזות המבוסס על זיהוי, הערכה של עוצמת קידום צבירת אזורים polypeptides27. עם זאת, למרות ההצלחה של אלגוריתמים bioinformatic כדי לחזות את המאפיינים צבירת במבחנה של רצפי חלבונים, הם עדיין רחוק מלהיות חיזוי איך לתרגם אלה מספק שלעצמו ויוו ציטוטוקסיות ההשפעה. מחקרים כתובת הקישור בין המדינה צבורים של חלבון נתון שלה נזק תאי המשויכים בצורה שיטתית עשוי לעזור כדי לעקוף מגבלה זו חישובית. חיבור זה הוא התייחס במחקר הנוכחי, ניצול של סט גדול של גרסאות של פפטיד עמילואיד-β Aβ42 שונות רק ב משקע יחיד, אך הצגת טווח רציף של צבירת מספק שלעצמו ויוו28. בפרט, מתואר גישה מבוססת-FC לזהות את הזן הסתגלותי החשבונאי נזק חמצוני שהפיק צבירת נוטה חלבונים בתאים שמרים. המתודולוגיה מספק יתרונות רבים כגון פשטות, תפוקה גבוהה יכולת מדידה כמותית מדויקת. גישה זו אפשרו לאשר את PI לשחק תפקיד מגן מפני עקה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Yeast cells BY4741&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>201388</td>
			<td>Genotype: MATa his3&#916;1 leu2&#916;0 met15&#916;0 ura3&#916;0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pESC(-Ura) plasmid&#160;</td>
			<td>Agilent Genomics</td>
			<td>217454</td>
			<td>Yeast expression plasmid with a Gal promotor. Selectable marker URA3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y1501</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Nitrogen Base Without Amino Acids</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0626</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raffinose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7630</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galactose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G0750</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3991&#160;</td>
			<td>Solution 10X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellROX Deep Red Reagent&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10422</td>
			<td>Free radical cell-permeant fluorescent sensor, non-fluorescent while in a reduced state, and exhibits bright fluorescence upon oxidation by reactive oxygen species (ROS), with absorption/emission maxima at 644/665 nm.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-PER protein extraction reagent&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78990</td>
			<td>Liquid cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide/Bis-acrylamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6050</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford dye reagent</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>5000205</td>
			<td>Dye reagent for one-step determination of protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-amyloid antibody 6E10&#160;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>803001</td>
			<td>Mouse IgG1. The epitope lies within amino acids 3-8 of beta amyloid (EFRHDS).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG-HRP conjugate&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1721011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane Immobilon-P, PVDF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminata forte</td>
			<td>Merk</td>
			<td>WBLUF0100</td>
			<td>Premixed, ready to use chemiluminescent HRP detection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride solution (PMSF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93482</td>
			<td>Protease inhibitor. Dissolved at 0.1 M in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCanto flow cytometer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>657338</td>
			<td>Equipped with a 488&#160;nm blue laser for the detection of GFP, and 635&#160;nm red laser / 530/30 nm BP filter and 660/20 BP filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Electrophoresis Transfer cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703930</td>
			<td>Protein transference system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Handcast Systems</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658000FC</td>
			<td>Electrophoresis system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of the impact of protein aggregation on cellular oxidative stress in yeast

חלבון misfolding, צבירת לתוך עמילואיד הייצורים החיים קשורה עם התחלתה של התקדמות של מספר מחלות ניווניות. עם זאת, יש עדיין מעט מידע על חלבונים מסיסים איך אגרגטים להפעיל את ההשפעות הרעילות שלהם בתוך vivo. אורגניזמים פשוטים prokaryotic ו האיקריוטים מודל, כגון חיידקים, שמרים, תרמו משמעותית להבנתנו הנוכחי של המנגנונים מאחורי היווצרות עמילואיד תאיים, הפצת אגרגטים, רעילות. ב פרוטוקול זה, השימוש של שמרים מתואר כמודל לנתח את הקשר בין היווצרות של אגרגטים חלבון והשפעתם על הסלולר סטרס חמצוני. השיטה משלבת את הגילוי של המדינה מסיסים/המצטברים תאיים החלבון amyloidogenic עם כימות של נזק חמצוני הנובע ביטויה באמצעות cytometry זרימה (FC). גישה זו היא פשוטה, מהירה, כמותית. המחקר מדגים את הטכניקה על-ידי התאמת את הסלולר עקה הנגרמת על ידי קבוצה גדולה של עמילואיד-β משתנים פפטיד עם שלהם מספק שלעצמו צבירת מהותי בהתאמה.

פרוטוקול זה מתאר כיצד להעסיק אוסף של משתנים 20 של פפטיד Aβ42 שבו יש כבר מוטציה Phe19 proteinogenic טבעי כל חומצות אמינו28. מספק צבירת התיאורטי שלעצמו החלבונים האלה ניתן לנתח באמצעות אלגוריתמים שונים bioinformatic שני (AGGRESCAN וטנגו31,32). בשני המקרים, ניתוח זה הופך את שינוי הדרגתי פרוגרסיבי של צבירת נטיות, ומייחס, ככלל, את הערכים הגבוהים ביותר ואני את שאריות הידרופובי לאלה טעונה, קוטבי (איור 1B, 1 ג').
כדי לעקוב אחר השפעול מצב צבירה תאיים Aβ42 וריאציות שונות, הניסוי המתואר מחייבת טרנספורמציה של פלסמיד, קידוד Aβ42 ומאוחדים. עם GFP (איור 1 א') תחת השליטה של גלקטוז-inducible GAL1, לתוך cerevisiae ס. ניתן לאבחן תאי שמרים לבטא את Aβ42 וריאציות לאחר תקופה אינדוקציה של 16 h תחת מיקרוסקופ זריחה. הדמיה זו מאפשרת לך לאשר את היווצרות של פי 10 מתוך גרסאות 20 מתוך אוסף שנותחה. המספר והגודל של פלורסנט מצרפי שונים משתנה variant (איור 2). איור 2A מראה כימות PI מתוך סך של 500 תאים בכל אחד שתי התרבויות עצמאית. כאן, ניתן להבחין הסכם מעולה בין חזה וויוו צבירת נכסים.
כדי לטפל אם היווצרות של אגרגטים חלבון יכול לעורר סטרס חמצוני במערכת תא מודל, פרוטוקול זה משתמש FC כדי לפקח על זריחה GFP הסלולר יחד עם זריחה של המכשיר fluorogenic כמחוון של חמצן תגובתי ייצור מינים (ROS). איור 3 ממחיש את ההליך, השיג תוצאות עבור מוטציות אך זה לא נגמר, איל, המקבילים על גרסאות Aβ42 homogeneously מבוזרת ויוצרים PI, בהתאמה.
ראשית, האוכלוסיה תא שנותחה היא מגודרת (P1) בהנקודה האס-A FSC-A מול מגרש להסיר תאים דטריטי מניתוח (איור 3 א). האות זריחה של GFP לעומת סטרס חמצוני בדיקה של האוכלוסייה P1 מיוצג בגרפים מגרש נקודה שבה תאים ניאון ירוק הן פיקוח ב- P3 (איור 3B). 3C איור ותלת מימד מראים את היסטוגרמות נוצר כדי לקבל נתונים סטטיסטיים עבור כל ביטוי משתנה, כולל את קורות חיים (טבלה 2), כדי לכמת את הממוצע, על ידי קרינה פלואורסצנטית החציוני של כל סמן פלורסנט.
כל המוטציות צפויים לבוא לידי ביטוי ברמות באותו כיוון שהם נבדלים חומצה אמינית בודדת (0.02% של הרצף Aβ42-GFP). עם זאת, המנגנון פרוטוסטאזיס יכול להגיב באופן דיפרנציאלי שלהם מספק שלעצמו צבירה מסוים. לכן, רמות הביטוי החלבון תמציות הסלולר הן לכמת באמצעות נוגדן ספציפי Aβ (איור 4). אנו רואים, כמו כי המגמה הכללית, Aβ42 להיוות PI משתנים קיימים ברמות נמוכות יותר מאלה שנותרו homogeneously מופץ ב ציטוזול...
יכול להיות שנצפו הבדלים חשובים בין גרסאות Aβ42 כאשר שלהם סטרס חמצוני בדיקה פלורסצנטיות, רמות החלבון ומאפיינים GFP פלורסצנטיות מיוצגים באופן יחסי את היכולת שלהם ליצור PI שלהם מספק שלעצמו צבירת מהותי ( איור 5). יותר צבירת נוטה גרסאות להיוות PI להפיק הרבה סטרס חמצוני נמוכה יותר מאשר עמיתיהם יותר מסיס (איור 5A, 5B). עם התוצאות האלה, יש מתאם ברור בין הגודל והמספר של אגרגטים לכל תא בודד (איור 2) ואת רמות סטרס חמצוני. גרסאות להיוות PI, במיוחד מוטציות הנושאת Trp ו Phe במיקום 19, נמצאים בתא ברמות נמוכות יותר מאלה למשל מופץ ב- ציטוזול (איור 5C, 5 D). החריג לכך הוא חמישי החשבונאי, אשר פחות מ-10% של התאים יוצרים פאי (איור 1B, 1 ג'). זה תואם עם העובדה כי המשתנים נוטים ביותר צבירת נמחקים באופן סלקטיבי על ידי מכונות28השפלה בקרת איכות שמרים. קרינה פלואורסצנטית GFP ורמות החלבון לתאם טוב עבור הטפסים Aβ42 מסיס יותר, אך לא עבור אלו ויוצרים PI (איור 5E, 5F). זה כנראה בגלל באוכלוסיות אלה הסלולר, ידי קרינה פלואורסצנטית נובע שני תאים שונים, את ציטוזול והן תכלילים, זריחה הכולל התרומה שלהם שונים בין המוטציות34.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57470/57470fig1.jpg"> איור 1 . צבירת ניתוח הנטייה של האוסף של Aβ42-GFP פיוז'ן בונה נגזר המוטציה של שאריות-19 בעמדה פפטיד Aβ42 על ידי כל חומצות האמינו טבעי. א. תמונה זו מציגה מודל 3D של wt Aβ42 התמזגו ל GFP באמצעות מקשר (Aβ42, אפור; GFP, ירוק), מבוסס על 1EMA PDB עבור חלבון פלואורסצנטי ירוק, ויקטוריה Aequorea , את 2OTK עבור פפטיד אלצהיימר Aβ בו שרשרת הצד Phe19 wt Aβ42 מוצג באדום. המודל נוצר באמצעות תוכנת Pymol. שאריות 19 ברצף Aβ42 שוכן במיקום מרכזי בהאשכול המרכזי הידרופובי. מהגרפים נוצרים עם שני גורמים מנבאים bioinformatic שונים: B. AGGRESCAN, ג. טנגו. <a href="/files/ftp_upload/57470/57470fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57470/57470fig2.jpg"> איור 2 . Aβ42-GFP PI-ויוצרים גרסאות cerevisiae ס תרבויות המושרה עבור h 16 של הביטוי. א. הגרף מציין את אחוזי תאים המכילים מספר שונה של PI מחושב מתוך סך של 500 פלואורסצנט תאים עבור כל משתנה ב משכפל ביולוגית שני. B. התמונות האלו הן תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי נציג של משתנים Aβ42-GFP שנבחר (Phe, איל, חמישי, Trp). הם היו רכשה תחת אור UV באמצעות מסנן עירור GFP (450-500 ננומטר) ומגוון פליטה (515-560 ננומטר). סרגל קנה מידה מייצג 10 מיקרומטר. <a href="/files/ftp_upload/57470/57470fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57470/57470fig3.jpg"> איור 3 . שיטת לזרום cytometry (FC) ניתוח of cerevisiae ס התאים לבטא גרסאות Aβ42-GFP שנבחרו. א. התרשים מראה תאי שמרים מגודרת (P1) נקודה חלקות (FSC-A לעומת האס-A) שבו תא דטריטי יוסר האוכלוסייה תא. תמונות מיקרוסקופיות של זאת שוב (homogeneously מופץ) וכל הווריאנטים איל (יוצרי PI) מוצגים ליד שהנקודה FC מגרשים. סרגל קנה מידה מייצג 10 מיקרומטר. B. הדימויים מגרש פיזור נקודה מייצגים GFP-A לעומת בדיקה סטרס חמצוני שבו האוכלוסייה מגודרת (P3) כולל רק פלואורסצנט תאים, למעט האות רקע. היסטוגרמות תדירות התא הם של C. GFP האות (FITC משרעת) מגודרת מ- P1 ו- D. CellROX (APC משרעת) מגודרת של P3. תא הרכישה בוצעה עם cytometer זרימה. כל חלקה מייצגת את האירועים 20,000. קיו, אני מתכתבת המוטנטים אך זה לא נגמר, איל Aβ42, בהתאמה. <a href="/files/ftp_upload/57470/57470fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57470/57470fig4.jpg"> איור 4 . כימות של רמות החלבון הסלולר. איור זה מציג שהכלים המערבי של שברים חלבון הכולל של מוטציות Aβ42-GFP לאחר 16 h של ביטוי cerevisiae ס. יוצרי PI גרסאות צבועות בירוק, אלה המופצות diffusely ב ציטוזול נצבעים בצבע אדום בהיר. <a href="/files/ftp_upload/57470/57470fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57470/57470fig5.jpg"> איור 5 . סטרס חמצוני הסלולר תאיים GFP פלורסצנטיות, רמות החלבון הסלולר למוטאנטים Aβ42-GFP שנקבעו לאחר 16 h של ביטוי cerevisiae ס. המשתנים מיוצגים בציר ה-x כבר הורה על פי שלהם מספק שלעצמו צבירת החזוי באמצעות AGGRESCAN (פאנל שמאלי) או טנגו (לוח נכון). יוצרי PI גרסאות צבועות בירוק, גרסאות ללא PI-יוצרי נצבעים בצבע אדום בהיר. א. B. גרפים בר אלה מציגות את ערכי פלורסצנטיות בדיקה של סטרס חמצוני מתקבל על ידי ניתוח FC של המוטציות Aβ42-GFP. ג. ד. גרפים בר אלה מייצגים את רמות החלבון כפי לכמת על ידי ניתוח densitometry תספיג באמצעות תוכנת ImageJ. E. F. גרפים בר אלה מציגות את ערכי פלורסצנטיות GFP לאחר ניתוח FC. קווי השגיאה עבור סטרס חמצוני בדיקה ומייצגות ערכים פלורסצנטיות GFP המקדם של סטיית (CV) של התאים ממותגת FC. קווי השגיאה עבור רמות ביטוי חלבונים מייצגים ± SE (n = 3). <a href="/files/ftp_upload/57470/57470fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ערוץ</td>
			<td>Fluorophore</td>
			<td>גל עירור (אן אם)</td>
			<td>הלהקה מסנן</td>
		</tr>
<tr>
<td>FITC</td>
			<td>GFP</td>
			<td>488</td>
			<td>530/30</td>
		</tr>
<tr>
<td>APC</td>
			<td>CellRox</td>
			<td>635</td>
			<td>660/20</td>
		</tr>
<tr>
<td>PerCP</td>
			<td>ה-IP</td>
			<td>488</td>
			<td>585/42</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1. מקור לייזר, הלהקה לעבור מסננים ו fluorophores בשימוש זרימה cytometer.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>קרינה פלואורסצנטית GFP</td>
			<td>קורות חיים</td>
			<td>CellROX קרינה פלואורסצנטית</td>
			<td>קורות חיים</td>
		</tr>
<tr>
<td>A</td>
			<td>9316</td>
			<td>96.4</td>
			<td>1964</td>
			<td>127.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>9709</td>
			<td>91.9</td>
			<td>1275</td>
			<td>172.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>11213</td>
			<td>101.7</td>
			<td>3443</td>
			<td>155.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>E</td>
			<td>12256</td>
			<td>101.1</td>
			<td>3220</td>
			<td>152.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>F</td>
			<td>3010</td>
			<td>96.1</td>
			<td>1245</td>
			<td>146.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>G</td>
			<td>11541</td>
			<td>97.2</td>
			<td>2947</td>
			<td>158</td>
		</tr>
<tr>
<td>H</td>
			<td>7895</td>
			<td>98.2</td>
			<td>3582</td>
			<td>120.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>. אני</td>
			<td>7365</td>
			<td>97.2</td>
			<td>1416</td>
			<td>141.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>K</td>
			<td>10839</td>
			<td>100.4</td>
			<td>3102</td>
			<td>122.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>L</td>
			<td>7605</td>
			<td>96.9</td>
			<td>1401</td>
			<td>161.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>M</td>
			<td>8149</td>
			<td>96</td>
			<td>1308</td>
			<td>170.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>N</td>
			<td>12741</td>
			<td>97.5</td>
			<td>3403</td>
			<td>134.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>P</td>
			<td>9768</td>
			<td>102.8</td>
			<td>2629</td>
			<td>143.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>Q</td>
			<td>13066</td>
			<td>91.3</td>
			<td>3354</td>
			<td>169.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>R</td>
			<td>8537</td>
			<td>101.3</td>
			<td>2839</td>
			<td>127.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>S</td>
			<td>12053</td>
			<td>99.1</td>
			<td>3313</td>
			<td>174.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>T</td>
			<td>10615</td>
			<td>97.7</td>
			<td>2213</td>
			<td>107.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>V</td>
			<td>9169</td>
			<td>96.1</td>
			<td>1878</td>
			<td>121.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>W</td>
			<td>1715</td>
			<td>94.7</td>
			<td>1531</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>Y</td>
			<td>7574</td>
			<td>94.5</td>
			<td>1234</td>
			<td>138</td>
		</tr>
</tbody></table>בטבלה 2. רשימת הערכים GFP פלורסצנטיות, סטרס חמצוני בדיקה קרינה פלואורסצנטית מתקבל על ידי ניתוח FC של תאי שמרים לבטא Aβ42-GFP מוטציות עבור ה 16 טבלה זו מציגה את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע (MFI), את קורות חיים עבור כל מוטציה.

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast at JoVE.com

Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

הערכת ההשפעה של חלבון צבירה על סטרס חמצוני הסלולר ב שמרים

חלבון צבירת מעורר הסלולר סטרס חמצוני. פרוטוקול זה מתאר שיטה לניטור את המדינות amyloidogenic חלבונים תאיים סטרס חמצוני המשויכים אליהן, באמצעות cytometry זרימה. הגישה משמש כדי ללמוד על אופן הפעולה של גרסאות מסיסים ונוטה צבירת של פפטיד עמילואיד-β.

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

evaluation-impact-protein-aggregation-on-cellular-oxidative-stress

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

7.2K Views.  Universitat Autònoma de Barcelona. חלבון צבירת מעורר הסלולר סטרס חמצוני. פרוטוקול זה מתאר שיטה לניטור את המדינות amyloidogenic חלבונים תאיים סטרס חמצוני המשויכים אליהן, באמצעות cytometry זרימה. הגישה משמש כדי ללמוד על אופן הפעולה של גרסאות מסיסים ונוטה צבירת של פפטיד עמילואיד-β.

Video: Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. Hydrogen-Deuterium Exchange (HDX) measured at rapid time scales is uniquely suited to detect structures and hydrogen bonding networks that are briefly populated, allowing for the characterization of transient conformers in native ensembles. Coupling of HDX to mass spectrometry offers several key advantages, including high sensitivity, low sample consumption and no restriction on protein size. This technique has advanced greatly in the last several decades, including the ability to monitor HDX labeling times on the millisecond time scale. In addition, by incorporating the HDX workflow onto a microfluidic platform housing an acidic protease microreactor, we are able to localize dynamic properties at the peptide level. In this study, Time-Resolved ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry (TRESI-MS) coupled to HDX was used to provide a detailed picture of residual structure in the tau protein, as well as the conformational shifts induced upon hyperphosphorylation.

Conformational flexibility plays a critical role in protein function. Herein, we describe the use of time-resolved electrospray ionization mass spectrometry coupled to hydrogen-deuterium exchange for probing the rapid structural changes that drive function in ordered and disordered proteins.

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

שיטה פשוטה להקרנה כימי תפוקה גבוהה ב Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the discovery of high-affinity interactors that are highly enriched in the library of interacting candidates. In a traditional format, the yeast 2-hybrid assay can yield too many colonies to analyze when conducted at low stringency where low affinity interactors might be found. Moreover, without a comprehensive and complete interrogation of the same library against different bait plasmids, a comparative analysis cannot be achieved. Although some of these problems can be addressed using arrayed prey libraries, the cost and infrastructure required to operate such screens can be prohibitive. As an alternative, we have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing a strategy termed DEEPN (Dynamic Enrichment for Evaluation of Protein Networks), which incorporates high-throughput DNA sequencing and computation to follow the evolution of a population of plasmids that encode interacting partners. Here, we describe customized reagents and protocols that allow a DEEPN screen to be executed easily and cost-effectively.

Batch processing of yeast 2-hybrid screens allows for direct comparison of the interaction profiles of multiple bait proteins with a highly complex set of prey fusion proteins. Here, we describe refined methods, new reagents, and how to implement their use for such screens.

מסך 2-היברידית שמרים אצווה כדי להשוות בין אינטראקציות חלבון

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such systems allows for detailed studies of their underlying mechanisms which would not be feasible in vivo. Here, we provide a protocol for the in vitro reconstitution of the MinCDE system of Escherichia coli, which positions the cell division septum in the cell middle. The assay is designed to supply only the components necessary for self-organization, namely a membrane, the two proteins MinD and MinE and energy in the form of ATP. We therefore fabricate an open reaction chamber on a coverslip, on which a supported lipid bilayer is formed. The open design of the chamber allows for optimal preparation of the lipid bilayer and controlled manipulation of the bulk content. The two proteins, MinD and MinE, as well as ATP, are then added into the bulk volume above the membrane. Imaging is possible by many optical microscopies, as the design supports confocal, wide-field and TIRF microscopy alike. In a variation of the protocol, the lipid bilayer is formed on a patterned support, on cell-shaped PDMS microstructures, instead of glass. Lowering the bulk solution to the rim of these compartments encloses the reaction in a smaller compartment and provides boundaries that allow mimicking of in vivo oscillatory behavior. Taken together, we describe protocols to reconstitute the MinCDE system both with and without spatial confinement, allowing researchers to precisely control all aspects influencing pattern formation, such as concentration ranges and addition of other factors or proteins, and to systematically increase system complexity in a relatively simple experimental setup.

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

We provide a protocol for in vitro self-organization assays of MinD and MinE on a supported lipid bilayer in an open chamber. Additionally, we describe how to enclose the assay in lipid-clad PDMS microcompartments to mimic in vivo conditions by reaction confinement.

במבחנה בנייתו מחדש של דפוסי חלבון ב- Bilayers הנתמכים השומנים ארגון-עצמי

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and functions. It gave us the opportunity to explore a multiplicity of biophysical mechanisms, e.g., how bacterial adhesins bind to host surface receptors in more detail. Among other factors, the success of SMFS experiments depends on the functional and native immobilization of the biomolecules of interest on solid surfaces and AFM tips. Here, we describe a straightforward protocol for the covalent coupling of proteins to silicon surfaces using silane-PEG-carboxyls and the well-established N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) chemistry in order to explore the interaction of pilus-1 adhesin RrgA from the Gram-positive bacterium Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) with the extracellular matrix protein fibronectin (Fn). Our results show that the surface functionalization leads to a homogenous distribution of Fn on the glass surface and to an appropriate concentration of RrgA on the AFM cantilever tip, apparent by the target value of up to 20% of interaction events during SMFS measurements and revealed that RrgA binds to Fn with a mean force of 52 pN. The protocol can be adjusted to couple via site specific free thiol groups. This results in a predefined protein or molecule orientation and is suitable for other biophysical applications besides the SMFS.

This protocol describes the covalent immobilization of proteins with a heterobifunctional silane coupling agent to silicon-oxide surfaces designed for the atomic force microscopy based single molecule force spectroscopy which is exemplified by the interaction of RrgA (pilus-1 tip adhesin of S. pneumoniae) with fibronectin.

קיבעון קוולנטיות של חלבונים על ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and the degradation of target proteins in live cells. By using short (pulse) radiolabeling times (&lt;30 min) and tightly controlled chase times, it is possible to label only a small fraction of the total protein pool and follow its folding. When combined with nonreducing/reducing SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoprecipitation with (conformation-specific) antibodies, folding processes can be examined in great detail. This system has been used to analyze the folding of proteins with a huge variation in properties such as soluble proteins, single and multi-pass transmembrane proteins, heavily N- and O-glycosylated proteins, and proteins with and without extensive disulfide bonding. Pulse-chase methods are the basis of kinetic studies into a range of additional features, including co- and posttranslational modifications, oligomerization, and polymerization, essentially allowing the analysis of a protein from birth to death. Pulse-chase studies on protein folding are complementary with other biochemical and biophysical methods for studying proteins in vitro by providing increased temporal resolution and physiological information. The methods as described within this paper are adapted easily to study the folding of almost any protein that can be expressed in mammalian or insect-cell systems.

Here we describe a protocol for a general pulse-chase method that allows the kinetic analysis of folding, transport, and degradation of proteins to be followed in live cells.

ניתוח של קיפול חלבונים, תחבורה, והשפלה בתאים חיים על ידי הדופק רדיואקטיבי צ'ייס

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions largely depend on intracellular protein&#8211;protein interactions. Therefore, research regarding these interactions is indispensable to facilitating the understanding of physiologic processes. Co-precipitation of associated proteins, followed by mass spectrometry (MS) analysis, enables the identification of novel protein interactions. In this study, we have provided details of the novel technique of immunoprecipitation-liquid chromatography (LC)-MS/MS analysis combined with on-membrane digestion for the analysis of protein&#8211;protein interactions. This technique is suitable for crude immunoprecipitants and can improve the throughput of proteomic analyses. Tagged recombinant proteins were precipitated using specific antibodies; next, immunoprecipitants blotted onto polyvinylidene difluoride membrane pieces were subjected to reductive alkylation. Following trypsinization, the digested protein residues were analyzed using LC-MS/MS. Using this technique, we were able to identify several candidate associated proteins. Thus, this method is convenient and useful for the characterization of novel protein&#8211;protein interactions.

Here, we present a protocol for an on-membrane digestion technique for the preparation of samples for mass spectrometry. This technique facilitates the convenient analysis of protein&#8211;protein interactions.

הערכה של אינטראקציות חלבונים-חלבונים באמצעות טכניקת העיכול האנטי-ממברנה

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the homeostasis of adult tissues. Interestingly, oxidative stress can alter these processes, thus contributing to the pathophysiology of diseases such as metastatic cancer. Therefore, understanding the mechanism(s) of how cells attach and spread on the ECM during perturbations in redox status can provide insight into normal and disease states. Described below is a step-wise protocol that utilizes an immunofluorescence-based assay to specifically quantify cell adhesion and spreading of immortalized fibroblast cells on fibronectin (FN) in vitro. Briefly, anchorage-dependent cells are held in suspension and exposed to the ATM kinase inhibitor Ku55933 to induce oxidative stress. Cells are then plated on FN-coated surface and allowed to attach for predetermined periods of time. Cells that remain attached are fixed and labeled with fluorescence-based antibody markers of adhesion (e.g., paxillin) and spreading (e.g., F-actin). Data acquisition and analysis are performed using commonly available laboratory equipment, including an epifluorescence microscope and freely available Fiji software. This procedure is highly versatile and can be modified for a variety of cell lines, ECM proteins, or inhibitors in order to examine a broad range of biological questions.

This method is useful for quantifying the early dynamics of cellular adhesion and spreading of anchorage-dependent cells onto the fibronectin. Furthermore, this assay can be used to investigate the effects of altered redox homeostasis on cell spreading and/or cell adhesion-related intracellular signaling pathways.

בחינת הדינמיקה של הדבקה תאית והפצת תאים אפיתל על Fibronectin במהלך לחץ חמצוני

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins remains elusive. Here, we describe a robust and effective method for determining the suborganellar localization of yeast mitochondrial proteins, which is considered a fundamental step during mitochondrial protein function elucidation. This method involves an initial step that consists of obtaining highly pure intact mitochondria. These mitochondrial preparations are then subjected to a subfractionation protocol consisting of hypotonic shock (swelling) and incubation with proteinase K (protease). During swelling, the outer mitochondrial membrane is selectively disrupted, allowing the proteinase K to digest proteins of the intermembrane space compartment. In parallel, to obtain information about the topology of membrane proteins, the mitochondrial preparations are initially sonicated, and then subjected to alkaline extraction with sodium carbonate. Finally, after centrifugation, the pellet and supernatant fractions from these different treatments are analyzed by SDS-PAGE and western blot. The submitochondrial localization as well as the membrane topology of the protein of interest is obtained by comparing its western blot profile with known standards.

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances, many yeast mitochondrial proteins still remain with their functions completely unknown. This protocol provides a simple and reliable method to determine the submitochondrial localization of proteins, which has been fundamental for the elucidation of their molecular functions.

הערכה של לוקליזציה של חלבון Submitochondrial ב ניצנים שמרים Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...