אנו מודים מייקל Rosbash על ההדרכה שלו ותמיכה במהלך השלב הראשוני של ההתפתחות של שיטה זו. עבודה זו מומן על-ידי JST פרסטו התוכנית, שוויצרי הקרן הלאומית למדע (31003A_149893 ו- 31003A_169548), המועצה האירופית למחקר (ERC-StG-311194), נוברטיס קרן מחקר ביו-רפואי (13A39), באוניברסיטת ג'נבה .

1. הכנת מלאי פתרונות ברדס תרבות
<ol><li>להכין 400 מ של 1 x בינוני הפעיל שניידר (SAM) אופטימיזציה עבור ex-vivo תרבות של המוח זחל (שונה ההתייחסות24,25) (טבלה 1). Aliquot ל מ ל ו- flash להקפיא במצב חנקן נוזלי (LN2), לאחסן ב- 80 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>להכין 1 x Dissecting, תמיסת (DSS) על-ידי המדללת 10 x מניות פתרון (שונה ההתייחסות26) (טבלה 2).</li>
	<li>פיברינוגן aliquot 10 מ ג, חנות ב 4 ° C לשימוש בודד. התראה: שוקלים פיברינוגן תחת זרימה שכבתית, לבש כפפות, כפי שהוא מזיק.</li>
	<li>להכין פתרון מניות תרומבין סאם (1500 NIH יחידה/mg) aliquot כדי 10 µL, פלאש להקפיא LN2 , לשמור ב-80 מעלות צלזיוס. התראה: ללבוש כפפות בעת טיפול תרומבין כמו זה מזיק.</li>
	<li>Aliquot מניות פתרון של 100 x פניצילין-סטרפטומיצין. לשמור ב-20 ° C.</li>
	<li>חותכים עיגולים של ממברנות טפלון (PTFE) (ראה טבלת חומרים) בגודל שמתאים בתוך צלחת תחתית זכוכית. יש לשטוף אותן ב- 70% EtOH ולאחר מכן כניסה בלוק dH2O. Sterilize ויבש תחת זרימה שכבתית עם UV. להשאיר צלחת פטרי סטריליות. שימוש אחד. הערה: PTFE היא קרום נקבובי גמיש זה מאפשר חילוף הגזים ומונעת בינוני מתאדים במהלך ההקלטה לטווח ארוך.</li>
</ol>2. זמן לשגות מיקרוסקופ ההתקנה
הערה: ההגדרה הבאה עבור מיקרוסקופ קונפוקלי סורק הפוכה טנדם (ראה טבלת חומרים) מצויד עם סורק תהודה (8,000 Hz). המערכת כוללת גלאי צילום-מכפיל מאוד רגיש, המונע יחד עם סורק תהודה של phototoxicity ו- photobleaching. טמפרטורה ולחות מבוקרות בתוך תא סביבתיים מיקרוסקופ זה (ראה טבלת חומרים) מכסה את רוב המיקרוסקופ.
<ol><li>במקום חדר לחות הבמה-העליון.</li>
	<li>הפעל את בקרי טמפרטורה ולחות כדי equilibrate את התא מיקרוסקופ כדי 25 ° C ו- 80% לחות.</li>
	<li>ביצוע ניסויים בחשכה קבוע (DD), מכסה תא סביבתיים מיקרוסקופ בד אטום (אלא אם כן התא מיקרוסקופ מורכב של חומר אטום).</li>
	<li>אם משתמש מטרה טבילה במים, מיקום מתקן מיקרו טבילה מים מעל המטרה, תוכנית פרוטוקול עם התוכנה Autoimmersion המטרה בקר כדי לוותר על מים בקצב קבוע במהלך דימות זמן לשגות. הערה: טבילה במי מטרות יחד עם מתקן מים או עדשה אובייקטיבית יבשה של מומלצים עבור הדמיה חיים לטווח ארוך, כמו סוג אחר של טבילה בינוני להתייבש.</li>
	<li>במקום בעל פטרי על הבמה, בתוך תא לחות.</li>
	<li>להפעיל את התוכנה מיקרוסקופ ובחר את מצב סורק תהודה מתוך תיבת דיאלוג הראשון. בחר ב'אישור ' כדי לאתחל את הבמה כאשר תתבקש לעשות זאת. לכי אל הכרטיסיה ' תצורה ' תצורת החומרה כדי לעבור על הקווים הרלוונטיים לייזר.</li>
	<li>לעבור ללשונית ידרשו לחלונית XY בחר מצב דו-כיווני ולהגדיר את התמונה רכישה פרמטרים. הערה: מתואר הדמיה ההגדרה המובאת כאן (איור 2, איור 3 וסרט 1) ממוטבת להתבונן ביטוי היממה של עיתונאים פלורסנט ספציפיים. הפרמטרים הבאים נבחרו מיטבית שלנו מפרט: 40 X מים טבילה אובייקטיבי, X 8 קו ממוצע עם רזולוציית התמונה × 512 512. עבור הדמיה ססגוניות, ייבוא תמונות רציפים נדרש כאשר אורך הגל פליטה של fluorophore אחד, אורך הגל עירור חפיפה אחר (כאן, אורכי הגל של החלבון הניאון צהוב (YFP) פליטה ו עגבניות עירור חפיפה). לבחור את מצב סדרתית "בין מחסנית" הוא הכי מהיר, התנועה של נוירונים השעון היא זניחה במהלך רכישת Z-במחסנית. מיקרוסקופ הגדרות צריכות להיות להתאים בהתאם מטרת ניסוי.</li>
</ol>3. התקנה של המוח זחל Explant תרבות
הערה: כל התהליך מן דיסקציה להטבעת של המוח explants לוקח ~ 30 דקות.
<ol><li>
הכנת ריאגנטים ברדס תרבות.
	<ol>
<li>להפשיר את aliquot של תרומבין ולשמור בטמפרטורת החדר עד השלב ההטבעה (שלב 3.3). שימוש אחד.</li>
		<li>הפשרת במהירות של aliquot של סאם ב 37 מעלות צלזיוס ולשמור בקירור לשימוש בודד.</li>
		<li>הוסף סם aliquot 10 מ ג של פיברינוגן כדי 10 מ"ג/מ"ל, קפיצי בעדינות ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות, במהלך השלב ההטבעה (שלב 3.3). שימוש אחד. הערה: לא דגירה של פיברינוגן פתרון יותר 2 h שזה יתחיל פולימריזציה.</li>
		<li>להפשיר aliquot של x 100 מניות פניצילין-סטרפטומיצין. להכין 2.5 מ של סם המכיל 1 x פניצילין-סטרפטומיצין (סאם/אנטיביוטיקה). לשמור בטמפרטורת החדר. הערה: חנות הנותרים x 100 מניות פניצילין-סטרפטומיצין ב 4 ° C עד חודש.</li>
		<li>להכין את aliquot של 500 µL מסם הנותרים. לשמור על הקרח.</li>
		<li>עבור הדמיה לטווח ארוך, למרוח משחה ואקום בלוק לחלק התחתון של המנה התחתון זכוכית (איור 1 א') פלסטיק ולחטא תחת זרימה שכבתית עם UV.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
דיסקציה של חוט עצבי במערכת העצבים המרכזית ו הגחוני /.
	<ol>
<li>לנקות את המלקחיים ו- 2 x כלי חיתוך הזכוכית שלוש-. טוב עם 70% EtOH. יוצקים µL 400 של DSS לתוך בארות 4 ו- 400 µL של סאם היטב אחד. לשמור על הקרח.</li>
		<li>לקצוץ לטוס בינוני המכיל הזחלים ולבחור שאינם נודדים השלישית לחלל הזחלים (L3) עם מלקחיים. לשטוף אותם במרוכז בבארות 2 מלא DSS. שמור אותם הבאר השלישית DSS מלא בקרח זה anesthetizes את הזחלים. הערה: L3 נמשכת כ 2 ימים ב- 25 ° C. להתבונן המוח בתוך פרק זמן רלוונטי מבחינה פיזיולוגית בחרנו להשתמש שאינם נודדים הזחלים L3. קבוצות אחרות של השעון הנוירונים, כגון l-LNvs, DN3s, מתחילים להיווצר על נדודים L3 הבמה אבל הם לא בהכרח רכיבה על אופניים עדיין (נתונים לא מוצג). לכן, למרות שפעולה זו אפשרית על תמונת אופניים שעון נוירונים בשלב זה (נתונים לא מוצג), חשוב להבחין היטב הנוירונים פונקציונלי כבר שעון זחל מלפתח אלה לניתוח נתונים. Non-נודד L3 מופיעים כ- 4-4.5 ימים לאחר ביצה הנחת ב 25 º C. כדי להשתמש בפרוטוקול זה ללימוד השעון הביולוגי, לסנכרן (entrain) הרימות מתפתחות ב 12 h/12 h LD מחזורי 25 ° c 3 ימים לפני איסוף L3 הזחלים.</li>
		<li>לנתח את המוח זחל עם מלקחיים בסדר בתוך הבאר 4 מלא DSS, אשר לא נעשה שימוש עבור שטיפה הזחלים, באמצעות שיטה הפוכה27.<ol>
<li>בקצרה, לחתוך הזחל לשתיים, ברכות לצבוט את הווים הפה עם זוג מלקחיים, סכם מבפנים ומבחוץ הקיר הגוף באמצעות זוג מלקחיים, ובכך חושף בפני המוח אחרים. חינם המוח על ידי חיתוך כל קנה הנשימה ואת העצבים לצרף אותו לשאר חלקי הגוף.</li>
			<li>תשאף המוח ב- 3 µL של DSS עם פיפטה 20 µL (מראש שטפה עם DSS), לוותר על הבאר מלא סם. חזור על התהליך עבור המוח עד 7. הערה: ניתוח צריכה להתבצע על משטח קר לשמור את הזחלים ומורדמת והמוח מקורר. לדוגמה, במקום המנה לנתיחה על בלוק קירור מחוברת משאבה לזרום מים מקורר-קרח. דיסקציה ההליך לוקח ~ 30 הוא לכל המוח. חשוב לשמור את הדיסקים דמותי העין/antennal המצורפת את המוח ואת חוט עצבי הגחון ללא פגע. קורעת את החלקים הבאים נזק למוח, להפחית את האיכות של התרבות. כמו כן, למנוע חשיפת המוח לאוויר. לפני כ רפה בעברית המוח הראשון, פיפטה למעלה ולמטה DSS המכילים חלקים של הזחלים גזור, כפי שהוא מונע את השכל נצמדים לקיר של הקצה.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הטבעה של המוח explants במטריצה תלת-ממד, הרכבה (~ 20 דקות).
	<ol>
<li>להטביע מוח ביתור הפתרון עובד פיברינוגן (פיברינוגן הריכוז הסופי ~3.3 מ"ג/מ"ל, µL 10.5 לכל המוח) כדלקמן:</li>
		<li>האחות µL 3.5 של סאם/אנטיביוטיקה (עם עושה שימוש בסעיף 3.2.3). האחות מוח גזור מן הקרע היטב לתוך קצה פיפטה אותו בלי dispensing המדיום סאם/אנטיביוטיקה בקצה.</li>
		<li>לוותר על המוח ועל המדיום על המכסה של צלחת פטרי סטריליות. מוסיפים עוד 3.5 µL של סאם/אנטיביוטיקה µL 3.5 של פיברינוגן חמים/סאם 10 מ"ג/מ"ל פתרון על המסירה המכיל את המוח. לערבב בעדינות את הפתרון סביב המוח על ידי pipetting עם טיפ פיפטה 20 µL. הערה: באמצעות פיפטה ולא מלקחיים בשלב זה מונע והדגיש את המוח.</li>
		<li>לקחת 2 µL של הפתרון עובד פיברינוגן מהמסירה ולהחיל אותו על coverslip של המנה התחתון זכוכית בצורת מעגל קטן. מוסיפים µL 0.8 של תרומבין ומערבבים מהר מאוד עם טיפ פיפטה. פיברינוגן מומר פיברין, יתחיל פולימריזציה.</li>
		<li>לקחת את המוח יושב של פיברינוגן עובד פתרון (שלב 3.3.1) בין זוג מלקחיים ומקם אותה על המטריקס פעם מטריצה לבן של פיברין הוא גלוי. אוריינט אל הצד הקדמי של המוח למטה (עבור הדמיה שעון נוירונים). לדחוף למטה קרוב ככל האפשר אל הזכוכית המכסה. Clot פיברין מורכב שכבות של פיברין. בחר שכבה אחת ומקפלים אותו מעל המוח בתנועות עדינות וקטנות ללא ניתוק של המטריקס.<ol>
<li>חזור על פי 2 עד פי 3 מחלקים שונים של קריש הדם כדי לייצב את המוח. הערה: בעת טיפול המוח עם מלקחיים, יש להיזהר לא לייבש אותו או לכפות אותו הלחץ הפיזי.</li>
		</ol>
</li>
		<li>הוסף 20 µL של סאם/אנטיביוטיקה על המוח מוטבע כדי להפסיק את הפעולה של תרומבין.</li>
		<li>חזור על הפעולות כדי לטעון את השכל הנותרים. . זה ניתן להטביע עד 5 עד 6 המוח על צלחת תחתית זכוכית.</li>
		<li>הדמיה חיה לטווח ארוך, הוסיפו 600 µL של סאם/אנטיביוטיקה בבאר הפנימי (החלק זכוכית). מקם חתוכות מראש PTFE קרום על גבי המדיום ולתקוע אותו לגריז ואקום חלה על חלק הפלסטיק התחתון (3.1.5) (איור 1 א').</li>
		<li>עבור מבחני תרופתי, למלא קערה עם 2 מ"ל של סאם/אנטיביוטיקה (איור 1B). הערה: חשוב מאוד למנוע אידוי של המדיום, osmolality של המדיום הוא קריטי הכדאיות של נוירונים. לכן, לניסויים הדמיה לטווח ארוך, יש צורך לאטום את המנה תרבות עם PTFE קרום. ואילו לניסויים לטווח קצר, איטום ממברנה אינה נדרשת עוד המנה הוא מלא עם 2 מ"ל של מדיום, בפיקוח תא humidified.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ייבוא תמונות בצילום מואץ
<ol><li>הצב את הצלחת התחתונה זכוכית בקופסת פטרי תא לחות הבמה-העליון.</li>
	<li>עבור z-מחסנית לוח בכרטיסיה ידרשו ולהגדיר את השלבים z-סעיף מתוך התוכנה מיקרוסקופ (2 מיקרומטר × ~ 40 בניסויים שמוצג באיור 2 , איור 3ו 1 סרט). לקבוע את תחילת z-מחסנית המטוס המרוחק ביותר את coverslip ואת הקצה על פני השטח של explant המוח, קרוב coverslip. למרות המוח תנועות הם זניחים, להוסיף תוספת z-סעיפים ההתחלה ואת הסוף של הערימה-z.</li>
	<li>ללכת לסמן ומצא ייבוא תמונות במקומות מרובים בחלונית והתקנה. עם מטרה X 40, 1 האונה במוח יכולה להילכד בתוך תצוגה של שדה</li>
	<li>ללכת xyzt בחירה (z-מחסנית בצילום מואץ) ובחלונית מצב של רכישה. עבור אל לוח זמן רכישה ולהגדיר את הפרמטרים של מרווח זמן ותדירות הזמן המועדף. הערה: לרכוש תמונות בצילום מואץ בתדירות הרצויה. שימו לב כי הדמיה חיים לטווח ארוך (24-72 שעות) עם זמן לשגות מרווח זמן קצר יותר מאשר 2 h נוטה תוצאות בנוירונים אופניים פחות, כנראה משום שהיא מקטינה את הכדאיות של נוירונים. הנפח מרחיב כמו קצב רכישת התמונה עולה, מה שהופך ניתוח נתונים ואחסון מאתגרת יותר.</li>
</ol>5. טיפול תרופתי של המוח Explants עם Short-term לחיות הדמיה
הערה: ההליך הבא מיועד בעיקרו של דבר זהה לזה הדמיה לטווח ארוך אך אינה דורשת PTFE קרום. למנוע חשיפת המוח כדי אור כחול כאשר החומר הכימי מתווסף אל התרבות, המיקרוסקופ יוצב בחדר חשוך עם אור אדום.
<ol><li>עבור אל לוח זמן רכישה ולהגדיר את מרווח הזמן הרצויה ומספר סריקה כדי להשיג את נתוני התוכנית הבסיסית לפני יישום סמים. הפעל סריקה.</li>
	<li>לאחר התוכנית הבסיסית השלמת הסריקה, וכשמרימים את הראש סריקה של המערכת מיקרוסקופ. הסר את המכסה של בקר לחות הבמה-העליון, בזהירות להסיר את המכסה של המנה התחתון זכוכית מבלי להזיזו.</li>
	<li>הסר את הכמות המתאימה של תרבות בינוני במידת הצורך. מוסיפים את הפתרון ניסיוני במדיום ומערבבים, בזהירות, בעדינות רבה, עם פיפטה פסטר סטרילי מבלי לגעת explants את המוח. הערה: עבור יישום אמבט של PDF, השתמש 2 מיקרומטר פתרון PDF מניות (ב 10% דימתיל סולפוקסיד).</li>
	<li>החלף את המכסים את הצלחת התחתונה זכוכית תא לח, ואת הראש הסריקה. אם משתמש, למקם מחדש את הבד אטום שחור סביב התא מיקרוסקופ.</li>
	<li>בדוק אם המוח נמצאים במיקום המקורי שלהן במצב סריקה בשידור חי. התאם במידת הצורך.</li>
	<li>עבור אל לוח זמן רכישה ולהגדיר את מרווח הזמן הרצויה ומספר הסריקה. הפעל סריקה. הערה: כאן בדקנו תמונות בצילום מואץ רכשה כל שעה עבור עד 10 שעות.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sheeba, V., Kaneko, M., Sharma, V. K., Holmes, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+circadian+pacemaker+circuit:+Pas+De+Deux+or+Tarantella?.">The Drosophila circadian pacemaker circuit: Pas De Deux or Tarantella?.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 43 (1), 37-61 (2008).</li><li>Granados-Fuentes, D., Herzog, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clock+shop:+coupled+circadian+oscillators.">The clock shop: coupled circadian oscillators.</a> Exp Neurol. 243, 21-27 (2013).</li><li>Zhang, Y., Emery, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+15+-+Molecular+and+neural+control+of+insects+circadian+rhythms.">Chapter 15 - Molecular and neural control of insects circadian rhythms.</a> Insect molecular biology and biochemistry. , 513-551 (2012).</li><li>Hardin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+analysis+of+circadian+timekeeping+in+Drosophila.">Molecular genetic analysis of circadian timekeeping in Drosophila.</a> Adv Genet. 74, 141-173 (2011).</li><li>Yoshii, T., Rieger, D., Helfrich-Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+clocks+in+the+brain:+an+update+of+the+morning+and+evening+oscillator+model+in+Drosophila.">Two clocks in the brain: an update of the morning and evening oscillator model in Drosophila.</a> Prog Brain Res. 199, 59-82 (2012).</li><li>Malpel, S., Klarsfeld, A., Rouyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+synchronization+and+rhythmicity+in+larval+photoperception-defective+mutants+of+Drosophila.">Circadian synchronization and rhythmicity in larval photoperception-defective mutants of Drosophila.</a> J Biol Rhythms. 19 (1), 10-21 (2004).</li><li>Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+pacemaker+neurons+transmit+and+modulate+visual+information+to+control+a+rapid+behavioral+response.">Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response.</a> Neuron. 45 (2), 293-300 (2005).</li><li>Sabado, V., Vienne, L., Nunes, J. M., Rosbash, M., Nagoshi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+circadian+imaging+reveals+a+PDF-dependent+transcriptional+regulation+of+the+Drosophila+molecular+clock.">Fluorescence circadian imaging reveals a PDF-dependent transcriptional regulation of the Drosophila molecular clock.</a> Sci Rep. 7, 41560 (2017).</li><li>Hyun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+GPCR+Han+is+a+receptor+for+the+circadian+clock+neuropeptide+PDF.">Drosophila GPCR Han is a receptor for the circadian clock neuropeptide PDF.</a> Neuron. 48 (2), 267-278 (2005).</li><li>Lear, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+G+protein-coupled+receptor,+groom-of-PDF,+is+required+for+PDF+neuron+action+in+circadian+behavior.">A G protein-coupled receptor, groom-of-PDF, is required for PDF neuron action in circadian behavior.</a> Neuron. 48 (2), 221-227 (2005).</li><li>Mertens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDF+receptor+signaling+in+Drosophila+contributes+to+both+circadian+and+geotactic+behaviors.">PDF receptor signaling in Drosophila contributes to both circadian and geotactic behaviors.</a> Neuron. 48 (2), 213-219 (2005).</li><li>Ayaz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+injury+and+regeneration+in+the+adult+brain+of+Drosophila.">Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila.</a> J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).</li><li>Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+culturing+of+whole,+developing+Drosophila+brains.">Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li><li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1/dynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control.">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Mol Biol Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).</li><li>Zschatzsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+branching+dynamics+by+axon-intrinsic+asymmetries+in+Tyrosine+Kinase+Receptor+signaling.">Regulation of branching dynamics by axon-intrinsic asymmetries in Tyrosine Kinase Receptor signaling.</a> Elife. 3, e01699 (2014).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila.">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (10), 970-977 (2013).</li><li>Januschke, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interphase+microtubule+aster+is+a+determinant+of+asymmetric+division+orientation+in+Drosophila+neuroblasts.">The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts.</a> The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).</li><li>Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+developing+and+adult+Drosophila+brains+and+retinae+for+live+imaging.">Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging.</a> J Vis Exp. (37), (2010).</li><li>Roberts, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+evokes+rapid+circadian+network+oscillator+desynchrony+followed+by+gradual+phase+retuning+of+synchrony.">Light evokes rapid circadian network oscillator desynchrony followed by gradual phase retuning of synchrony.</a> Curr Biol. 25 (7), 858-867 (2015).</li><li>Sehadova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+entrainment+of+Drosophila's+circadian+clock+involves+the+gene+nocte+and+signaling+from+peripheral+sensory+tissues+to+the+brain.">Temperature entrainment of Drosophila's circadian clock involves the gene nocte and signaling from peripheral sensory tissues to the brain.</a> Neuron. 64 (2), 251-266 (2009).</li><li>Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence/luminescence+circadian+imaging+of+complex+tissues+at+single-cell+resolution.">Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution.</a> J Biol Rhythms. 25 (3), 228-232 (2010).</li><li>Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronous+Drosophila+circadian+pacemakers+display+nonsynchronous+Ca(2)(+)+rhythms+in+vivo.">Synchronous Drosophila circadian pacemakers display nonsynchronous Ca(2)(+) rhythms in vivo.</a> Science. 351 (6276), 976-981 (2016).</li><li>Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Series+of+Suppressive+Signals+within+the+Drosophila+Circadian+Neural+Circuit+Generates+Sequential+Daily+Outputs.">A Series of Suppressive Signals within the Drosophila Circadian Neural Circuit Generates Sequential Daily Outputs.</a> Neuron. , (2017).</li><li>Kuppers-Munther, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+culturing+strategy+optimises+Drosophila+primary+cell+cultures+for+structural+and+functional+analyses.">A new culturing strategy optimises Drosophila primary cell cultures for structural and functional analyses.</a> Dev Biol. 269 (2), 459-478 (2004).</li><li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Larval+Drosophila+Eye-Antennal+Discs+in+Vitro.">Differentiation of Larval Drosophila Eye-Antennal Discs in Vitro.</a> J Exp Zool. 156, 91-103 (1964).</li><li>Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+mushroom+body+Kenyon+cells+generate+spontaneous+calcium+transients+mediated+by+PLTX-sensitive+calcium+channels.">Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels.</a> J Neurophysiol. 94 (1), 491-500 (2005).</li><li>Hafer, N., Schedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+larval+CNS+in+Drosophila+melanogaster.">Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster.</a> J Vis Exp. (1), e85 (2006).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Rabinovich, D., Mayseless, O., Schuldiner, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+ex+vivo+culturing+of+Drosophila+brain+as+a+method+to+live+image+pupal+brains:+insights+into+the+cellular+mechanisms+of+neuronal+remodeling.">Long term ex vivo culturing of Drosophila brain as a method to live image pupal brains: insights into the cellular mechanisms of neuronal remodeling.</a> Front Cell Neurosci. 9, 327 (2015).</li><li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+clots+keep+non-adhering+living+cells+in+place+on+glass+for+perfusion+or+fixation.">Fibrin clots keep non-adhering living cells in place on glass for perfusion or fixation.</a> Cell Biol Int. 29 (9), 721-730 (2005).</li><li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochalasin+D+and+latrunculin+affect+chromosome+behaviour+during+meiosis+in+crane-fly+spermatocytes.">Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes.</a> Chromosome Res. 6 (7), 533-549 (1998).</li><li>Lukinavi&#269;ius, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SiR-Hoechst+is+a+far-red+DNA+stain+for+live-cell+nanoscopy.">SiR-Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy.</a> Nature Communications. 6, 8497 (2015).</li><li>Medioni, C., Ephrussi, A., Besse, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+axonal+transport+in+Drosophila+pupal+brain+explants.">Live imaging of axonal transport in Drosophila pupal brain explants.</a> Nat Protoc. 10 (4), 574-584 (2015).</li><li>Enoki, R., Ono, D., Hasan, M. T., Honma, S., Honma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+resolution+fluorescence+imaging+of+circadian+rhythms+detected+with+a+Nipkow+spinning+disk+confocal+system.">Single-cell resolution fluorescence imaging of circadian rhythms detected with a Nipkow spinning disk confocal system.</a> J Neurosci Methods. 207 (1), 72-79 (2012).</li><li>Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodial+dynamics+and+growth+cone+stabilization+in+Drosophila+visual+circuit+development.">Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+functional+neuronal+connectivity+in+the+Drosophila+brain.">Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain.</a> J Neurophysiol. 108 (2), 684-696 (2012).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

כאן אנחנו תיאר את שיטת עבור קרינה פלואורסצנטית לטווח ארוך זמן לשגות מיקרוסקופ של המוח זחל בתרבית. ההצלחה של ניסויים מסוג זה תלויה גורמים רבים, כגון הבריאות של התרבות, שיטת הנייח של המוח explant, עוצמת קרינה פלואורסצנטית יחס אות לרעש של הכתב, הזמני, רזולוציה מרחבית, ו נגישות explant. גורמים אלה יכולים להיות קשורים זה לזה. לדוגמה, זמן לשגות בתדירות הולכת וגוברת משפיעה על הבריאות של התרבות, הנייח של explant המוח עלול לעכב חילוף הגזים. לפיכך, מציאת מדיום שמחה (לא משחק מלים המיועד) על התופעות שנבחנה היא המפתח פרוטוקול מוצלח. השיטה המתוארת כאן ממוטבת כדי לנטר את הביטוי של פלורסנט עיתונאים היממה ב היקף שעות עד ימים. הוא גם החל ללמוד מקצועות דרוזופילה גמור כל עוד תהליכים קריטיים מסקרן ובוצע בזהירות.
ב פרוטוקול זה, explants המוח הם מרותק למיטה בטיפול קריש פיברין, אשר יוצר מטריצה תלת-ממד. למרות שיטות נוספות הנייח קיימים, כגון פולי-ליזין או ציפוי laminin של הזכוכית המכסה, אלה להאט התפתחות המוח זחל29 ובכך עשוי לסכן את החוסן פיזיולוגיים שלהם. במהותה, פיברין מספק של מטריקס מעולה רחבים מספיק כדי לאפשר מזינים להגיע explant את המוח ולא מספיק דביק על המוח להיות קרובים הזכוכית המכסה בלי מועך אותו16. בשל יתרונות אלו, שיטת קריש פיברין ננקטה פרוטוקולים שונים עבור תרבית תאים, המוח explant תרבות14,17,29,30,31,32 33, ,34. אנו ממליצים להשתמש מטריצה תלת-ממד פיברין לתרבות המוח זחל אפילו לניסויים לטווח קצר יחסית מעמד יותר מכמה שעות. המוח זחל תרבות ללא מטריצה תלת-ממד נותן תוצאות בלתי צפויות (נתונים לא מוצג), כנראה עקב חוסר תמיכה פיזיות נדרש לפתח את המוח.
חשוב להתבונן בזהירות את המורפולוגיה של explant ואת התאים ברקמה לפני ובמהלך זמן לשגות הדמיה לזהות סימנים של מצוקה. בניסויים המובאת כאן, ביטוי של mCD8::YFP קרום מכורך הראה מורפולוגיה תקין של הנוירונים, לכל-TDT זוהה הציטופלסמה ואת הגרעין כצפוי, המציין כי explant המוח נותר קיימא ובריא לאורך כל משך הזמן של הדמיה. Rhythmicity היממה נחקר במשך עד 72 שעות אך נצפו explants המוח יכול להיות תרבותי עד 5 ימים ללא מתדרדר את השלמות של הנוירונים במוח (נתונים לא מוצג). אם neurites להיות דוטי או לגוף התא של הנוירונים פרץ, אלה בדרך כלל סימנים של phototoxicity, למנוע בקלות על ידי התאמת הגדרות מיקרוסקופ בהתאם. לדוגמה, נסה להפחית את עוצמת הלייזר תוך הגדלת גודל חריר, החלון של זיהוי ורווח חכם. אולם, באופן כללי, עוצמת קרינה פלואורסצנטית הכתב היא הגורם המגביל של קבלת תמונות של יחס אות לרעש טוב ללא תאורה לייזר בעוצמה גבוהה. לכן, העיצוב של הכתב, מבחר של fluorophore, ואת המספר עותק של הכתב הן הדבר הראשון שיש לקחת בחשבון בעת פתרון בעיות הקיום. (בהניסוי המוצג כאן, 4 עותקים של כתב לכל-tdt שימשו.)
סימנים אחרים של תרבות המוח פרוץ כוללים פרץ זה של הכדור במהלך דימות זמן לשגות, תנועה של נוזל מתוך explant המוח. . זה כנראה עקב מיקרו-דקירות שנגרם במהלך ניתוח של המוח. הסרת דמותי הדיסקים המחוברים למוח הזחל הוא המקור העיקרי של דקירות, ובכך אנו מייעצים נגד זה.
היתרון של הדמיה חיה היממה זריחה מעל ביולומינסנציה הדמיה הוא שהרזולוציה המרחבית גבוהה. בנוסף, להקל על שימוש סמנים הסלולר יחד עם הכתבת קצב מקלה על הניתוח היחודיות סוג התא. לעומת זאת, ביולומינסנציה יש רזולוציה טמפורלית מעולה, יחס אות לרעש מעולה19,20,21. ובכל זאת, הכולל מספר הנוירונים אופניים לכל המוח עם תמונה מאת ביולומינסנציה הוא לא מעולה לעומת המספר שהושג עם שלנו השיטה8,19,21. ברוב המקרים, מקצבי הכתבים פלורסנט מזוהה עם השיטה שלנו מסונכרנים בתוך האשכול זהה של נוירונים השעון (ראה איור 2C), כפי שמוצג עם ביולומינסנציה19. שלב ההבדלים בין שעון נוירון אשכולות נצפו פלורסצנטיות והן היממה ביולומינסנציה ממוחשב הדמיה8,19,21. לכן, מתודולוגיות תקפות באותה מידה להתבונן מקצבים השעון הביולוגי במוח תרבותי וגם הבחירה בין florescence לבין ביולומינסנציה צריכה להיעשות על פי מטרת המחקר.
הקושי הטכני העיקרי של שיטה זו הוא שלב ההטבעה. כי הפרוטוקול מצריך הדמיה קונפוקלי סורק מהיר עם מיקרוסקופ הפוכה, פיזור אור בתוך רקמת המוח מפחית את זיהוי קרינה פלואורסצנטית במיוחד כאשר הדמיה עמוק בתוך רקמת המוח explants צריך להיות מותקן הכי קרוב אפשרי הזכוכית המכסה. יתר על כן, הפארמצבטית של תוצאות הדמיה תלויה בעקביות של z-העמדות של נוירונים של אינטרסים. לכן, חשוב אוריינט והר המוח תמיד באותה דרך, אשר דורש תרגול. לשיקוף עצביים אשכולות ממוקם עמדות שונות מבחינה אנטומית, זה ייתכן שתידרש להפעיל ניסויים נפרדים עם אוריינטציה explant מוח שונים. ישנם שיטות אלטרנטיביות עבור הדמיה חיה רקמות עמוק שאינם מצריכים culturing הרקמה, כגון על ידי מיקרוסקופ שני הפוטונים מיקרוסקופ אור גיליון. האחרון בהצלחה שימש דיינמיקס סידן היממה תמונה חיה דרוזופילה המוח22,23. אולם, מיקרוסקופ אור גיליון יש רזולוציה מרחבית נמוכה יותר מאשר מיקרוסקופיה קונפוקלית, ובכך ליישומו הדימות ברזולוציה תא בודד נותר אתגר.
לסיכום, פרוטוקול זה משלב מערכת פשוטה תרבות של המוח זחל explants בתנאים התומכים ייבוא תמונות בצילום מואץ של עיתונאים פלורסנט בימים וניתוח כמותי של מקצבים ביולוגיים. אמנם יש מגבלות מסוימות כמתואר לעיל, המתודולוגיה ניתן להיות מותאמת תמונת כתבים שונים במוח דרוזופילה זחל, למבוגרים, לשינוי נוסף כדי להגדיל את הרגישות והרזולוציה המרחבית. לדוגמה, עצב תחזיות הממוקם עמוק בתוך המוח או תחבורה vesicular לזיהוי על ידי שילוב הטכניקה התרבות שלנו המוח explant עם מיקרוסקופ שני הפוטונים35. נאמר, שזה עדיין אפשרי לבצע הדמיה חיה של organelles כגון המיטוכונדריה במוח למבוגרים explants באמצעות פרוטוקול זה (נתונים לא מוצג). גם הצגנו את הווריאציה של פרוטוקול זה עבור אמבט יישום של פתרון נסיוני מבחני תרופתי. אחד יכול להרחיב את פרוטוקול זה ביצוע ניסויים "דופק. צ'ייס" באופן ידני מחליף המדיום תרבות לשטוף את התרופה או באמצעות זלוף קאמרית18,36.

שעונים היממה לעזור אורגניזמים להסתגל לשינויים סביבתיים תקופתיים שנוצר על ידי 24 שעות הסיבוב של כדור הארץ. לולאות משוב תעתיק translational בזו ביסוד נפוץ המנגנון המולקולרי של היממה שעונים על פני מינים1. המעגל היממה קוצב הלב מורכב המכיל שעון נוירונים משלב זמן-של-יום המידע הנמסר על ידי רמזים סביבתיים, כגון/כהה (LD) ומחזורי טמפרטורה, שיתכנן את מקצבי שפע של יומי פיזיולוגיים, תהליכים התנהגותיים2,3. התיאום של מקצבים מולקולרית עם עצביים התשומות והתפוקות חשובה קריטית עבור הפעולה של מעגל היממה אך שרידים הבין באופן חלקי בלבד.
דרוזופילה, בליבה של השעון המולקולרי, heterodimer מחזור/שעון (CLK/CYC) מפעיל שעתוק של התקופה (לאדם), נצחית (tim). לכל וטים יוצרים קומפלקס והזן את הגרעין, שבו הם לעכב פעילות גנים ברמת השעתוק של CLK/CYC וכתוצאה מכך שעתוק משלהם. Post-transcriptional ו- post-translational לגרום לעיכובים שעתוק CLK/CYC-מתווכת בין דיכוי על ידי לכל / טים, המבטיח את הדור של בערך 24 שעות ביממה תנודות מולקולרית1,3,4 . נוירונים כ-150 המכיל טופס אלה שעונים מולקולרית מעגל הבקרה להתנהגות היממה של מבוגר טסה5. כמה פשוטים אך פונקציונליים לחלוטין היממה מעגל חשמלי המורכב 3 קבוצות של נוירונים שעון - 5 נוירונים לרוחב הגחון (LNvs; 4 LNvs PDF-חיובי, LNv PDF-שלילי אחד, ראה להלן), 2 1s נוירון הגבי (DN1s) ו- 2 2s נוירון הגבי (DN2s) - נמצא הזחל המוח6,7.
המעגל פשוט היממה זחל מציע מודל מצויין ללמוד את האינטראקציות בין תקשורת בין-עצביים של שעון מולקולרי. באמצעות הכתבת פלורסנט פיתח לכל-TDT, אשר מחקה את הרמות לכל חלבון ומיקומו subcellular, חיפשנו לאפיין את הדינמיקה של המכני מולקולרית ב שעון שונות תת-קבוצות נוירון במעגל היממה זחל 8. יתר על כן, לדעת תפקיד מפתח של neuropeptide פיזור פיגמנט הגורם (PDF) המיוצר על ידי LNvs 4 בוויסות מקצבים השעון הביולוגי-ברמה העצבית9,10,11, רצינו לבדוק הישירות השפעת PDF על השעונים מולקולרית. לשם כך, פיתחנו שיטה כדי לפקח על ביטוי גנים היממה מקצבים במוח זחל explant על פני ימים מרובים על-ידי קונפוקלית זמן לשגות. הפרוטוקול הותאמה גם עבור מבחני תרופתי לבחון את ההשפעה של PDF או תרכובות אחרות ברמה של פי-TDT. לפיכך, ההסתגלות מורכב לנגישים התרבות explant המוח ליישום סמים, הגדלת רזולוציה טמפורלית, הדמיה עבור משך קצר יותר.
Ex-vivo תרבות של דרוזופילה מוחותיהם של שלבים התפתחותיים שונים היו שנקבעו קודם12,13,14,15,16,17 ,18. והואיל פרוטוקולים אלה שימשו הדמיה תופעות ביולוגיות שונות, חלקם אינם תואמים דימות ברזולוציה תא בודד או אינם תומכים התרבות יותר מאשר מספר שעות. שיטות אלטרנטיביות לביצוע הדמיה חיים לטווח ארוך של היממה נוירונים בדרוזופילה כוללים ביולומינסנציה הדמיה מולקולרית מקצבים19,20,21 קרינה פלואורסצנטית הדמיה של מחוון סידן עם22,של מיקרוסקופ אור גיליון23. למרות ביולומינסנציה הדמיה ניתן להשיג רזולוציה טמפורלית גבוהה יותר, מיקרוסקופ אור גיליון ניתן להתאמה עבור הדמיה ויוו , הם מוגבלים על הרזולוציה המרחבית, דורשים מערכות מיקרוסקופים מיוחדים.
השיטה המתוארת כאן המותאמים באופן חזותי אותות פלואורסצנט בתרבות כל המוח ברזולוציה תא בודד על פני ימים מרובים. שיטה זו נתיישב ופסיביות יכול להיות מותאם כדי התמונה תרבותי המוח לטוס למבוגרים ו לניסויים תרופתי ללמוד הרבה בעיות שונות מצאו דרוזופילה .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td>I am not sure they are exactly the same ones we have in the lab. I chose &#34;suitable for insect cell culture&#34; whenever available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+) Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0516-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIS-TRIS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(&#8722;)-Malic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Trehalose dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fumaric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Ketoglutaric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screened</td>
			<td>BioConcept Ltd. Amimed</td>
			<td>2-01F30-I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES-KOH, pH 7.4</td>
			<td>E&#38;K Scientific Products</td>
			<td>EK-654011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen from bovine plasma</td>
			<td>Calbiochem (Merck)</td>
			<td>341573-1GM</td>
			<td>CAUTION: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Manipulate under laminar flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9549</td>
			<td>CAUTION: Health Hazard, use gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH</td>
			<td>Chi Scientific</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes</td>
			<td>fisherscientific</td>
			<td>08-772A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 &#956;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPS05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene (PTFE) film</td>
			<td>Dupont</td>
			<td>200A Teflon FEP Film</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45&#160;&#181;m, PVDF, 33&#160;mm, gamma sterilized</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22&#160;&#181;m, PVDF, 33&#160;mm, gamma sterilized</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-well glass dissection dish</td>
			<td>Any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps, size 5, Dumont</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectors</td>
			<td>Leica microsystem CMS GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature control chamber</td>
			<td>Life Imaging Services</td>
			<td>The CUBE &#38; BOX temperature control system, custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage-top humidity controller</td>
			<td>Life Imaging Services</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller software</td>
			<td>Leica microsystem CMS GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUM-stack creation and 3D correction drift plugin</td>
			<td>ImageJ software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x iterative deconvolution</td>
			<td>AutoQuant and Imaris software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell resolution fluorescence live imaging of drosophila circadian clocks in larval brain culture

המעגל קוצב לב היממה האחראית פלטי פיזיולוגיים ורגשיים קצבית מתואמת עם רמזים סביבתיים, כגון מחזורי יום/לילה. השעון המולקולרי בתוך כל נוירון קוצב לב יוצר השעון הביולוגי בביטוי גנים, אשר מושתתות הפונקציות עצביים קצבית חיוני לפעולה של המעגל. חקירת המאפיינים של הפרט מולקולרית של מחלקות שונות של קוצב לב נוירונים ודן האינטראקציה שלהם עם אותות עצביים התשואות הבנה טובה יותר של המעגל היממה קוצב לב. כאן, אנו מציגים בגישה מיקרוסקופ פלואורסצנטי זמן לשגות פותח על מנת לנטר את שעון מולקולרי בנוירונים שעון מהמוח זחל דרוזופילה בתרבית. שיטה זו מאפשרת הקלטת הנמשך של חמשת המקצבים של מקודדים גנטית עיתונאים היממה פלורסנט ברזולוציה תא בודד. תוכנית התקנה זו יכול להיות משולב עם מניפולציות תרופתי לנתח באופן הדוק תגובה בזמן אמת של השעון המולקולרי תרכובות שונות. מעבר מקצבים השעון הביולוגי, שיטה זו תכליתי בשילוב עם טכניקות עוצמתיות דרוזופילה גנטי מציעה את האפשרות ללמוד מגוון תהליכים עצביים או המולקולריות ברקמת המוח בשידור חי.

כאן, אנו מראים את התוצאות נציג של ההקלטה לטווח ארוך של עיתונאי פלורסנט היממה ב- ex-vivo המוח זחל תרבות, ואת תוצאות הדמיה בשידור חי של PDF יישום אמבטיה על הכתב ביטוי.
Non-נודדים הזחלים L3 לבטא את שעון מולקולרי כתב לכל-TDT ואת UAS-mCD8::YFP מונע על ידי נהג נוירון שעון Clk (856)-gal4 (איור 1C) היו entrained במוח LD. היו גזור ולהגדיר לתרבות לטווח ארוך במהלך האחרון אור שלב של מחזור LD רגע לפני השלב כהה (איור 1A ו- 2B). הדמיה בצילום מואץ בוצעה ב DD, המוח explants היו עם תמונה כל 2 h עבור 64 h. סכום-מחסנית המכילה נוירון עניין נוצר ולא עוצמת קרינה פלואורסצנטית מרושע של האזור המקביל הנוירון נמדדה לאחר רקע חיסור8. כדי לקבוע rhythmicity של הביטוי העיתונאי, מקסימום אנטרופיה ספקטרלי ניתוח (מסה) והן בדיקה ידנית היו בשימוש8. DN2s שני המציגים את השעון הביולוגי מקצבים עם תקופה של ~ h 26 רמות לכל-TDT מוצגים כאן (איור 2 א, 2 C, וסרט 1).
שימוש בעיקרון באותה תרבות ההתקנה (איור 1B), השפעת neuropeptide PDF על הביטוי של פי-TDT נחקר. המוח של שאינם נודדים הזחלים של גנוטיפ באותה כפי שתוארה לעיל היו גזור גם ב- ZT1 (Zeitgeiber הזמן 1, h 1 לאחר אורות על LD) או ZT13 (1h אחרי האורות). הבקבוקונים המכיל הזחלים היו מיד צונן על הקרח לאחר שהוצאנו החממה. ב ZT13, הבקבוקונים גם היו עטופים נייר אלומיניום כדי להימנע מחשיפה אור כחול. . הקרע המוח בוצעה על קרח, והטרף המוח הוחזקו על קרח. המוח שצולמו ZT13 היו מכוסים ברדיד אלומיניום במידת האפשר. לכן, למרות הליך זה בוצע במעבדה מואר באור טבעי, ההשפעה של חשיפה קלה על חילוף החומרים, סינתזה macromolecular היה מינימלי. המוח נסרקו פעמיים עם מרווח 1 h כדי לקבל את הנתונים של תוכנית בסיסית. PDF או רכב (דימתיל סולפוקסיד) נוספה המדיום תרבות, תמונות בצילום מואץ נרכשו בכל 1h לציון עוקבות 6-אייץ פי-TDT פרופיל ביטוי הראו עלייה זמן-של-יום-תלוי בעוצמת זריחה על תוספת PDF ב- ZT13 LNvs, DN1s, וכדי במידה פחותה ב- DN2s (איור 3)8.
תוצאות אלו מצביעות על טכניקת דימות ואת שיטת תרבות המתוארים כאן זמין את ההקלטה של מקצבים לכל-TDT ברזולוציה תא בודד בלי להיסחף phototoxicity, photobleaching או המוקד מורגש.
הערה: נותחו ותמונות מעובד באמצעות פיג'י28. 10 X deconvolution איטרטיבי בוצעה עם AutoQuant ו- Imaris. נשתל מינור של תמונות בצילום מואץ תוקנו עם תוסף להיסחף 3D הנכונה של ImageJ.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57015/57015fig1.jpg"> איור 1: אנטומיה של השעון נוירונים במוח זחל L3 ו המוח explant תרבות ההתקנה. (A ו ב) . השרטוטים של ההתקנה תרבות המוח עבור הדמיה לטווח ארוך (א) ו עבור מבחני תרופתי עם לטווח קצר הדמיה () ב- (א), (צהוב) ואקום גריז הוחל על החלק פלסטיק של המנה התחתון זכוכית לצרף קרום PTFE. (ג) תמונת הנציגה של מוח זחל LD-entrained L3-ZT2. הביטוי של הכתב שעון מולקולרי לכל-TDT (מגנטה) מוצגת ב שעון נוירונים, אשר מסומנים על-ידי UAS-mCD8::YFP(green) מונע על ידי Clk (856)-gal4. ישנן 3 קבוצות של השעון הבדיל נוירונים ב- L3: 5 LNvs (כולל את LNv ה-5, אשר ואינה מבטאת PDF), 2 DN1s, 2 DN2s, המצוין על-ידי ראשי חץ לבן. שימו לב הביטוי של פי-TDT ב הגרעינים של נוירונים שעון. תאים לכל-TDT-חיובי שלילי YFP הם עכשיו, דונלד השני תת-חבורה של נוירונים שעון זה עדיין מתפתח. סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57015/57015fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57015/57015fig2.jpg"> איור 2: נציג תוצאות לטווח ארוך לחיות הדמיה של נוירונים שעון זחל. (א) מוגדל הנוף של DN2s ההדמיה זמן לשגות לטווח ארוך של מוח בתרבית. Explants המוח הוכנו של הזחלים L3 LD-entrained גזור-ZT11. התמונות צולמו כל 2 h מ CT17 (היממה זמן 17, 5 שעות לאחר לכיבוי אורות סובייקטיבית בדמוקרטיה) עבור 64 ח ב DD. ממוזג תמונות של פי-TDT (מגנטה) UAS-mCD8::YFP מונע על ידי Clk (856)-gal4 (ירוק) הם בצד השמאל של כל לוח, לכל-TDT רמות מיוצג heatmap עם הצבע הכחול נמצאים בצד הימין. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. רק לייצוג, תמונות עובדו ועם תיקון 3D הסחף של 10 X deconvolution איטרטיבי. . התזמון של הניסוי (B) . (ג) הגרף המייצג את עוצמת קרינה פלואורסצנטית היחסי מנורמל ב t = 0 של שני DN2s (כחול ואדום). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57015/57015fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57015/57015fig3.jpg"> איור 3: תוצאות נציג הדמיה חיים לניסויים תרופתי. המוח זחל LD-entrained היו גזור, שנטענה ב- ZT1 או ZT13, ו- PDF (2 מיקרומטר) או דימתיל סולפוקסיד הוחלה ZT2 או ZT14. ביטוי לכל-TDT explants המוח נוטרה כל שעה על ידי מיקרוסקופ זמן לשגות. קרינה פלואורסצנטית רשע בעוצמה ± SEM מנורמל לערך בתחילת הדמיה (תואם ל- ZT1 או ZT13) מוצג. חצים אדומים מציינים את הזמן של יישום PDF או רכב (ZT2 או ZT14). * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001 ו * * * p < 0.0001 מאת אנובה דו כיוונית עם התיקון של Sidak להשוואות מרובות. מינימום של 32 LNvs, 18 DN1s ו- 16 DN2s נותחו עבור כל נקודת נתונים. דמות זו שונתה הפניה8. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57015/57015fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57015/57015movie1.jpg"> סרט 1: הדמיה חיים לטווח ארוך של נוירונים שעון DN2 זחל. הסרט בצילום מואץ של המוח זחל בתרבית גזור-ZT11, עם תמונה ב- DD. Magnified נופי DN2s בחצי הכדור יחיד להביע לכל-TDT ו UAS-mCD8::YFP מונע על ידי Clk (856)-gal4 מוצגים. תמונות נרכשו כל 2 h עבור ה 64 לכל-TDT (מגנטה) ו YFP (ירוק) נמצאים משמאל לכל-TDT רמות שמיוצגות על heatmap (צבע כחול) הם בצד הימין. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57015/MAX_10_Pos004_S001_stable_D_crop-combined(Converted).mov" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>צעדים</td>
			<td>ריאגנטים</td>
			<td>ריכוז</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="14">1. מערבבים ריאגנטים.</td>
			<td>2פו ח'4
</td>
			<td>4.18 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>מ מ 1.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td>0.7 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>116 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>0.7 מ"ג/מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>גלוקוז</td>
			<td>2 מ"ג/מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>טרהלוז</td>
			<td>2 מ"ג/מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>חומצה α-Ketoglutaric</td>
			<td>0.35 מ"ג/מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>חומצה פומרית</td>
			<td>60 μg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>חומצה מאלית</td>
			<td>0.6 מ"ג/מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>חומצה סוקסינית</td>
			<td>60 μg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>תמצית שמרים</td>
			<td>2 מ"ג/מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>FCS ללא חום-לא פעיל</td>
			<td>20%</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O, בלוק</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">2. לחטא עם מסנן μm 0.22.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">3. דגירה באינקובטור תרבית תאים 25 ° c בחושך 72 ה חממה יש להיות זיהום חיידקי או פטרייתי.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">4. מוסיפים נוגדנים.</td>
			<td>אינסולין</td>
			<td>2 μg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bis-טריס pH 6.8, לחטא עם מסנן μm 0.22</td>
			<td>5 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>5. להתאים את ה-pH ל 6.8-6.9.</td>
			<td>NaOH (10 N)</td>
			<td>~ 8 טיפות</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">6. לחטא עם מסנן μm 0.22.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">7. aliquot עד 5 מ"ל פלאש להקפיא בחנות LN2 ב-80 מעלות צלזיוס. השתמש תוך 60 ימים.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">
הערה: עבור אמצעי אחסון גדולים, לחטא עם מסנן בקבוק העליון על ידי ואקום, אחרת להשתמש במסנן מזרק. Aliquots פתוחה בשכונה תרבות. שימוש אחד.</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: הכנת סם בינוני (1 x) לתרבות המוח דרוזופילה . בינוני תרבות המוח explant. כל השלבים צריכה להתבצע בשכונה תרבות חוץ הדגירה של המדיום.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>צעדים</td>
			<td>ריאגנטים</td>
			<td>ריכוז</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="8">1. מערבבים ריאגנטים.</td>
			<td>HEPES-קו, pH 7.4</td>
			<td>99 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>1.37 מטר</td>
		</tr>
<tr>
<td>אשלגן כלורי</td>
			<td>54 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>2PO NaH4
</td>
			<td>1.7 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>2פו ח'4
</td>
			<td>2.2 מ"מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>גלוקוז</td>
			<td>33 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>סוכרוז</td>
			<td>438 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>בלוק dH2O</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">2. לחטא עם מסנן μm 0.45.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">3. לאחסן ב 4 ° C עד 6 חודשים.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">
הערה: לשימוש ניסיוני: למהול 1 X עם בלוק dH2O ולחטא עם העליון-בקבוק 0.45 של μm מסנן, על ידי ואקום או עם מסנן מזרק. לשמור על 4 מעלות צלזיוס. פתוח בשכונה תרבות, שימוש מרובים.</td>
		</tr>
</tbody></table>בטבלה 2: הכנת DSS (10 x). תמיסת לנתח את המוח דרוזופילה . להכין בשכונה תרבות.

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture at JoVE.com

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

המטרה של פרוטוקול זה היא ליצור שמחוץ דרוזופילה המוח זחל תרבות בצורה מיטבית כדי לפקח על היממה מולקולרית מקצבים עם הדמיה בצילום מואץ לטווח ארוך של זריחה. היישום של שיטה זו מבחני תרופתי גם נדון.

קרינה פלואורסצנטית תא בודד רזולוציה לחיות הדמיה של שעונים היממה דרוזופילה בתרבות המוח זחל

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

single-cell-resolution-fluorescence-live-imaging-drosophila-circadian

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

7.5K Views.  University of Geneva. המטרה של פרוטוקול זה היא ליצור שמחוץ דרוזופילה המוח זחל תרבות בצורה מיטבית כדי לפקח על היממה מולקולרית מקצבים עם הדמיה בצילום מואץ לטווח ארוך של זריחה. היישום של שיטה זו מבחני תרופתי גם נדון.

Video: Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

High-Resolution Magic Angle Spinning (HRMAS) proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) is a novel non-destructive technique that improves spectral line-widths and allows high-resolution spectra to be obtained from extracts, intact cells, cell cultures, and more importantly intact tissue to investigate relationships between metabolites and cellular processes. In vivo HRMAS 1H-MRS studies have yet to be reported in the live fruit fly Drosophila melanogaster. Drosophila, as a simpler genetic organism, allows the multiple biological functions and various evolutionarily conserved signaling pathways to be examined at the whole organism level and it is a useful model for investigating genetics and physiology. To this end, we developed and implemented an in vivo HRMAS 1H-MRS method to investigate live Drosophila at 14.1 T. Here, we outline an HRMAS 1H-MRS protocol for the molecular characterization of Drosophila with a conventional MR spectrometer equipped with an HRMAS probe. This technique is a novel, in vivo, non-destructive Drosophila metabolite measurement approach, which enables the identification of disease biomarkers and thus may contribute to novel therapeutic development.

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

This technique enables the use of high-resolution magic angle spinning proton MR spectroscopy (HRMAS 1H-MRS) for molecular characterization of live Drosophila melanogaster with a conventional 14.1 tesla spectrometer equipped with an HRMAS probe.

ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית של חיים תסיסנית melanogaster באמצעות ספינינג זווית הקסם

High-Resolution Magic Angle Spinning (HRMAS) proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) is a novel non-destructive technique that improves spectral ...

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

ויזואליזציה של עצבים המגזרי הזחל ב 3 Rd Instar תסיסנית הכנות הזחל

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-תא הדמיה של תאים מבשר חושי האיברים אינטקט תסיסנית גלמים

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are characteristic to neurons in both normal and diseased brain. Towards this, a great deal of effort has been placed on building high-resolution neuroanatomical maps1-3. With the expansion of molecular genetics and advances in light microscopy has come the ability to query not only neuronal morphologies, but also the molecular and cellular makeup of individual neurons and their associated networks4. Major advances in the ability to mark and manipulate neurons through transgenic and gene targeting technologies in the rodent now allow investigators to 'program' neuronal subsets at will5-6. Arguably, one of the most influential contributions to contemporary neuroscience has been the discovery and cloning of genes encoding fluorescent proteins (FPs) in marine invertebrates7-8, alongside their subsequent engineering to yield an ever-expanding toolbox of vital reporters9. Exploiting cell type-specific promoter activity to drive targeted FP expression in discrete neuronal populations now affords neuroanatomical investigation with genetic precision.
Engineering FP expression in neurons has vastly improved our understanding of brain structure and function. However, imaging individual neurons and their associated networks in deep brain tissues, or in three dimensions, has remained a challenge. Due to high lipid content, nervous tissue is rather opaque and exhibits auto fluorescence. These inherent biophysical properties make it difficult to visualize and image fluorescently labelled neurons at high resolution using standard epifluorescent or confocal microscopy beyond depths of tens of microns. To circumvent this challenge investigators often employ serial thin-section imaging and reconstruction methods10, or 2-photon laser scanning microscopy11. Current drawbacks to these approaches are the associated labor-intensive tissue preparation, or cost-prohibitive instrumentation respectively.
Here, we present a relatively rapid and simple method to visualize fluorescently labelled cells in fixed semi-thick mouse brain slices by optical clearing and imaging. In the attached protocol we describe the methods of: 1) fixing brain tissue in situ via intracardial perfusion, 2) dissection and removal of whole brain, 3) stationary brain embedding in agarose, 4) precision semi-thick slice preparation using new vibratome instrumentation, 5) clearing brain tissue through a glycerol gradient, and 6) mounting on glass slides for light microscopy and z-stack reconstruction (Figure 1).
For preparing brain slices we implemented a relatively new piece of instrumentation called the 'Compresstome' VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). This instrument is a semi-automated microtome equipped with a motorized advance and blade vibration system with features similar in function to other vibratomes. Unlike other vibratomes, the tissue to be sliced is mounted in an agarose plug within a stainless steel cylinder. The tissue is extruded at desired thicknesses from the cylinder, and cut by the forward advancing vibrating blade. The agarose plug/cylinder system allows for reproducible tissue mounting, alignment, and precision cutting. In our hands, the 'Compresstome' yields high quality tissue slices for electrophysiology, immunohistochemistry, and direct fixed-tissue mounting and imaging. Combined with optical clearing, here we demonstrate the preparation of semi-thick fixed brain slices for high-resolution fluorescent imaging.

Here we describe a rapid and simple method to image fluorescently labeled cells in semi-thick brain slices. By fixing, slicing, and optically clearing brain tissue we describe how standard epifluorescent or confocal imaging can be used to visualize individual cells and neuronal networks within intact nervous tissue.

גישה מהירה הדמיה ברזולוציה גבוהה הקרינה חצי עבה פרוסות המוח

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic development and axonal wiring. Recently the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system (PNS) have become powerful genetic models in which to elucidate both general and class-specific mechanisms of neuron differentiation.
There are four main DA neuron classes (I-IV)1. They are named in order of increasing dendrite arbor complexity, and have class-specific differences in the genetic control of their differentiation2-10. The DA sensory system is a practical model to investigate the molecular mechanisms behind the control of dendritic morphology11-13 because: 1) it can take advantage of the powerful genetic tools available in the fruit fly, 2) the DA neuron dendrite arbor spreads out in only 2 dimensions beneath an optically clear larval cuticle making it easy to visualize with high resolution in vivo, 3) the class-specific diversity in dendritic morphology facilitates a comparative analysis to find key elements controlling the formation of simple vs. highly branched dendritic trees, and 4) dendritic arbor stereotypical shapes of different DA neurons facilitate morphometric statistical analyses.
DA neuron activity modifies the output of a larval locomotion central pattern generator14-16. The different DA neuron classes have distinct sensory modalities, and their activation elicits different behavioral responses14,16-20. Furthermore different classes send axonal projections stereotypically into the Drosophila larval central nervous system in the ventral nerve cord (VNC)21. These projections terminate with topographic representations of both DA neuron sensory modality and the position in the body wall of the dendritic field7,22,23. Hence examination of DA axonal projections can be used to elucidate mechanisms underlying topographic mapping7,22,23, as well as the wiring of a simple circuit modulating larval locomotion14-17.
We present here a practical guide to generate and analyze genetic mosaics24 marking DA neurons via MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)1,10,25 and Flp-out22,26,27 techniques (summarized in Fig. 1).

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

The dendritic arborization sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system are useful models to elucidate both general and neuron class-specific mechanisms of neuron differentiation. We present a practical guide to generate and analyze dendritic arborization neuron genetic mosaics.

ניתוח מורפולוגי של תסיסנית הזחל היקפיים Neuron דנדריטים חושי האקסונים באמצעות פסיפסים גנטי

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

ברזולוציה גבוהה הדמיה חיה של התנהגות התא ב Neuroepithelium פיתוח

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

Ex vivo הדמיה חיה של חלוקות תא יחיד בNeuroepithelium מאוס

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and medical applications. Strengths of fluorescence include its sensitivity, specificity, and compatibility with live imaging. Unfortunately, conventional forms of fluorescence microscopy suffer from one major weakness, diffraction-limited resolution in the imaging plane, which hampers studies of structures with dimensions smaller than ~250 nm. Recently, this limitation has been overcome with the introduction of super-resolution fluorescence microscopy techniques, such as photoactivated localization microscopy (PALM). Unlike its conventional counterparts, PALM can produce images with a lateral resolution of tens of nanometers. It is thus now possible to use fluorescence, with its myriad strengths, to elucidate a spectrum of previously inaccessible attributes of cellular structure and organization.
Unfortunately, PALM is not trivial to implement, and successful strategies often must be tailored to the type of system under study. In this article, we show how to implement single-color PALM studies of vesicular structures in fixed, cultured neurons. PALM is ideally suited to the study of vesicles, which have dimensions that typically range from ~50-250 nm. Key steps in our approach include labeling neurons with photoconvertible (green to red) chimeras of vesicle cargo, collecting sparsely sampled raw images with a super-resolution microscopy system, and processing the raw images to produce a high-resolution PALM image. We also demonstrate the efficacy of our approach by presenting exceptionally well-resolved images of dense-core vesicles (DCVs) in cultured hippocampal neurons, which refute the hypothesis that extrasynaptic trafficking of DCVs is mediated largely by DCV clusters.

We describe how to implement photoactivated localization microscopy (PALM)-based studies of vesicles in fixed, cultured neurons. Key components of our protocol include labeling vesicles with photoconvertible chimeras, collecting sparsely sampled raw images with a super-resolution microscopy system, and processing the raw images to produce a super-resolution image.

הדמיה ברזולוציה סופר של שלפוחית ​​צפופות ליבות עצבית

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

הדמיה חיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; הזחל Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

קרינה פלואורסצנטית תא בודד רזולוציה לחיות הדמיה של שעונים היממה דרוזופילה בתרבות המוח זחל

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית של חיים תסיסנית melanogaster באמצעות ספינינג זווית הקסם

ויזואליזציה של עצבים המגזרי הזחל ב 3^Rd Instar תסיסנית הכנות הזחל

Live-תא הדמיה של תאים מבשר חושי האיברים אינטקט תסיסנית גלמים

גישה מהירה הדמיה ברזולוציה גבוהה הקרינה חצי עבה פרוסות המוח

ניתוח מורפולוגי של תסיסנית הזחל היקפיים Neuron דנדריטים חושי האקסונים באמצעות פסיפסים גנטי

ברזולוציה גבוהה הדמיה חיה של התנהגות התא ב Neuroepithelium פיתוח

Ex vivo הדמיה חיה של חלוקות תא יחיד בNeuroepithelium מאוס

הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח

הדמיה ברזולוציה סופר של שלפוחית צפופות ליבות עצבית

הדמיה חיה של

קרינה פלואורסצנטית תא בודד רזולוציה לחיות הדמיה של שעונים היממה דרוזופילה בתרבות המוח זחל

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית של חיים תסיסנית melanogaster באמצעות ספינינג זווית הקסם

ויזואליזציה של עצבים המגזרי הזחל ב 3 Rd Instar תסיסנית הכנות הזחל

Live-תא הדמיה של תאים מבשר חושי האיברים אינטקט תסיסנית גלמים

גישה מהירה הדמיה ברזולוציה גבוהה הקרינה חצי עבה פרוסות המוח

ניתוח מורפולוגי של תסיסנית הזחל היקפיים Neuron דנדריטים חושי האקסונים באמצעות פסיפסים גנטי

ברזולוציה גבוהה הדמיה חיה של התנהגות התא ב Neuroepithelium פיתוח

Ex vivo הדמיה חיה של חלוקות תא יחיד בNeuroepithelium מאוס

הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח

הדמיה ברזולוציה סופר של שלפוחית ​​צפופות ליבות עצבית

הדמיה חיה של

ויזואליזציה של עצבים המגזרי הזחל ב 3^Rd Instar תסיסנית הכנות הזחל

הדמיה ברזולוציה סופר של שלפוחית צפופות ליבות עצבית