גילינו כי HLA-I הוא אפיגנטי למטה מוסדר בתת-אפופולציה של תאים סרטניים המציגים תכונות תאי גזע ויכולת ייזום גידול. HLA-I downregulation קשורה ישירות בריחה חיסונית, מתן יתרונות הישרדות עבור תאי גזע סרטניים, ולכן עושה שליליות HLA-I סמן תפקודי מדויק עבור תאים אלה. הדגמת ההליך תהיה סודה יזאדמהר, פוסט-דוק מהמעבדה שלנו.
עם רכישת הדגימה, מניחים את הרקמה בצלחת פטרי 100 מ"מ בארון בטיחות ביו מעוקר, ומוסיפים 500 מיקרוליטרים של PBS סטרילי לצלחת. השתמש אזמל סטרילי כדי ל Triturate מכנית את הרקמה לחתיכות קטנות עד שבר לא גדול מ 0.1 מילימטר. העבר את כל נפח 500 מיקרוליטר של PBS דרך מסננת תא נקבוביות 35 מיקרומטר לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר.
מוסיפים עוד 500 מיקרוליטרים של PBS לשברים הרקמה, וטחון את הרקמות שוב. לאחר מכן לסנן את supernatant דרך מסננת התא לתוך אותו צינור איסוף, ולהמשיך לטחון את חתיכות הרקמה עד המדגם מנותק לחלוטין. כאשר הנפח האחרון של תאים נאסף, לסובב את התאים הגידול על ידי צנטריפוגה, ולהשעות מחדש את גלולה בחמישה מיליליטר של חיץ המואליזה.
לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר, לאסוף את התאים עם צנטריפוגה אחרת, ולשטוף את גלולה עם עוד חמישה מיליליטר של PBS. להשעות מחדש את גלולה במיליליטר אחד של PBS, ול לספור את התאים קיימא. מדללים את התאים לתאים פי 10 עד 7 לכל 200 מיקרוליטרים של ריכוז PBS על קרח, ומוסיפים 200 מיקרוליטרים של מטריצת קרום מרתף לתאים עם ערבוב עדין.
ואז להזריק את המטריצה מתלים-מרתף התא תת עורית לתוך האגף של עכבר גמא SCID NOD, ולבדוק את הצמיחה של הגידול באתר ההזרקה פעמיים בשבוע. כאשר הגידול מגיע לס"מ אחד בקוטר, לחתוך את הגידול לחצי, ולתקן מחצית xenograft עם 4% paraformaldehyde לילה לניתוח היסטולוגי. לעבד את המחצית השנייה של הגידול כפי שהוכח רק כדי להשיג השעיה תא יחיד, ולדלל את התאים פעמיים 10 לשישה תאים למיליליטר של PBS בתוספת 5%FBS ריכוז.
שמור על התאים על הקרח במשך 30 דקות לפני חלוקת ההשעיה התא בין בקרת איזוטיפ אחת צינור נוגדנים אחד. שים לב למספר התאים בכל צינור, ומערבבים את התאים בצינור הנוגדנים עם נוגדן נגד HLA ואת התאים בצינור הבקרה של האיסוטיפ עם נוגדן בקרת אנטי-isotype המתאים עבור דגירה של 90 דקות על קרח. בסוף הדגירה, לאסוף את שתי אוכלוסיות התאים על ידי צנטריפוגה, ואחריו שני 10 מיליליטר PBS שוטף על ידי צנטריפוגה.
לאחר הכביסה השנייה, להשעות מחדש את כדורי ב 10 מיקרוגרם למיליליטר של DAPI לריכוז אחד פעמים 10 לשבעה תאים לריכוז מיליליטר. לאחר מכן סנן כל מתלה תא דרך מסננת נקבוביות של 35 מיקרומטר לצינורות פוליסטירן בודדים של 12 על 75 מילימטר. לאחר מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות, מדללים את אוכלוסיות התאים השליליים והחיוביים של HLA-I ליחידים פי 10 לריכוזי התאים החמישיים ב-15 מיליליטר של מדיום צמיחת הסרקוספירה לכל תת-קבוצה.
מדללים באופן סדרתי את התאים ל-10 פעמים לרביעי, 10 לשלישי, ו-10 לריכוזים השניים ב-15 מיליליטר של צמיחת סרקוספירה טרייה בינונית לדילול, ומוסיפים 100 מיקרוליטר של תאים מכל דילול לכל באר של לוחית אחת של תאים מצורפים נמוכים במיוחד לדילול. מניחים את הצלחות לתוך 37 מעלות צלזיוס, 5%פחמן דו חמצני תאים תרבות החממה, ניטור היווצרות הסרקוספירה מדי יום על ידי מיקרוסקופ אור והוספת גורם גדילה פיברובלסט בסיסי טרי גורם גדילה אפידרמיס לכל באר מבלי לשנות את המדיום כל שלושה ימים. לאחר שלושה שבועות, לספור את מספר בארות סרקוספירה חיובית סרקוספירה שלילית עבור כל דילול תא של שני תאים HLA-I שלילי ו HLA-I חיובי כדי לאפשר חישוב של תדירות התא יוצר כדור מבוסס על התפלגות הסתברות פואסון.
בדרך כלל, קסנוגרפטים שמקורם בחולה אנושי מורכבים משתי אוכלוסיות HLA-I חיוביות ושליליות מובהקות, עם היסטולוגיה דומה לזו שהוכחה על ידי הגידול העיקרי ההורי. מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות של תאים ייזום גידול קסנוגרפט שמקורם בחולה סרקומה כפי שהוכח מקל על העשרה של מספר גבוה של תאים שליליים HLA-I-שלילי מאוכלוסיית התא ההורים. תאים שליליים HLA-I מסוגלים ליצור כדורים עם קלט ראשוני של מעט כמו 10 תאים להפגין יכולת היווצרות גידול גבוה יותר מאשר חולה סרקומה HLA-I חיובי הגיע תאים יוזם גידול קסנוגרפט.
הזרקה של אותו מספר של תאים שליליים וחיוביים HLA-I תת עורית לתוך אגפים מנוגדים של אותו עכבר מדגים כי תאים שליליים HLA-I יש יכולת היווצרות גידול גבוה באופן משמעותי. בעוד xenografts שנוצרו על ידי שניהם HLA-I שלילי וחיובי subpopulations הם גידולים הטרוגניים הסלולר. יתר על כן, ניתוח ביטוי גנים של התאים היוזמים גידול מגלה כי תאים שליליים HLA-I לבטא סמני התמדת תאי גזע והוא יכול להיות המושרה להבדיל לאורך מסלולים ליפוגניים ואוסטאוגניים, הוכחת חזק שמן אדום-O ו Alizarin-Red-S כתמים ותרבות.
שיטה זו יכולה לשמש כדי לבודד תאי גזע סרטניים בסרטן אנושי שונים. פחמן מולקולרי, למשל, על ידי רצף הדור הבא עשוי לחשוף סמנים נפוצים עבור מיקוד התאים טיפולית. הגילוי שלנו מוכיח כי השיקום של HLA-I הוא צעד קריטי להצלחת אסטרטגיות הגדלת תאים חיסוניים יחידה תפקודית.
