. אנחנו אסירת תודה ליאם Tyron על קריאתו מומחה של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מימון מדעי הטבע, הנדסה מחקר המועצה של קנדה (NSERC) ד א הוד. ד א הוד הוא גם האוחז כיסא מחקר קנדה בפיזיולוגיה של התא.

כל ההליכים הקשורים לבעלי חיים היו נבדקו ואושרו על-ידי יורק האוניברסיטה חיה טיפול הוועדה. עם ההגעה במתקן בעל חיים באוניברסיטת יורק, ניתנו כל העכברושים מינימום של חמישה ימים כדי להתרגל לסביבה שלהם לפני הליך כירורגי, עם מזון המסופק ad libitum. למרות פרוטוקול זה הוחל בעבר ל-17,15,22אחרים מינים, הנייר הנוכחי מתבסס על עבודתה החלוצית של Pette ועמיתיו23 , מתמקד המודל עכברוש, במיוחד.
1. הכנת יחידת פעילות כויץ כרונית
<ol><li>בעזרת וולטמטר, בדוק את הפוטנציאל של סוללות ליתיום מטבע. הערה: הפוטנציאל של כל סוללה צריך להיות 3.0 ± 0.10 V.</li>
	<li>להוסיף 2-3 סוללות לתוך החריץ של היחידה כך הפוטנציאל הכולל הוא 6-9 V. הערה: זה תלוי שיקול הדעת של החוקרים לשקול כמה פוטנציאל (6 או 9 V) כדי לשמור על במהלך ההליך כולו נסיוני. בהתאם תכנון המחקר, את עוצמת הגירוי הרצוי, ניתן להשתמש בסוללות או 2 או 3.</li>
	<li>ודא כי היחידה פועלת כהלכה באמצעות מחוון הדופק, על ידי חשיפת את יחידת דופק 1 הנפלטת מנורה אינפרא-אדום נייד.</li>
</ol>2. ניתוח של פעילות כויץ כרונית
הערה: לעקר כל כלי ניתוח לפני הליך כירורגי. הן במהלך והן מיד לאחר הניתוח, טמפרטורת הגוף של החולדות מתוחזק על ידי כרית החימום. רצוי לבצע הליך כירורגי על תלוי כירורגי. המנתח צריך ללבוש כפפות כירורגי סטרילי, כמו גם חלוק מעבדה נקייה. במקרה הצורך, מומלץ ללבוש מסיכה מכונת ההנשמה חד פעמיות.
<ol><li>עזים ומתנגד חולדות תחת 1-3% איזופלוריין באינהלציה עם חמצן, אשר מופעל על ידי מערכת מאדה גז. אשר חיה היא הרגעה על-ידי בדיקת hindlimb הבוהן צביטה, על ידי התבוננות עומק הנשימה וקצב. החל עינית חומר סיכה על העיניים כדי למנוע יובש. החל זריקה תת עורית של Meloxicam (0.5 מ"ג/מ"ל) ב- 2 מ"ג/ק"ג. הערה: מומלץ גם יישום ומשולבות של שיכוך כאבים (למשל, Meloxicam בתוספת לידוקאין) כדי למזער כל כאב במהלך הניתוח ולאחריו.</li>
	<li>בעדינות לגלח את hindlimb שמאל, וכן רצועה מסביב הטורסו מהחלק האחורי של הצוואר, בסביבות מאחור את forelimbs, על פני בית החזה הקדמי. נגב בעדינות את אזורי מגולח עם יוד, אתיל אלכוהול לחיטוי.</li>
	<li>עם החיה שוכבת על הבטן שלו, עושים חתך קטן (~0.5 ס מ) בצד האחורי של הצוואר במרכז האזור המגולח (האזור מוחשי בין השכמות) באמצעות אזמל (להב מספר 10).</li>
	<li>אתר של שיתוק נפוצות.<ol>
<li>רול חיה על הצד השמאלי שלו ולעשות ~ 2-3 ס מזמן חתך בעור של hindlimb השמאלי. מקד את האזור החתך סביב קבוצות שריר הירך זה landmarked בין את גומת חן של הברך משותפת מאחור קרוב המקור של הזנב. הערה: יש להיזהר לא לזהם את אזור החתך הראשון בעת שינוי המיקום של הגוף.</li>
		<li>באמצעות שקצהו בלאנט מעוקל מספריים כירורגיים, לנתח את האזור תת עורית נרחב ~3.5 - 4 ס מ, להפריד את העור בין השריר שמתחת כדי להפוך כיס בין השריר שמתחת לעור שנפתחו. פתח את העור מן הרקמה הבסיסית סביב כל ההיקף של החתך (~1.5 ס מ2).</li>
		<li>עושים חתך קטן (פחות מ 0.5 ס מ) על השריר הדו-ראשי עם מספריים כירורגיים, המבטיח כי קצות המספריים הם כורתים ישירות דרך השריר.</li>
		<li>בעדינות לפתוח את האזור לחתוך עד את קבוצות השרירים הפנימיים, של שיתוק נפוצות גלויים (העומק של רקמות שריר החיצוני (קרי, הדו-ראשי) הוא סביב ~0.5 ס מ). באמצעות מלקחיים, בעדינות מגע/קמצוץ העצב גלוי ולצפות תגובות של קבוצות שרירים היעד (למשל, TA שריר) לבין האצבעות (dorsiflexion גלוי) לאשר שיתוק נפוץ הוא מבודד. הערה: שלב זה צריך להיעשות בזהירות כדי למנוע חיתוך או פגיעה העצב.</li>
		<li>לתקן את החלון על-ידי משיכתו פתוח עם רטרקטורים מתכת כזה גודל החלון הוא ~1.5 ס מ2 עם שיתוק משקרת במרכז החלון. השתמש קטן ווים ממתכת מחובר הרצועות ו/או גומיות זה הן הידק המשטח (או ניתוח הלוח) (איור 2 א).</li>
	</ol></li>
	<li>לצרף את החוט בשני הצדדים של העצב.<ol>
<li>להכין ~ 50-60 ס מ טפלון (PTFE)-מצופה חוט מפלדת בסדר ומקפלים אותו לשניים. הערה: זה עשוי להיות שימושי לחשוף חוט מצופה PTFA תחת אור UV לפני הניתוח.</li>
		<li>לחבר את החלק מקופל של החוט לתוך הסדק של מוט נירוסטה 30 ס מ באורך. עוברים את המוט, יחד עם הכבל, subcutaneously מכיס פתח hindlimb לכיוון האזור חתך קטן מאחורי הצוואר, תבנית בצורת האות L במעלה הרגל ולאורך במרכז הגב.</li>
		<li>למצוא את שני קצות החוט hindlimb. חוטי את היות כל החוטים בידודי PTFE. באמצעות אזמל, בזהירות להסיר את קצות החוט ~1.5 ס מ. אם החוטים הופכות בלויים, לחתוך אותם, להתפשט מחדש. לעטוף את קצות חוט הפשיטו סביב מחט 21-G קהות (5 פעמים), ביצוע סליל. ברגע הגלילים נעשים כראוי, לשחרר את המחט מהם.</li>
		<li>שימוש בגודל 6-0 משי כירורגי, לאבטח כל הגלילים משני צדי נפוצות שיתוק (איור 2 א).<ol>
<li>קשר בסופו של דבר סליל, האצבעות, בצד שמאל של העצב. ודא הגליל ב 1.5-2.5 מ מ העצב.</li>
			<li>כדי לאבטח את הגליל, החל שניים או שלושה תפרים נוספים לאורך הגליל.</li>
			<li>חזור על שלבים אלה בצד ימין של העצב.</li>
		</ol>
</li>
		<li>החל 2-3 טיפות אנטיביוטיות פתרון (אמפיצילין בתוך תמיסת מלח; 132 מ"ג/מ"ל) ולאחר מכן בקפידה תפר את החלון (קרי, השריר הדו-ראשי רקמות) בעזרת חוט משי גודל 5-0.</li>
	</ol></li>
	<li>ברפיון הרוח רפיון יתר של תיל (לגבי הקוטר של האצבע) ולדחוף לתוך הכיס תת עורית מעל החתך sutured של השריר הדו-ראשי (כ מעל המותן).</li>
	<li>חלות 2-3 טיפות אנטיביוטיות פתרון שוב (אמפיצילין בתוך תמיסת מלח; 132 מ"ג/מ"ל). לסגור את העור שנפתחו על ידי הידוק.</li>
	<li>חבר את החוטים (יוצא באזור החתך של הצוואר) ממריץ המרכז לאמנות עכשווית.<ol>
<li>לחבר סיכה sockets עם החוטים.<ol>
<li>חותכים את לולאת חוט שיוצא החתך בחלק העליון של הצוואר כדי ליצור חוט 2 הקצוות (אלה להוביל הגלילים sutured על צדי שיתוק).</li>
			<li>באמצעות אזמל, מוריד את הקצוות של החוטים על-ידי ~0.5 ס מ. חתך את החוטים מרוטים, אם בכלל.</li>
			<li>לאט לאט לדחוף את חלקי הפשיטו החוטים לתוך החור של אדני pin, באמצעות עבודה עם מלחם, הלחמה את החוטים על אדני pin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>לחלופין, בדוק את החיבור של כבלים.<ol>
<li>להתחבר הסיכות יחידה ממריץ benchtop גדולים באמצעות סרטונים אליגטור.</li>
			<li>לספק יחיד דופק של 9 V (0.1 ms, 10 Hz) כדי לאשר TA שריר חוזים עם השמאל רגל dorsiflexes.</li>
		</ol>
</li>
		<li>עוברים את הקצוות המחוברים תילים סיכה דרך משטח גזה סטרילית זה ~ 4 ס"מ על 4 ס"מ.</li>
		<li>להתחבר הפינים יחידת ממריץ המרכז לאמנות עכשווית.<ol>
<li>עוברים את החוטים דרך החור בבסיס של תיבת ממריץ. הערה: תיבת זו היא תא תוצרת בית עבור היחידה ממריץ המרכז לאמנות עכשווית והיא 3.5 ס"מ × 3.5 ס"מ × 2.5 ס מ13.</li>
			<li>הכנס את הסיכות אדני חיבור על יחידת המרכז לאמנות עכשווית. לשים בעדינות את יחידת המרכז לאמנות עכשווית אל החדר. השתמש נעץ דביק כדי לאבטח את יחידת המרכז לאמנות עכשווית בחלק התחתון של החדר.</li>
		</ol>
</li>
		<li>באמצעות טייפ אתלטי או הקלטת כירורגי נקבובי, לתקן את התא עם הסרט. הטורסו מגולח. סגור את החלק העליון של התא עם שלוש שכבות של מקליטה וסיום על ידי ליפוף קלטת בצדדים של תיבת ממריץ כדי לאבטח את תיבת (איור 2B).</li>
	</ol></li>
	<li>בדוק אם המרכז לאמנות עכשווית פועלת באמצעות חשיפת את יחידת דופק אחת של אור אינפרא-אדום (ספקטרום אורכי גל > 770 ננומטר) זה נפלט על ידי מנורה אינפרא-אדום נייד. הערה: אם המרכז לאמנות עכשווית פועלת כראוי, חוקרים יוכלו לראות ש-hindlimb השרירים (קרי, ת א) הם קבלנות בתגובה האור האינפרא-אדום.</li>
	<li>לצפות את החולדה ונטר את הטמפרטורה שלו עד זה מלא שהכרתו. בית זה בכלוב יחיד-הדייר כדי למנוע נזק מבעלי חיים אחרים, אין להשאיר כל מנהרות או אובייקטים פלסטיק בכלוב לאורך כל המחקר כדי לצמצם את הסיכון של נזק יחידת ממריץ או פציעה של החיה. לספק בקבוק מים כלול אמוקסיצילין (0.5 mg/mL).</li>
	<li>החל מנה 1 מ"ג/ק"ג של Meloxicam subcutaneously כל 24 שעות לאחר הניתוח, אשר נמשך לפחות 72 h.</li>
</ol>3. פעילות כויץ כרונית
<ol><li>לאחר הניתוח, אפשר לפחות 5-7 ימים להתאוששות מלאה של החתך ואזורים בתפר של שרירי השלד מסביב. הערה: במהלך ואחרי נוהל המרכז לאמנות עכשווית, ביסודיות לבדוק המצב של כל חיה על ידי התבוננות והתנהגותם (למשל, לאכול, לשתות, ו/או העברה). בנוסף, לקבוע בכל נפשי או תופעות לוואי על ידי בדיקת שינוי במשקל הגוף לפני ואחרי ההליך המרכז לאמנות עכשווית.</li>
	<li>ביום של גירוי המרכז לאמנות עכשווית, הפעלת המרכז לאמנות עכשווית על ידי חשיפת את יחידת ממריץ דופק אחת של אור אינפרא-אדום (טווח אורך גל > 770 ננומטר) על ידי מנורה אינפרא-אדום נייד.</li>
	<li>החל h 3 או 6 של גירוי המרכז לאמנות עכשווית 10 הרץ. הערה: מסגרת הזמן לגירוי זה תפקיד. התדירות של גירוי לא שונתה בניסויים אלה, שיפורים רק צנוע מאוד בהתאמת מיטוכונדריאלי נצפו על-ידי הרחבת הגירוי בין 3 ל 6 שעות ביממה, מניסיוננו. במידת האפשר, בדוק את גירוי ואת חיה כל 30-60 דקות.</li>
	<li>בעקבות תקופת המרכז לאמנות עכשווית הרצוי, כבה את יחידת המרכז לאמנות עכשווית בעזרת חשיפה אור אינפרא-אדום (אותו הנוהל כמו הפעלת היחידה).</li>
	<li>אם החלת ימים מרובים, חזור על השלב 3.2. ל 3.4.</li>
	<li>לקבוע את העיתוי של אוסף רקמה. לדוגמה, לאסוף את רקמות 24 שעות לאחר תחילת הקרב הסופי של המרכז לאמנות עכשווית (קרי, 18 h לאחר גירוי המרכז לאמנות עכשווית האחרון של 6-אייץ '), אשר מבוצע תחת הרדמה כפי שנעשה במהלך ההליך הכירורגי המרכז לאמנות עכשווית. מיד לאחר איסוף כל רקמות, המתת חסד בבעלי חיים על ידי excising בלב בעוד החיה הוא עדיין תחת הרדמה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Holloszy, J. O., Coyle, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptations+of+skeletal+muscle+to+endurance+exercise+and+their+metabolic+consequences.">Adaptations of skeletal muscle to endurance exercise and their metabolic consequences.</a> J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 56 (4), 831-838 (1984).</li><li>Hood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invited+Review:+contractile+activity-induced+mitochondrial+biogenesis+in+skeletal+muscle.">Invited Review: contractile activity-induced mitochondrial biogenesis in skeletal muscle.</a> J Appl Physiol. 90 (3), 1137-1157 (2001).</li><li>Fernandes, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise+training+restores+the+endothelial+progenitor+cells+number+and+function+in+hypertension:+implications+for+angiogenesis.">Exercise training restores the endothelial progenitor cells number and function in hypertension: implications for angiogenesis.</a> J Hypertens. 30 (11), 2133-2143 (2012).</li><li>Chabi, B., Adhihetty, P. J., O'Leary, M. F., Menzies, K. J., Hood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+Sirt1+expression+and+mitochondrial+proteins+during+conditions+of+chronic+muscle+use+and+disuse.">Relationship between Sirt1 expression and mitochondrial proteins during conditions of chronic muscle use and disuse.</a> J Appl Physiol. 107 (6), 1730-1735 (2009).</li><li>Lessard, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+aerobic+exercise+training+causes+metabolic+dysfunction+and+reveals+novel+exercise-regulated+signaling+networks.">Resistance to aerobic exercise training causes metabolic dysfunction and reveals novel exercise-regulated signaling networks.</a> Diabetes. 62 (8), 2717-2727 (2013).</li><li>Irrcher, I., Adhihetty, P. J., Sheehan, T., Joseph, A. M., Hood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPARgamma+coactivator-1alpha+expression+during+thyroid+hormone-+and+contractile+activity-induced+mitochondrial+adaptations.">PPARgamma coactivator-1alpha expression during thyroid hormone- and contractile activity-induced mitochondrial adaptations.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 284 (6), C1669-C1677 (2003).</li><li>Tamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postexercise+whole+body+heat+stress+additively+enhances+endurance+training-induced+mitochondrial+adaptations+in+mouse+skeletal+muscle.">Postexercise whole body heat stress additively enhances endurance training-induced mitochondrial adaptations in mouse skeletal muscle.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 307 (7), R931-R943 (2014).</li><li>Mosole, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+high-level+exercise+promotes+muscle+reinnervation+with+age.">Long-term high-level exercise promotes muscle reinnervation with age.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 73 (4), 284-294 (2014).</li><li>Irrcher, I., Walkinshaw, D. R., Sheehan, T. E., Hood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+hormone+(T3)+rapidly+activates+p38+and+AMPK+in+skeletal+muscle+in+vivo.">Thyroid hormone (T3) rapidly activates p38 and AMPK in skeletal muscle in vivo.</a> J Appl Physiol. 104 (1), 178-185 (2008).</li><li>Lesmana, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+change+in+thyroid+hormone+signaling+by+altered+training+intensity+in+male+rat+skeletal+muscle.">The change in thyroid hormone signaling by altered training intensity in male rat skeletal muscle.</a> Endocr J. 63 (8), 727-738 (2016).</li><li>Hokama, J. Y., Streeper, R. S., Henriksen, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voluntary+exercise+training+enhances+glucose+transport+in+muscle+stimulated+by+insulin-like+growth+factor+I.">Voluntary exercise training enhances glucose transport in muscle stimulated by insulin-like growth factor I.</a> J Appl Physiol. 82 (2), 508-512 (1997).</li><li>Tyler, K. R., Wright, A. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+weight+portable+stimulators+for+stimulation+of+skeletal+muscles+at+different+frequencies+and+for+cardiac+pacing.">Light weight portable stimulators for stimulation of skeletal muscles at different frequencies and for cardiac pacing.</a> J Physiol Lond. 307, 6-7 (1980).</li><li>Takahashi, M., Rana, A., Hood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portable+electrical+stimulator+for+use+in+small+animals.">Portable electrical stimulator for use in small animals.</a> J Appl Physiol. 74 (2), 942-945 (1993).</li><li>Ljubicic, V., Adhihetty, P. J., Hood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+animal+models:+chronic+electrical+stimulation-induced+contractile+activity.">Application of animal models: chronic electrical stimulation-induced contractile activity.</a> Can J Appl Physiol. 30 (5), 625-643 (2005).</li><li>Pette, D., Vrbova, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+does+chronic+electrical+stimulation+teach+us+about+muscle+plasticity?.">What does chronic electrical stimulation teach us about muscle plasticity?.</a> Muscle Nerve. 22 (6), 666-677 (1999).</li><li>Pette, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Historical+Perspectives:+plasticity+of+mammalian+skeletal+muscle.">Historical Perspectives: plasticity of mammalian skeletal muscle.</a> J Appl Physiol. 90 (3), 1119-1124 (2001).</li><li>Pette, D., Vrbova, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Contribution+of+Neuromuscular+Stimulation+in+Elucidating+Muscle+Plasticity+Revisited.">The Contribution of Neuromuscular Stimulation in Elucidating Muscle Plasticity Revisited.</a> Eur J Transl Myol. 27 (1), 6368 (2017).</li><li>Skorjanc, D., Jaschinski, F., Heine, G., Pette, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+increases+in+capillarization+and+mitochondrial+enzymes+in+low-frequency-stimulated+rabbit+muscle.">Sequential increases in capillarization and mitochondrial enzymes in low-frequency-stimulated rabbit muscle.</a> Am J Physiol. 274 (3 Pt 1), C810-C818 (1998).</li><li>Kim, Y., Hood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+autophagy+system+during+chronic+contractile+activity-induced+muscle+adaptations.">Regulation of the autophagy system during chronic contractile activity-induced muscle adaptations.</a> Physiol Rep. 5 (14), (2017).</li><li>Memme, J. M., Oliveira, A. N., Hood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronology+of+UPR+activation+in+skeletal+muscle+adaptations+to+chronic+contractile+activity.">Chronology of UPR activation in skeletal muscle adaptations to chronic contractile activity.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 310 (11), C1024-C1036 (2016).</li><li>Ljubicic, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+an+attenuated+mitochondrial+adaptive+plasticity+in+aged+skeletal+muscle.">Molecular basis for an attenuated mitochondrial adaptive plasticity in aged skeletal muscle.</a> Aging (Albany NY). 1 (9), 818-830 (2009).</li><li>Schwarz, G., Leisner, E., Pette, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+telestimulation+systems+for+chronic+indirect+muscle+stimulation+in+caged+rabbits+and+mice.">Two telestimulation systems for chronic indirect muscle stimulation in caged rabbits and mice.</a> Pflugers Arch. 398 (2), 130-133 (1983).</li><li>Simoneau, J. A., Pette, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-specific+effects+of+chronic+nerve+stimulation+upon+tibialis+anterior+muscle+in+mouse,+rat,+guinea+pig,+and+rabbit.">Species-specific effects of chronic nerve stimulation upon tibialis anterior muscle in mouse, rat, guinea pig, and rabbit.</a> Pflugers Arch. 412 (1-2), 86-92 (1988).</li><li>Ohlendieck, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+chronic+low-frequency+stimulation+on+Ca2+-regulatory+membrane+proteins+in+rabbit+fast+muscle.">Effects of chronic low-frequency stimulation on Ca2+-regulatory membrane proteins in rabbit fast muscle.</a> Pflugers Arch. 438 (5), 700-708 (1999).</li><li>Brown, M. D., Cotter, M. A., Hudlicka, O., Vrbova, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+different+patterns+of+muscle+activity+on+capillary+density,+mechanical+properties+and+structure+of+slow+and+fast+rabbit+muscles.">The effects of different patterns of muscle activity on capillary density, mechanical properties and structure of slow and fast rabbit muscles.</a> Pflugers Arch. 361 (3), 241-250 (1976).</li><li>Skorjanc, D., Traub, I., Pette, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identical+responses+of+fast+muscle+to+sustained+activity+by+low-frequency+stimulation+in+young+and+aging+rats.">Identical responses of fast muscle to sustained activity by low-frequency stimulation in young and aging rats.</a> J Appl Physiol. 85 (2), 437-441 (1998).</li><li>Kim, Y., Triolo, M., Hood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Aging+and+Exercise+on+Mitochondrial+Quality+Control+in+Skeletal+Muscle.">Impact of Aging and Exercise on Mitochondrial Quality Control in Skeletal Muscle.</a> Oxid Med Cell Longev. 2017, 3165396 (2017).</li><li>Callewaert, L., Puers, B., Sansen, W., Jarvis, J. C., Salmons, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+implantable+device+for+investigating+the+adaptive+response+of+skeletal+muscle+to+chronic+electrical+stimulation.">Programmable implantable device for investigating the adaptive response of skeletal muscle to chronic electrical stimulation.</a> Med Biol Eng Comput. 29 (5), 548-553 (1991).</li><li>Kern, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+stimulation+counteracts+muscle+decline+in+seniors.">Electrical stimulation counteracts muscle decline in seniors.</a> Front Aging Neurosci. 6, 189 (2014).</li><li>Zampieri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+exercise+in+aging+human+skeletal+muscle+increases+mitochondrial+calcium+uniporter+expression+levels+and+affects+mitochondria+dynamics.">Physical exercise in aging human skeletal muscle increases mitochondrial calcium uniporter expression levels and affects mitochondria dynamics.</a> Physiol Rep. 4 (24), (2016).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

הדגם פעילות כויץ כרונית (המרכז לאמנות עכשווית) של פעילות גופנית, דרך השריר בתדר נמוך גירוי ויוו, הוא מודל מצויין ללמוד שריר עיבודים פנוטיפי לממש24,13,25 , 26. כפי שמוצג מחקרים קודמים20,27, המרכז לאמנות עכשווית הוא כלי יעיל שבו חוקרים יכולים לשלוט תדרים (קרי, זמן וימים) ואמצעי הדרכה ולחקור שונים הביוכימי ו/או מולקולרית אירועים במהלך התקפי חוזרים ונשנים של חוסר פעילות. אחת התכונות הטובות ביותר של מודל זה היא כי שרירי hindlimb contralateral משמשים בקרה פנימית, אשר מסייע כדי למזער את השתנות בין בעלי חיים. יתר על כן, שלנו ניסויים רבים יותר מעשור הראו כי היחידה המרכז לאמנות עכשווית חיצוני אינו מגביל של חיה דפוסי התנהגות רגילה (למשל, נדידה, אכילה ושינה), מאפשר שימוש ניסיוני טיפולים נוספים כאלה כמו זריקות של סמים. לכן, חוקרים ניתן להחיל את פרוטוקול המרכז לאמנות עכשווית במהלך לימודיהם הכשרה עם שינויים ניסיוני משלהם.
פרוטוקול זה המרכז לאמנות עכשווית יש מספר שלבים קריטיים, למרות כל השלבים דורשים ריכוז ברמה גבוהה בשל אופי של ניתוח הישרדות. זה חשוב במיוחד לחבר חוטים במיקומים עקביים, מומלץ לקיים חוקר מיומן אותו לבצע את הניתוח כדי לשמור על עקביות בדו landmarking באותו המקום של העצב, תפירת חוטים המרחק אותו עצב, וכו '. בנוסף, יש צורך לאשר את האבטחה של הדבק לפני ובמהלך היישום של המרכז לאמנות עכשווית, כי הקלטת השתחררו או בלוי עשוי להוביל לכשל של ההליך.
זה המודל המרכז לאמנות עכשווית יש כמה מגבלות קלות. מאז יחידת גירוי המרכז לאמנות עכשווית הוא קבוע על ידי מקליטה, כמה חיות התערוכה גירויים בעור קטין סביב האזור הקלטה. זה יכול להשתפר במחקרים עתידיים באמצעות ג'קט לביש שתחליף את התא המרכז לאמנות עכשווית ללא מדביק, עם זאת, לא היה לנו הצלחה עם מעילים כאלה. לחלופין, ממריץ יכול להיות קטנטנים בחלל בקרום הבטן כדי למנוע את שהשתמש הליך28, למרות ההליך זה פולשניים יותר. בנוסף, היחידה המתוארת ממריץ חיצוני נועד להיות נשלט על ידי חשיפת אור אינפרא-אדום. עם זאת, אם יחידה מצליח להגיב אור אינפרא-אדום, זה עשוי להצביע על שינויים עמידות או רגישות של היחידה לאחר שימוש ותיק. היישום של שבב בסופו של דבר עשוי להימנע משימוש של האור האינפרא אדום, יאפשר כל הפרמטרים המרכז לאמנות עכשווית להיות מתוכנת, מאוחסן, הפעלת המרכז לאמנות עכשווית להיות מיושם באופן מבוקר ומדויק יותר. כל העיצובים המחקר לשקול גם את השימוש של ניתוח דמה האיבר contralateral כדי לא לכלול את כל האפשריות הנובעות הניתוחית עצמה.
כדאי להמשיך ולחקור כיצד המרכז לאמנות עכשווית יכול להסדיר שריר מסה ו בעקבות תקופות של השריר שהעידה, או בהקשר של מחלות שרירים אחרות. כפי שמוצג מחקרים קליניים האחרונה29,30, ניתן להחיל המרכז לאמנות עכשווית גם לבחון את יעילותה על מנגנוני איתות anabolic באוכלוסיות הזדקנות. לסיכום, אנו ממליצים חוקרים כדי לנצל באמצעות פרוטוקול זה המרכז לאמנות עכשווית בלימודיהם, לפיה הם יכולים לחקור מנגנונים תאית ומולקולרית השונים שבבסיס שרירי השלד עיבודים פנוטיפי לממש כרונית.

שרירי השלד יכול להסתגל תרגיל אימון באמצעות שינויים ביואנרגיה ואת המבנה הפיזי1. אחד השינויים העיקריים הביא על ידי אימון סבולת הוא להן מיטוכונדריאלי, אשר יכול להיות מוערך על ידי עלייה בביטוי של רכיבים מיטוכונדריאלי (למשל, ציטוכרום c אוקסידאז [קוקס] subunits), כמו גם הביטוי של coactivator תעתיק, PGC-1α2. מספר גדל והולך של מחקרים הראו כי גורמים רבים אחרים, כולל מחזור מיטוכונדריאלי, mitophagy, חשובים גם עיבודים שריר. עם זאת, המנגנון על ידי איזה תרגיל אקוטי או כרוני לווסת את אלה תהליכים בשרירי השלד לא ברורים.
על המסלולים המסדירה שריר הנגרמת עיבודים, מודלים שונים של פעילות גופנית היו בשימוש נפוץ במחקרים מכרסמים, כולל הליכון, גלגל ריצה ושחייה תרגיל. אולם, פרוטוקולים אלה יש כמה מגבלות בכך ~ 4-12 שבועות יש צורך לבחון אלו שינויים פנוטיפי3,4,5. ניסיוני כאמצעי חלופי, תדירות נמוכה הנוצרות על-ידי גירוי כרוני כויץ פעילות (המרכז לאמנות עכשווית) השתמשו ביעילות רבה, כמו זה יכול להוביל עיבודים שרירים תוך תקופה קצרה יותר באופן משמעותי (קרי, עד 7 ימים) ונראה את השפעותיו להיות דומה, או אף יותר מאשר פרוטוקולים אחרים פעילות גופנית. יתר על כן, הנוכחות של הורמונלי6, טמפרטורה7ותופעות נוירולוגיות8 עשוי להקשות להבין תגובות ספציפיות שרירים פעילות גופנית כרונית. לדוגמה, הורמון בלוטת התריס9,10 ו פקטורי גדילה דמויי אינסולין (IGF)-111 זוהו לתווך עיבודים הכשרה-induced שרירים, אשר יכול גם לווסת את איתות המסלולים אחרות בהשלד שריר. ראוי לציין, המרכז לאמנות עכשווית-induced אפקטים מינימלית מוסדרים על ידי גורמים מערכתית, המאפשר מיקוד להניחו על התגובה הישירה של שריר השלד כויץ פעילות.
היחידה חיצוני עבור המרכז לאמנות עכשווית הוצג לראשונה על ידי טיילר, רייט12, פותחה עם שינויים12. בקיצור, היחידה מורכבת משלושה חלקים עיקריים: גלאי אינפרא-אדום זה ניתן להפעיל ולכבות כתוצאה מחשיפה אור אינפרא-אדום, גנרטור הדופק, מחוון הדופק (איור 1). עיצוב מפורט מעגל של היחידה ממריץ היה שתואר לעיל13. המאפיינים המפורטים של המרכז לאמנות עכשווית ניתן למצוא יותר עומק במספר של סקירת מאמרים14,15,16,17. בקצרה, פרוטוקול גירוי נועד להפעיל את שיתוק נפוצות בתדר נמוך (קרי, 10 הרץ), ואת השרירים innervated (השוקתי הקדמי [ת א], השריר פושט האצבעות הארוך [אדי]) נאלצים נכלל בחוזה מראש את משך הזמן (למשל, h 3-6). לאורך זמן, זה משמרות את השרירים הנ ל כדי הפנוטיפ אירובית יותר, הפגינו מעלייה ברמת צפיפות נימי18 והן תוכן מיטוכונדריאלי19,20,21. לכן, בשיטה זו הוא מודל מוכח לחקות חלק עיבודים אימון סיבולת גדולה תוך שרירי השלד של חולדות.
מאמר זה מציג הליך מפורט של הניתוח השרשה אלקטרודה לזירוז המרכז לאמנות עכשווית, כך החוקרים ניתן להחיל את המודל הזה בלימודיהם תרגיל. המרכז לאמנות עכשווית היא דוגמנית מעולה ללמוד מסלול הזמן של עיבודים השריר, ובכך לספק כלי יעיל עבור חקירת האירועים המולקולריים איתות השונים בשתי נקודות זמן מוקדם ומאוחר יותר בעקבות תחילת תרגיל אימונים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sprague Dawley Rat</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chronic contractile activity unit</td>
			<td>Home-made</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCA unit protective box (3.5 x 3.5 x 2.5 cm)</td>
			<td>Home-made</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Box should be made of opaque material or covered in an opague tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coin lithium ion batteries (3V)</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>CR2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medwire</td>
			<td>Leico Industries</td>
			<td>316SS7/44T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solder pin (socket)</td>
			<td>Digi-Key</td>
			<td>ED6218-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zonas porous tape</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson</td>
			<td>5104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture silk (Size 5)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>640G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture silk (Size 6)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>706G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved blunt scissor (11.5 cm Length)</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>14075-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved blunt scissor (15 cm Length)</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>14111-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate haemostatic forceps (16 cm Length)</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>06-0230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>11052-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless-steel rod (30 cm; 7mm diameter)</td>
			<td>Home-made</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Rod should have 5 mm slit in one end to hold the wire for tunneling under the skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clip applying forceps</td>
			<td>KLS Martin</td>
			<td>20-916-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staples (clips)</td>
			<td>Bbraun</td>
			<td>BN507R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal hooks/retractor</td>
			<td>Home-made</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine (500 mL)</td>
			<td>Rougier</td>
			<td>#NPN00172944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium</td>
			<td>Novopharm</td>
			<td>#DIN00872644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metacam</td>
			<td>Boehringer</td>
			<td>#DIN02240463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital multimeter (voltmeter)</td>
			<td>Soar Corporation</td>
			<td>ME-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED digital stroboscope</td>
			<td>Lutron Electronic Enterprise</td>
			<td>DT-2269</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of chronic stimulation to study contractile activity-induced rat skeletal muscle phenotypic adaptations

שרירי השלד הוא רקמה מאוד, כמו תכונותיו הביוכימי, פיזיולוגיים הם שינו באופן משמעותי בתגובה פעילות גופנית כרונית. לחקור את המנגנונים הבסיסית לגבי עיבודים שרירים שונים, מספר תרגיל פרוטוקולים כגון הליכון, גלגל ריצה ואימון שחייה היו בשימוש במחקרים בבעלי חיים. עם זאת, התרגיל אלה מודלים דורשים תקופה ארוכה של זמן כדי להשיג שרירים עיבודים, אשר עשוי להיות מוסדרים גם על ידי גורמים ההורמונאלית או נוירולוגיות, ובכך יגביל את היישומים שלהם ללמוד עיבודים הנוצרות על-ידי התכווצות של שרירים ספציפיים. גירוי עקיף בתדר נמוך (10 Hz) כדי לעודד פעילות כויץ כרונית (המרכז לאמנות עכשווית) שימש כמודל חלופי עבור תרגיל אימונים, כמו זה יכול בהצלחה להוביל עיבודים מיטוכונדריאלי שרירים תוך 7 ימים, עצמאית של גורמים מערכתית. מאמר זה מפרט את טכניקות ניתוחיות הדרוש כדי להחיל את הטיפול של המרכז לאמנות עכשווית שרירי השלד של חולדות, יישום נרחב בעתיד מחקרים.

אנחנו הראו כי פעילות כויץ כרונית (המרכז לאמנות עכשווית) הוא כלי יעיל לזירוז עיבודים מיטוכונדריאלי חיובית תוך שרירי השלד. חולדות נתון 7 ימים של המרכז לאמנות עכשווית (6 שעות לכל יום) להציג להן מיטוכונדריאלי משופרת בשריר מגורה לעומת hindlimb unstimulated contralateral (בקרה). עלייה זו להן מיטוכונדריאלי שציין ביטוי חלבון מוגברת של PGC-1α (איור 3 א), נחשב את הרגולטור הראשי של להן מיטוכונדריאלי, יחד עם הגבהים של חלבונים מיטוכונדריאלי מפתח אחרים קוקס-קוקס-IV, ואני אשר הם מרכיבים חשובים של רשת התחבורה אלקטרון. יתר על כן, ציטוכרום c אוקסידאז (קוקס) פעילות אנזים, מחוון שימושי של תוכן מיטוכונדריאלי, עלה כ-30% בעקבות 7 ימים של המרכז לאמנות עכשווית (איור 3B). בנוסף, אנחנו להעריך שינויים בתפקוד מיטוכונדריאלי באמצעות סיבי השריר permeabilized כדי למדוד את יכולת הנשימה מיטוכונדריאלי ומצא כי המרכז לאמנות עכשווית, גרמו לעלייה מרבית בדרכי הנשימה (קרי, מצב 3) קיבולת של שריר נתון 7 ימים של גירוי יחסי שליטה בשרירים (איור 3C). יתר על כן, שתי האוכלוסיות מיטוכונדריאלי, subsarcolemmal (הה) ו intermyofibrillar (קרן המטבע), גדל בעקבות 7 ימים של המרכז לאמנות עכשווית (איור 4A ו- B), ומצאנו שברים קרן המטבע של שריר נתון 7 ימים של חוסר פעילות. בצבע אדום שצבע יותר מאשר אלה נגזר לשריר שליטה (קון) באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית, ככל הנראה המציינת רמות גבוהות יותר של מיוגלובין, heme ורכיבים אחרים הקשורים לחמצן (איור 4C).
עיבודים autophagy, מערכות lysosomal יכול גם להיגרם על ידי המרכז לאמנות עכשווית. בפרט, הבחנו בעליה בשפע חלבונים גורם שעתוק EB (TFEB; איור 5A), הרגולטורים העיקריים של lysosomal להן, על ידי המרכז לאמנות עכשווית בכלל נקודות זמן (קרי, 1, 3 ו- 7 ימים), כמו גם סמנים lysosomal אחרים כגון חלבון ממברנלי lysosomal-הקשורים 1 (LAMP1; איור 5B). מעניין, המחקר שלנו מראה כי שינויים autophagy, mitophagy, lysosomal מערכות להתרחש לפני מיטוכונדריאלי להן.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56827/56827fig1.jpg"> איור 1. תרשים סכימטי מראה את המרכיבים העיקריים ממריץ המרכז לאמנות עכשווית נייד ההוראה איור זה שונה מטקהאשי. et al. 13. אינפרא-אדום, אינפרא-אדום. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56827/56827fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56827/56827fig2.jpg"> באיור 2. אלקטרודה, ממריץ ההשתלה. (א) חלון עבור חיבור חוטים משני צידי שיתוק נפוצות. (B) תמונה מופתית על הפגנת הרכבה של המרכז לאמנות עכשווית יחידה. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56827/56827fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56827/56827fig3.jpg"> איור 3. PGC-1alpha, נשימה מיטוכונדריאלי, פעילות אנזים עם המרכז לאמנות עכשווית- (א) המרכז לאמנות עכשווית גורם עיבודים מיטוכונדריאלי בשרירי השלד, כפי שמוצג על ידי העלאות רמות החלבון של PGC-1α. תמונת הנציגה חשופה מוצג יחד עם ß-אקטין פקד הטעינה. קון מתייחס שליטה, קרי, hindlimb contralateral לא נתון את המרכז לאמנות עכשווית, קיפול משנות נתונים הושג על-ידי נרמול תוצאות ביחס קון-1 יום. (B) קוקס פעילות ו- (ג) permeabilized שרירים הנשימות היו גם מוגברת 7 ימים הבאים של המרכז לאמנות עכשווית. כל הנתונים מוצג זאת אומרת ± SEM (N = 6-8). †P < 0.05, אפקט אינטראקציה בין המרכז לאמנות עכשווית לזמן; §P < 0.05, ההשפעה העיקרית של המרכז לאמנות עכשווית; P < 0.05, הבדל משמעותי לעומת שליטה-1 יום. איור 3 א ו- 3B שונו מ קים, הוד19. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56827/56827fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56827/56827fig4.jpg"> באיור 4. עדות להן מיטוכונדריאלי בשריר עם המרכז לאמנות עכשווית- (A ו- B) אלקטרון מיקרוסקופיות תמונות מצביעים על אמצעי אחסון מוגדל של subsarcolemmal (הה) והן המיטוכונדריה (קרן המטבע) intermyofibrillar בשרירי השלד של חולדות חשופים המרכז לאמנות עכשווית ב 7 ימים. תמונה זו שונתה מ Ljubicic et al. 21, וברים סולם עולה 1 מיקרומטר. א (ג) השוואה של שריר fractionations מיטוכונדריאלי בין שליטה (קון) ושרירים (המרכז לאמנות עכשווית) מגורה לאחר 7 ימים של המרכז לאמנות עכשווית גירוי. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56827/56827fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56827/56827fig5.jpg"> איור 5. מערכת lysosomal היא upregulated על ידי 7 ימים של המרכז לאמנות עכשווית- זה מסומן על ידי עלייה חלבון abundances TFEB () והן LAMP1 (B) . התוצאות מוצגות כפי מקפלים שינויים על ידי נרמול נתונים ביחס קון-1 יום. (ג) חשופה נציג תמונות מוצגות, GAPDH הוא פקד הטעינה. §P < 0.05, ההשפעה העיקרית של המרכז לאמנות עכשווית. כל הנתונים מוצג זאת אומרת ± SEM (N = 8); ¶P < 0.05, ההשפעה העיקרית של זמן; P < 0.05, הבדל משמעותי לעומת שליטה (קון)-1 יום. איור זה השתנה בין הוד וקים19. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56827/56827fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations at JoVE.com

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

פרוטוקול זה מתאר את השימוש של הדגם פעילות כויץ כרונית של תרגיל להתבונן הנוצרות על-ידי גירוי שרירי השלד עיבודים ב hindlimb החולדה.

יישום של גירוי כרוני ללמוד עיבודים פנוטיפי של שרירי השלד כויץ הנוצרות על-ידי פעילות עכברוש

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

application-chronic-stimulation-to-study-contractile-activity-induced

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.7K Views.  York University. פרוטוקול זה מתאר את השימוש של הדגם פעילות כויץ כרונית של תרגיל להתבונן הנוצרות על-ידי גירוי שרירי השלד עיבודים ב hindlimb החולדה.

Video: Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head and heart progenitor cell development with pharyngeal arches (also known as branchial arches) ex vivo. Using this method, we have recently described that the second pharyngeal arch contains self-renewing heart progenitors and serves as a microenvironment for expansion of the progenitors during mouse heart development. The progenitor cells remain undifferentiated and expansive inside the arch, but quickly become functional cardiomyocytes as they migrate out of the arch. We also reported that first pharyngeal arch contains muscle progenitors giving rise to myotubes after leaving the arch. Here, we demonstrate the procedure for the dissection and ex vivo culture of first and second pharyngeal arches from developing mouse embryos. The method enables one to study head and heart progenitor/muscle development, including cardiomyocyte and myotube formation in detail ex vivo.

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

אקס תרבות Vivo של בלוע קשתות לחקר תאי אב לב ושרירים והנישה שלהם

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

אינדוקציה של התחדשות שריר שלד החריף ידי Cardiotoxin הזרקה

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting occurs. Loss of muscle mass and function is associated with muscle fiber type atrophy, fiber type switching, defective muscle regeneration associated with dysfunction of satellite cells, muscle stem cells, and other pathophysiological processes. These changes are associated with changes in intracellular as well as local and systemic niches. In addition to most commonly used rodent models of muscle ageing, there is a need to study muscle homeostasis and wasting using human models, which due to ethical implications, consist predominantly of in vitro cultures. Despite the wide use of human Myogenic Progenitor Cells (MPCs) and primary myoblasts in myogenesis, there is limited data on using human primary myoblast and myotube cultures to study molecular mechanisms regulating different aspects of age-associated muscle wasting, aiding in the validation of mechanisms of ageing proposed in rodent muscle. The use of human MPCs, primary myoblasts and myotubes isolated from adult and aged people, provides a physiologically relevant model of molecular mechanisms of processes associated with muscle growth, atrophy and regeneration. Here we describe in detail a robust, inexpensive, reproducible and efficient protocol for the isolation and maintenance of human MPCs&#160;and their progeny&#160;&#8212; myoblasts and myotubes from human muscle samples using enzymatic digestion. Furthermore, we have determined the passage number at which primary myoblasts from adult and aged people undergo senescence in an in vitro culture. Finally, we show the ability to transfect these myoblasts and the ability to characterize their proliferative and differentiation capacity and propose their suitability for performing functional studies of molecular mechanisms of myogenesis and muscle wasting in vitro.

This protocol describes a robust, reproducible and simple method of isolation and culture of myoblast progenitor cells from the skeletal muscle of adult and aged people. The muscles used here include foot and leg muscles. This approach enables the isolation of an enriched population of primary myoblasts for functional studies.

הכנה והתרבות של תאים מבשר myogenic / ראשי myoblasts מן שרירי השלד של מבוגר ובני אדם בני

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and pathological processes, such as cancer and ageing. Recently, senescence has also been implicated in tissue repair and regeneration. Therefore, it has become increasingly critical to identify senescent cells in vivo. Senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) assay is the most widely used assay to detect senescent cells both in culture and in vivo. This assay is based on the increased lysosomal contents in the senescent cells, which allows the histochemical detection of lysosomal &#946;-galactosidase activity at suboptimum pH (6 or 5.5). In comparison with other assays, such as flow cytometry, this allows the identification of senescent cells in their resident environment, which offers valuable information such as the location relating to the tissue architecture, the morphology, and the possibility of coupling with other markers via immunohistochemistry&#160;(IHC). The major limitation of the SA-&#946;-Gal assay is the requirement of fresh or frozen samples.
Here, we present a detailed protocol to understand how cellular senescence promotes cellular plasticity and tissue regeneration in vivo. We use SA-&#946;-Gal to detect senescent cells in the skeletal muscle upon injury, which is a well-established system to study tissue regeneration. Moreover, we use&#160;IHC to detect Nanog, a marker of pluripotent stem cells, in a transgenic mouse model. This protocol enables us to examine and quantify cellular senescence in the context of induced cellular plasticity and in vivo reprogramming.

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Here we present a detailed protocol to detect both senescent and pluripotent stem cells in the skeletal muscle upon injury while inducing in vivo reprogramming. This method is suitable for evaluating the role of cellular senescence during tissue regeneration and reprogramming in vivo.

הערכה של פציעה-induced הזדקנות ביולוגית, In Vivo התכנות בשריר השלד

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

זיהוי של שרירי השלד תאים הלוויין על-ידי Immunofluorescence עם Pax7 ו- Laminin נוגדנים

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

בדור חוץ גופית של Somite נגזרים מן האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal muscle. Mouse skeletal muscle has been shown to produce high quality X-ray diffraction patterns on third generation synchrotron beamlines providing an opportunity to link changes at the level of the genotype to functional phenotypes in health and disease by determining the structural consequences of genetic changes. We present detailed protocols for preparation of specimens, collecting the X-ray patterns and extracting relevant structural parameters from the X-ray patterns that may help guide experimenters wishing to perform such experiments for themselves.

We present detailed protocols for performing small-angle X-ray diffraction experiments using intact mouse skeletal muscles. With the wide availability of transgenic mouse models for human diseases, this experimental platform can form a useful test bed for elucidating the structural basis of genetic muscle diseases

צילום רנטגן של שריר השלד Murine שלמים ככלי לחקר בסיס מבניים של מחלת שרירים

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle regenerative process. There are recognized challenges to working with human primary adult stem cells, particularly human muscle progenitor cells (hMPCs) derived from skeletal muscle biopsies, including low cell yield from collected tissue and a large degree of donor heterogeneity of growth and death parameters among cultures. While incorporating heterogeneity into experimental design requires a larger sample size to detect significant effects, it also allows us to identify mechanisms that underlie variability in hMPC&#160;expansion capacity, and thus allows us to better understand heterogeneity in skeletal muscle regeneration. Novel mechanisms that distinguish the expansion capacity of cultures have the potential to lead to the development of therapies to improve skeletal muscle regeneration.

We present techniques for isolating, culturing, characterizing, and differentiating human primary muscle progenitor cells (hMPCs) obtained from skeletal muscle biopsy tissue. hMPCs obtained and characterized through these methods can be used to subsequently address research questions related to human myogenesis and skeletal muscle regeneration.

בידוד, תרבות, אפיון, והבידול של תאים האדם שריר ביופסיה של השלד שרירי השגרה נוהל

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this failure is the use of inadequate laboratory models. It is challenging to model complex human diseases in traditional laboratory organisms, but this issue can be circumvented through the study of human xenografts. The surgical method we describe here allows for the creation of human skeletal muscle xenografts, which can be used to model muscle disease and to carry out preclinical therapeutic testing. Under an Institutional Review Board (IRB)-approved protocol, skeletal muscle specimens are acquired from patients and then transplanted into NOD-Rag1null IL2r&gamma;null (NRG) host mice. These mice are ideal hosts for transplantation studies due to their inability to make mature lymphocytes and are thus unable to develop cell-mediated and humoral adaptive immune responses. Host mice are anaesthetized with isoflurane, and the mouse tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles are removed. A piece of human muscle is then placed in the empty tibial compartment and sutured to the proximal and distal tendons of the peroneus longus muscle. The xenografted muscle is spontaneously vascularized and innervated by the mouse host, resulting in robustly regenerated human muscle that can serve as a model for preclinical studies.

Complex human diseases can be challenging to model in traditional laboratory model systems. Here, we describe a surgical approach to model human muscle disease through the transplantation of human skeletal muscle biopsies into immunodeficient mice.

ביצוע שריר השלד האנושי Xenografts בעכברים חיסוני

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...