מחקרים שנעשו בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות שנקבעו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים, שימוש הוועדה של טקסס A & ז אוניברסיטת. סקירה ואישור הממונה על הבטיחות הביולוגי או ועדה במוסד שלך עשוי להידרש.
שים לב: כל ההליכים דורשים BSL3 הבלימה. אנשי נדרשים ללבוש ציוד מגן אישי בכל עת. כל המניפולציות מבוצעים בפנים אבטחה הקבינט (BSC) ואת כל שרפ יושלכו בצורה במיכלים שרפ. משטחי עבודה, BSC מנוקים עם אתנול פנול ו- 70% במאגר לפני ביצוע העבודה, אחרי העבודה. הליכים בדרך כלל ייעשה ברמה אבטחה 3 עם שחפת Mycobacterium, אך עבור איור ומטרות הצילומים, המחברים מדגימים הליכים אלה ברמת אבטחה 2 עם חיידקים פחות ארסית.
1. זנים, תרבות תנאים
הערה: מ. שחפת זן CDC1551 נעשה שימוש במחקר זה, אך כל זן מ. שחפת יכול לשמש באופן זהה.
<ol><li>לגדל את החיידקים ב- M-OADC-TW (7 שעות 9 מרק בתוספת גליצרול 0.5%, 10% חומצה אולאית דקסטרוז מורכבים ללא קטלאז, 0.05% Tween-80) בינוני שעומדים 37 ° C עד יתר600 של 0.5 (~ 0.2 x 107 CFU).</li>
	<li>לדלל את התרבות ב- M-OADC-TW (סדרה של 1:10 דילולים של החיידק). לוחית רישוי של דילולים של החיידקים (105, 106, 107, 108) דולר על גבי צלחות 11 סלקטיבי של 7 שעות כדי לאפשר קביעת CFU.</li>
	<li>דגירה הצלחות במשך ארבעה שבועות ב 37 מעלות צלזיוס, או עד מושבות ניתן לספור במדויק.</li>
	<li>Centrifuge את inoculum חיידקי ב g x 8,534 במשך 5 דקות כדי להשיג גלולה. לשטוף את גלולה פעם אחת עם 10 מ"ל של תמיסת מלח (0.9% NaCl) ו מחדש להשעות את צניפה ב 15 מ"ל של תמיסת מלח (0.9% NaCl).</li>
</ol>2. תרסיס זיהום של עכברים באמצעות תא מדיסון
<ol><li>לאפשר עכברים כדי להתאקלם הסביבה החדשה לשבוע.</li>
	<li>שוקלים העכברים לפני טעינת אותם אל החדר.</li>
	<li>לחבר מיתרי שלוש לתוך רצועת הכוח: הכוח בחלל המרכזי, את משאבת ואקום, מדחס אוויר, לפי הסדר הזה.</li>
	<li>בזהירות להתיר את צנצנת הזכוכית. להביא את צנצנת הזכוכית אבטחה ארון ולהוסיף את inoculum אתגר הושעו ב 15 מ"ל של תמיסת מלח (0.9% NaCl) כדי להשיג ~ 104 - 106 CFU של חיידקים בתוך הריאות.</li>
	<li>סגור את מכסה צנצנת הזכוכית ב אבטחה הקבינט. לצרף את הצנצנת יחידת מפוחים ולהתאים את צינור נירוסטה אנכי כך הקצה התחתון (צריכת) הוא כרבע סנטימטר מתחת לגובה של הנוזל בצנצנת.</li>
	<li>לטעון את כל החיות לצורך הניסוי (החדר יכול להחזיק עכברים עד 90) אל החדר וסגור את כל הבריחים בדלת.</li>
	<li>בדוק הראשי (חדר) מד זרימת אוויר. ודא כי במרכז הבמה (כדור) מפעילה כ 50 ליטר/דקה כפי שנמדד בסולם בצד השמאל.</li>
	<li>לחץ על כפתור התחל בלוח הבקרה של התא. הגדר את קצב זרימת האוויר דרך המונה זרימת האוויר מדחס (המונה קטן בפינה השמאלית) 4 L/min בסולם. בדוק חזותית כדי לוודא כי הוא להיות nebulized inoculum האתגר.</li>
	<li>לאחר 15 דקות, כאשר מופיע האור האדום בחזית של לוח הבקרה אות נשמע מציין את סוף המרוץ, לחץ לחצן איפוס בפינה הימנית התחתונה של החלונית ' בקרה ' כדי לאפס את הטיימרים.</li>
	<li>החזק את לחצן אדום קטן על הדלת של החדר כדי לשחרר את הואקום.</li>
	<li>פתח את הדלת קאמרית ולהסיר את החיות. הצב והעכברים בחזרה לתוך הכלובים.</li>
	<li>הסר את צנצנת הזכוכית מפוחים ומניחים במיכל אטום, עמיד בפני נזילה תחבורה. הכנס את המיכל בפנים הארון ביולוגית ולמחוק את המתלים אתגר לתוך מיכל פסולת המיועדת.</li>
	<li>מניחים את הצנצנת מפוחים בשימוש בתוך שקית חומרים מסוכנים, לסגור את השקית על התחבורה החיטוי.</li>
	<li>בסוף ההליך זיהום, לרסס הפנימי של החדר עם אתנול פנול ו- 70% במאגר ומאפשרים לתא לשבת 10 דקות.</li>
	<li>לאחר מכן, נגב את כל משטחי הפנים נגיש באופן יסודי ביותר. היפטרו מכל מגבות נייר מזוהמים, וכו '. בפח האשפה חומרים מסוכנים. אוטוקלב האשפה, פסולת מיכל ומשמשת מפוחים צנצנות.</li>
	<li>מקם את החיות בחדר ההכלה עד נקודת-הזמן הדמיה.</li>
	<li>ביום הדמיה, העברת החיות במיכל משני לחדר ההדמיה.</li>
</ol>3. בעלי חיים הרדמה
<ol><li>עזים ומתנגד העכברים עם איזופלוריין באמצעות מערכת אישית גז הרדמה.</li>
	<li>שוקלים כל אחד המיכל מסנן פחם שני הממוקמת על גבי יחידת הרדמה.</li>
	<li>החלף מיכל חדש אם המשקל הוא 50 גרם מעל המשקל ההתחלתי.</li>
	<li>בדוק את יחידת מכשיר אידוי כדי להבטיח איזופלוריין מספיק עבור ההליך.</li>
	<li>הצב בעל האף חרוט בתוך החדר הדמיה. מספר של הקונוסים האף הנדרש לקבלת ההליך, לסגור את הפתחים שנותרו עם חוסמי האף חרוט.</li>
	<li>להפעיל את אספקת החמצן מן הגליל בלחץ גבוה ולהגדיר אותו בבית 55 psi.</li>
	<li>תדליק את המשאבה פינוי ממוקם מול יחידת הרדמה ולהגדיר אותו 8 L/min.</li>
	<li>הפעל את דו-מצבי של חמצן ממוקם מול יחידת הרדמה.</li>
	<li>הפעל זרימת הגז אל התא אינדוקציה הרדמה יפעילו זרימת גז על 1.5 ליטר לדקה להפוך זרימת הגז.</li>
	<li>הפעל זרימת הגז לחדר ההדמיה יפעילו זרימת גז על 0.25 L לדקה להפוך זרימת הגז.</li>
	<li>הפעל את מכשיר אידוי איזופלוריין ולהגדיר אותו ב- 2-2.5%. התאם את רמת איזופלוריין בהתאם למספר ואת המשקל של חיות המשמשות את הניסוי על-ידי סיבוב החוגה על מכשיר אידוי איזופלוריין (2-2.5% לעכבר השוקל ~ 20 g; 4% עבור שפן במשקל של 300 גרם).</li>
	<li>מקום העכברים בבית הבליעה הרדמה, סגור את המכסה. הפעל זרימת הגז אל התא אינדוקציה הרדמה.</li>
	<li>יוצאים העכברים בבית הבליעה אינדוקציה הרדמה למשך 5-10 דקות עד מורדם לחלוטין.</li>
	<li>ברגע העכברים הם מרדימים, להחיל משחה אופטי לעיניים כדי להגן עליהם תוך הדמיה.</li>
	<li>מקום העכברים recumbency הגחוני או בחזה ובצלעות כך אפם מוצבים בתוך אצטרובל האף כדי להקל על הרדמה של עכברים במהלך ההליך הדמיה.</li>
</ol>4. כתב אנזים קרינה פלואורסצנטית (שופט) הדמיה
<ol><li>להזריק את המצע (20 מיקרומטר, 2.5 µL/גר' משקל) על ידי הזרקת בקרום הבטן לתוך הנגועים, כמו גם בקרת עכברים. העכברים הם תחת הרדמה בתוך החדר הדמיה עבור פחות מ- 1 דקות.</li>
	<li>להפעיל את מערכת הדמיה.</li>
	<li>לאתחל את המערכת על ידי לחיצה על אתחל. המתן עד הבר טמפרטורה הופך לירוק. הערה: תא הדמיה מורכבת פלטפורמה מחומם כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של החיה בזמן ההדמיה.</li>
	<li>הדמיה רכישה הגדרה, בחר פלורסנט | טרנס-תאורה עבור כל החיה או אפינפרין-תאורה בשביל לרקמות ריאות, המבנה של כיסוי בלוח הבקרה רכישה.</li>
	<li>הגדר שדה ראייה B עבור עכבר אחת ורמת מנורה גבוהה.</li>
	<li>להגדיר זמן חשיפה אוטומטית, binning בינוני, 2-3 f/להפסיק, שיטות עירור במסנן ב nm 745 ומסננים פליטה 780 nm 840 ננומטר.</li>
	<li>עבור התקנת רצף, לחץ על רצף ההתקנה, בחר 9-12 נקודות הטרנס-תאורה באזור הריאה.</li>
	<li>לחץ על ייבוא עבור רכישת התמונה.</li>
	<li>הנח את העכבר בחזרה לתוך כלוב ההדמיה שלאחר.</li>
	<li>לפקח על העכברים עד החלים לחלוטין או להקריב עבור לכימות CFU אם הדמיה ב נקודת הזמן של הניסוי. לבצע ניקוד Karnofsky ששונה כדי לפקח לרווחתם של עכברים פוסט-הדמיה.</li>
</ol>5. ניתוח של שופט הדמיה
<ol><li>פתח את תוכנת הדמיה.</li>
	<li>לטעון קבצי תמונה על-ידי לחיצה על עיון סמל.</li>
	<li>עבור unmixing ספקטרלי, לחץ על הפירוק הספקטרלי Unmixing הצבעים כלי ולחץ על ספקטרום הנדרש כדי unmix. לחץ על התחל unmixing.</li>
	<li>שיקום משטח אופטי, לחץ על השטח הטופוגרפי.</li>
	<li>בחר כיוון כדי הגבי, בכפוף פרווה העכבר, לחץ על פני שטח של צור.</li>
	<li>לצייר תמונה חיתוך ולהגדיר סף תמונה עבור אזור של עניין. לחץ על בוצע.</li>
	<li>לרישום איברים, עבור אל הכרטיסיה רישום תלת-ממד בתפריט הנפתח כלים אופטי.</li>
	<li>הירשם איברים עניין באטלס איברים.</li>
	<li>התאם גודל איבר או מיקום הטופוגרפיה משטח שנוצרו באמצעות הכלי שינוי צורה/ביטול ממוקם על הכלים לוח רישום.</li>
	<li>ללכת טומוגרפיה פלורסנט (פליט) שחזור תלת-ממד, ולנתח בחר בכרטיסיית בחר את התמונות כדי להיכלל לניתוח, תמונה סוג ליעילות פלורסצנטיות שידור מנורמל (NTF), לחץ על התחל.</li>
	<li>לבדוק כל בחירה, לשחזר בכרטיסיה תצוגה מקדימה של נתונים.</li>
	<li>על ידי קרינה פלואורסצנטית כימות, ללכת לכלים של אזור ריבית (ROI), להוסיף קוביה רועי האיבר עניין, להתאים את גודל הקוביה כדי לכסות את האיבר של עניין. לחץ על מדוד ROIs תלת-ממד.</li>
	<li>בחלון המידות רועי, ללכת למדידות רועי תלת-ממדיים, בחר סוג נתונים מקור יחידת voxels ומדידות pmolM-1ס מ-1.</li>
	<li>שמירה ו/או לייצא את התוצאה של פליט ניתוח שחזור תלת-ממד לקובץ נתונים או איור.</li>
</ol>6. כימות של חיידקים על ידי CFU
<ol><li>המתת חסד העכברים מאת בקרום הבטן הזרקת סודיום פנטוברביטל 0.1 מ"ל (390 מ"ג/מ"ל).</li>
	<li>בדוק אם פדלים רפלקס לוחצת את רפידות של כפות הרגליים של עכברים כדי להבטיח שאין תגובה רפלקס.</li>
	<li>Explant רקמת הריאה מן העכברים באמצעות מלקחיים סטרילי ומספריים. Homogenize רקמת הריאה ב 1 מ"ל של 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).</li>
	<li>להפוך דילולים טורי 10-fold של homogenate הריאה עקר 1 x PBS.</li>
	<li>עבור ציפוי, במקום שלוש aliquots של 20 µL כל של דילול בהתאמה על הצלחת אגר.</li>
	<li>דגירה הלוחות באינקובטור 37 ° C, צג לצמיחה בקטריאלי.</li>
	<li>ספירת מושבות בכל נקודה לאחר זמן הדגירה ולבטא כמו CFU / mL על-ידי תיקון עבור אמצעי אחסון ודילול באמצעות המשוואה הבאה: CFU / מ"ל = (C/V) x-M איפה C = המושבה ספירות לכל מקום, V = אמצעי אחסון מדגם מחוסן על כל צלחת (mL) ו- M = פקטור הכפלה (הדדיים של הדילול בשימוש). הערה: אם המושבות 11 נספרות במקום אחד עבור נפח דגימה של 0.002 מ"ל לדילול מדגם של 10-4, באמצעות המשוואה, הרוזן המושבה יחושבו כפי (11/0.02) x 104 = 5.5 x 106 CFU / mL</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lewinson, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Official+American+thoracic+society/infectious+diseases+society+of+America/+centers+for+disease+control+and+prevention+clinical+practice+guidelines:+diagnosis+of+tuberculosis+in+adults+and+children.">Official American thoracic society/infectious diseases society of America/ centers for disease control and prevention clinical practice guidelines: diagnosis of tuberculosis in adults and children.</a> Clin Infect Dis. 64 (2), 1-33 (2017).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensititre+MYCOTB+MIC+plate+for+testing+Mycobacterium+tuberculosis+susceptibility+to+first-+and+second-line+drugs.">Sensititre MYCOTB MIC plate for testing Mycobacterium tuberculosis susceptibility to first- and second-line drugs.</a> Antimicrob Agents Ch. 58 (1), 11-18 (2014).</li><li>Dheda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology,+pathogenesis,+transmission,+diagnosis,+and+management+of+multidrug-resistant,+extensively+drug-resistant,+and+incurable+tuberculosis.">The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis.</a> Lancet Resp Med. 5 (4), 291-360 (2017).</li><li>Behr, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+Mycobacterium+tuberculosis+from+patients+smear-negative+for+acid-fast+bacilli.">Transmission of Mycobacterium tuberculosis from patients smear-negative for acid-fast bacilli.</a> Lancet. 353 (9151), 444-449 (1999).</li><li>Cruz, A. T., Revell, P. A., Starke, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastric+aspirate+yield+for+children+with+suspected+pulmonary+tuberculosis.">Gastric aspirate yield for children with suspected pulmonary tuberculosis.</a> J Pediatric Infect Dis Soc. 2 (2), 171-174 (2013).</li><li>Monkongdee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yield+of+acid-fast+smear+and+mycobacterial+culture+for+tuberculosis+diagnosis+in+people+with+human+immunodeficiency+virus.">Yield of acid-fast smear and mycobacterial culture for tuberculosis diagnosis in people with human immunodeficiency virus.</a> Am J Resp Crit Care. 180, 903-908 (2009).</li><li>Karstaedt, A. S., Jones, N., Crewe-Brown, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacteriology+of+pulmonary+tuberculosis+in+a+population+with+high+human+immunodeficiency+virus+seroprevalence.">The bacteriology of pulmonary tuberculosis in a population with high human immunodeficiency virus seroprevalence.</a> Int J Tuberc Lung D. 2 (4), 312-316 (1998).</li><li>Yang, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+Mycobacterium+tuberculosis,+using+a+novel+near-infrared+fluorescent+substrate.">Real-time imaging of Mycobacterium tuberculosis, using a novel near-infrared fluorescent substrate.</a> J Infect Dis. 215 (3), 405-414 (2017).</li><li>Nooshabadi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+excitation+increases+detection+sensivity+for+pulmonary+tuberculosis+by+whole-body+imaging+with+&#946;-lactamase+reporter+enzyme+fluorescence.">Intravital excitation increases detection sensivity for pulmonary tuberculosis by whole-body imaging with &#946;-lactamase reporter enzyme fluorescence.</a> J Biophotonics. , (2016).</li><li>Chang, M. H., Cirillo, S. L. G., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+luciferase+to+image+bacterial+infections+in+mice.">Using luciferase to image bacterial infections in mice.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li><li>Kong, Y., Subbian, S., Cirillo, S. L. G., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+optical+imaging+to+study+of+extrapulmonary+spread+by+tuberculosis.">Application of optical imaging to study of extrapulmonary spread by tuberculosis.</a> Tuberculosis. 89 (1), 15-17 (2009).</li><li>Andreu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+in+vivo+assessment+of+drug+efficacy+against+Mycobacterium+tuberculosis+using+an+improved+firefly+luciferase.">Rapid in vivo assessment of drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis using an improved firefly luciferase.</a> J Antimicrob Chemoth. 68 (9), 2118-2127 (2013).</li><li>Andreu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+bioluminescent+reporters+for+use+with+Mycobacteria.">Optimisation of bioluminescent reporters for use with Mycobacteria.</a> PLoS ONE. 5 (5), 10777 (2010).</li><li>Nooshabadi, F., Yang, H. Y., Bixler, J. N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Maitland, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+fluorescence+excitation+in+whole-animal+optical+imaging.">Intravital fluorescence excitation in whole-animal optical imaging.</a> PLoS ONE. 11 (2), 0149932 (2016).</li><li>Bixler, J. N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Matiland, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-scale+fluorescence+imaging+of+bacterial+infections+in+animal+models.">Multi-scale fluorescence imaging of bacterial infections in animal models.</a> Proc. SPIE 8565, Photonic Therapeut Diagnos IX. , 856537 (2013).</li><li>Mufti, N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Maitland, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+bacterial+infection+with+a+fiber+optic+microendoscope.">Detection of bacterial infection with a fiber optic microendoscope.</a> Proc. SPIE 8092, Med Laser Appl Laser-tissue Interac V. , 80920A (2011).</li><li>Zelmer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+vivo+model+to+test+anti-tuberculosis+drugs+using+fluorescence+imaging.">A new in vivo model to test anti-tuberculosis drugs using fluorescence imaging.</a> J Antimicrob Chemoth. 67 (8), 1948-1960 (2012).</li><li>Yang, D., Ding, F., Mitachi, K., Kurosu, M., Lee, R. E., Kong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescent+probe+for+detecting+Mycobacterium+tuberculosis+and+identifying+genes+critical+for+cell+entry.">A fluorescent probe for detecting Mycobacterium tuberculosis and identifying genes critical for cell entry.</a> Front. Microbiol. 7, (2016).</li><li>Ordonez, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Model+of+pulmonary+cavitary+tuberculosis+and+expression+of+matrix+metalloproteinase-9.">Mouse Model of pulmonary cavitary tuberculosis and expression of matrix metalloproteinase-9.</a> Dis Model Mech. 9, 778-779 (2016).</li><li>Mills, B., Bradley, M., Dhaliwal, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+bacterial+infections.">Optical imaging of bacterial infections.</a> Clin Transl Imaging. 4, 163-174 (2016).</li><li>Calderon, V., Valbuena, G., Goez, Y., Endlsey, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+humanized+mouse+model+of+tuberculosis.">A humanized mouse model of tuberculosis.</a> PLoS ONE. 8 (5), 63331 (2013).</li><li>Vergne, I., Chua, J., Lee, H. H., Lucas, M., Belisle, J., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+phagolysosome+biogenesis+block+by+viable+Mycobacterium+tuberculosis.">Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis.</a> P Natl Acad Sci Usa. 102 (11), 4033-4038 (2004).</li><li>Kong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tuberculosis+with+endogenous+&#946;-+lactamase+reporter+enzyme+fluorescent+in+live+mice.">Imaging tuberculosis with endogenous &#946;- lactamase reporter enzyme fluorescent in live mice.</a> P Natl Acad Sci Usa. 107 (27), 12239-12244 (2010).</li><li>Kong, Y., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporter+enzyme+fluorescence+(REF)+imaging+and+quantification+of+tuberculosis+in+live+animals.">Reporter enzyme fluorescence (REF) imaging and quantification of tuberculosis in live animals.</a> Virulence. 1 (6), 558-622 (2010).</li><li>Skoura, E., ZumLa, A., Bomanji, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+tuberculosis.">Imaging in tuberculosis.</a> Int J Infect Dis. 32, 87-93 (2015).</li><li>Lee, K. S., Im, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CT+in+adults+with+tuberculosis+of+the+chest:+characteristic+findings+and+role+in+management.">CT in adults with tuberculosis of the chest: characteristic findings and role in management.</a> Am J Roentgenol. 164, 1361-1367 (1995).</li><li>Hoffman, E. B., Crosier, J. H., Cremin, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+children+with+spinal+tuberculosis.+A+comparison+of+radiography,+computed+tomography+and+magnetic+resonance+imaging.">Imaging in children with spinal tuberculosis. A comparison of radiography, computed tomography and magnetic resonance imaging.</a> J Bone Joint Surg Br. 75 (2), 233-239 (1993).</li><li>Soussan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+pulmonary+tuberculosis+on+FDG-PET/CT.">Patterns of pulmonary tuberculosis on FDG-PET/CT.</a> Eur J Radiol. 81 (10), 2872-2876 (2012).</li><li>Sule, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+directions+using+reporter+enzyme+fluorescence+(REF)+as+a+tuberculosis+diagnostic+platform.">New directions using reporter enzyme fluorescence (REF) as a tuberculosis diagnostic platform.</a> Tuberculosis. 101, 78-82 (2016).</li><li>Heuts, F., Carow, B., Wigzell, H., Rottenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+non-invasive+bioluminescent+imaging+to+assess+mycobacterial+dissemination+in+mice,+treatment+with+bactericidal+drugs+and+protective+immunity.">Use of non-invasive bioluminescent imaging to assess mycobacterial dissemination in mice, treatment with bactericidal drugs and protective immunity.</a> Microbes Infect. 11 (14-15), 1114-1121 (2009).</li><li>Kong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+fluorescent+protein+expressing+strains+to+evaluation+of+anti-tuberculosis+therapeutic+efficacy+in+vitro+and+in+vivo.">Application of fluorescent protein expressing strains to evaluation of anti-tuberculosis therapeutic efficacy in vitro and in vivo.</a> PLoS ONE. 11 (3), 0149972 (2016).</li><li>Xie, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+point-of-care+detection+of+the+tuberculosis+pathogen+using+a+BlaC-specific+fluorogenic+probe.">Rapid point-of-care detection of the tuberculosis pathogen using a BlaC-specific fluorogenic probe.</a> Nature Chem. 4, 802-809 (2012).</li><li>Nooshabadi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-animal+imaging+of+bacterial+infection+using+endoscopic+excitation+of+&#946;-lactamase+(BlaC)-+specific+fluorogenic+probe.">Whole-animal imaging of bacterial infection using endoscopic excitation of &#946;-lactamase (BlaC)- specific fluorogenic probe.</a> Proc SPIE. 9715, 97150 (2016).</li><li>Ghiasi, M., Pande, T., Pai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+tuberculosis+diagnostics.">Advances in tuberculosis diagnostics.</a> Curr Trop Med Rep. 2 (2), 54-61 (2015).</li><li>Rao, J., Andrasi, A. D., Yao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+in+vivo:+recent+advances.">Fluorescence imaging in vivo: recent advances.</a> Curr Opin Biotech. 18 (1), 17-25 (2007).</li><li>Marshall, M. V., Draney, D., Sevick-Muraca, E. M., Olive, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-dose+intravenous+toxicity+study+of+IRDye+800CW+in+Sprague-Dawley+rats.">Single-dose intravenous toxicity study of IRDye 800CW in Sprague-Dawley rats.</a> Mol Imaging Biol. 12 (6), 583-594 (2010).</li><li>Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+tuberculosis+in+translational+and+precision+medicine.">Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine.</a> Front Microbiol. 8, 717 (2017).</li><li>Rao, J., Xie, H., Cheng, Y., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2,7-disubstituted+cephalosporin+derivatives+as+beta-lactamase+substrates+and+methods+for+their+use+for+the+diagnosis+of+tuberculosis.">2,7-disubstituted cephalosporin derivatives as beta-lactamase substrates and methods for their use for the diagnosis of tuberculosis.</a> US patent. , (2015).</li><li>Shao, Q., Zheng, Y., Dong, X., Tang, K., Yan, X., Xing, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Covalent+Reporter+of+&#946;-Lactamase+Activity+for+Fluorescent+Imaging+and+Rapid+Screening+of+Antibiotic-Resistant+Bacteria.">A Covalent Reporter of &#946;-Lactamase Activity for Fluorescent Imaging and Rapid Screening of Antibiotic-Resistant Bacteria.</a> Chem Eur J. 19 (33), 10903-10910 (2013).</li><li>Li, L., Li, Z., Shi, W., Li, X., Ma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+and+Selective+Near-Infrared+Fluorescent+Off-On+Probe+and+Its+Application+to+Imaging+Different+Levels+of+&#946;-Lactamase+in+Staphylococcus+aureus.">Sensitive and Selective Near-Infrared Fluorescent Off-On Probe and Its Application to Imaging Different Levels of &#946;-Lactamase in Staphylococcus aureus.</a> Anal Chem. 86 (12), 6115-6120 (2014).</li><li>Ashizawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexistence+of+lung+cancer+and+tuberculoma+in+the+same+lesion:+demonstration+by+high+resolution+and+contrast-enhanced+dynamic+CT.">Coexistence of lung cancer and tuberculoma in the same lesion: demonstration by high resolution and contrast-enhanced dynamic CT.</a> BRIT J RADIOL. 77 (923), 959-962 (2004).</li><li>Figueroa, C. J., Riedel, E., Glickman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+radiographic+differentiation+of+lung+nodules+caused+by+mycobacteria+and+lung+cancer:+a+case-control+study.">Clinical and radiographic differentiation of lung nodules caused by mycobacteria and lung cancer: a case-control study.</a> BMC Infect Dis. 15 (482), (2015).</li></ol>

בעת שימוש בטכניקות דימות, כגון REF, יש מפתח אסטרטגיות המאפשרות יצירה של נתונים חזקים ועקביים. הדמיה אופטית מייצרת אור הפזורים ברקמות אשר יכולים להשפיע את עומק החדירה, מאז זה קשה ללכוד את האור הנפלטת מכל הכיוונים. שימוש של fluorophore ליד אינפרא-אדום (ניר) המצע עבור REF הדמיה שיש גל של עירור, פליטה Querange של 700-900 ננומטר מקלה על הספיגה מינימלית של האות פלורסנט מאת בתרבית של רקמות. המצע מעוצב מותאם אישית נבנה על-ידי קישור של ניר fluorophore, IRDye 800Cw כ'חטיף, IRDye QC-1, על ידי טבעת לקטם ומאפשר פלורסצנטיות תהודה אנרגיה מבוססת על העברת שכבתה. IRDye יש חדירה מצוינת רקמת אור פיזור המאפיינים ואת אין כל השפעה מזיקה ניכר על יונקים36, פינה ממחזור הדם, באיברים מאת h 24 פלורסצנטיות אות משמעותית מגדיל מתחיל 4 שעות לאחר המצע מינהל, להגיע מקסימלי רמות 6 שעות לאחר ניהול.
מינון זיהומית חיידקית, מצב של מינהל במינון זיהומיות ואת המצע, כמו גם בזמן נקודות של הדמיה פוסט זיהום על-ידי ביצוע מחקרים טייס צריך להיות מוגדר לפני היציאה ניסויים גדולים ומורכבים,. יכול לימודי טייס לצמצם במידה ניכרת של זמן ועלות כאשר הדמיה מספר גדול של בעלי חיים כי תהליך סטנדרטי ניתן למטב לפני הניסוי מפתח. המון חיידקים צריך להיות נחוש ברקמות/האיברים עניין בעקבות כל הגוף הדמיה באמצעות הטרנס-תאורה ו- ex-vivo ריאות הדמיה באמצעות epi-תאורה כדי לאמת את מקור האות, לקבוע את איכות המתאם עם מספרים חיידקי נוכח8. לימודי טייס יספקו תובנה הסף של זיהוי, טווח דינמי של הטכניקה, כמו גם קביעת התנאים ניסיוני אופטימלית עבור הדמיה.
היתרונות העיקריים של שימוש REF הדמיה כמו בהשוואה אסטרטגיות זוהרים פלורסנט אחרים הם שלה רגישות גבוהה ויכולת תמונה טבעית מ. שחפת זנים. REF הדמיה מנצל את האנזים catalytically חזקים BlaC זה כולו כל מבודד קלינית מ. שחפת , שחפת-מתחם זנים. הרגישות הגדולה של שופט הדמיה הוא שיעור קטליטי מהירה BlaC בשילוב עם השמירה של המוצר פלורסנט cleaved התא המארח. אות ללא הרף עולה ככל המצע זמין וכתוצאה מכך הצטברות כמעט בלתי מוגבל של האות בתוך תאים נגועים, רקמות. רגישות מוגברת זו של שופט הדמיה לעומת גישות אלטרנטיביות הדמיה מאפשר זיהוי ספציפי של מ. שחפת בשני במבחנה ויוו8,23,24, 29.
REF הדמיה ניתן לגילוי חיידקי בלי שינויים גנטיים המאפשרים יישומו ישירה לכל זיהום מודל, מעבדה חיות8,37 או חומרים קליני האדם29,38 . שופט יכול לשמש לשם זיהוי של תמונה מגוון רחב של פתוגנים39,40, מאז fluorogenic דיאלקטריים ניתנים לפיתוח עבור מטרות אנזימטיות רבות מלבד BlaC כגון פרוטאזות, kinases, ureases וβ-galactosidases. עם זאת, זהיר מחשבה צריך להינתן למטרה על מנת להבטיח הוא מציג מאפיינים אופטימלית עבור הדמיה. BlaC מייצג אנזים מודל טוב עבור מאפיינים שיבטיחו יישום מוצלח של אסטרטגיה זו. REF הדמיה מספקת read-out מיידית של במשלוח חיידקי מתנת בריאות במהלך זיהומים, אשר במידה רבה מהירויות של התקדמות במחקר של שחפת פתוגנזה, מאז קביעת מספרי חיידקי דורש בדרך כלל שלושה עד שישה שבועות, אבל אפילו יותר אורגניזמים בצמיחה מהירה, גישה זו תוכלו לחסוך הרבה מאוד זמן. שופט יכול לשמש גם כדי להפלות קרצינומות מ שחפת, בעיה מפתח באבחון של נגעים אקנה קשרי מטופלים41,42. REF משמש ככלי הרומן להאיץ שחפת translational הדמיה, אפילו ניתן להחיל על בני אדם, פוטנציאל המאפשר חיזוי מהירה של תוצאות טיפוליות.

שיעור הצמיחה האיטית של מ. שחפת נמצא מחסום מרכזי אבחון מהיר של שחפת-1,-2,-3. בעוד תרבות לפי האבחנה לוקח שבועות כדי להפיק תוצאות, השמצות acid-fast יש מגבלות האבחון4 ילדים5 ו חולים שנדבקו במשותף עם וירוס הכשל החיסוני האנושי6,7. טכנולוגיות הדמיה אופטית הוכרו לאחרונה כחלופה מסורתיים שיטות אבחון עבור שחפת8,9. קרינה פלואורסצנטית ו ביולומינסנציה יכול לשמש כדי שטיחות תמונה מ. שחפת בבעלי חיים בזמן אמת10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19. דימות אופטי יש את היתרון של הערכה מהירה, מדויקת של זיהום עם מ. שחפת20,21,22.
אנחנו חלוקה לרמות פרטים עבור הדמיה אופטית של מ. שחפת בעכברים בשידור חי באמצעות מספר סידורי. שיטה זו היא רגישה וספציפית ביותר23,24 , בדומה לשיטות אחרות אופטי, הוא פחות יקר מאשר שיטות אחרות של שחפת (TB) הדמיה25, לרבות טומוגרפיה (CT)26, מגנטי תהודה הדמיה (MRI)27, סי-טי טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET/CT F-FDG) F-fluorodeoxyglucose28. REF מנצל סובסטרטים או זוהרים פלורסנט מותאם אישית אשר בעת ביקוע על ידי אנזים בקטריאלי, לייצר את המוצר פלורסנט8,29. לפיכך, יש את היתרון של שאינם דורשים30,זן רקומביננטי כתב mycobacterial31. המצע סריג תיאר מורכבת fluorochrome כ'חטיף המחוברים באמצעות טבעת β-לקטם hydrolyzed מאת BlaC (β לקטמאז), באופן טבעי צורונים לידי מורכבת שחפת Mycobacterium8, 32. החיידק לייצר ישירות אות עקב פעילות קטליטית REF המאפשר הגברה על ידי רבים סדרי גודל, זיהוי רגיש של מ. שחפת.
המצע REF השתמשו במחקר זה יש חדירה מעולה רקמה בבעלי חיים, מופחתת רקע בשל אורך גל ארוך שלה. עם סובסטרט זה ארוך באורך הגל זה אפשרי להשיג את הסף של זיהוי עבור מ. שחפת של כמעט 100 מושבת יחידות (CFU) במבחנה , < 1000 CFU בריאות של עכברים ויוו (כל בעלי חיים)8, 33. שופט יכול לשמש ככלי אבחון עבור ברוק, חומרים קליני, אפילו ישירות בחולים עם מיקרו מערכות אנדוסקופי16,32,33,34 בשל רגישות גבוהה וספציפיות שלה. REF ניתן ליישם כל זן קליני של שחפת, כי היא משתמשת אנזים בקטריאלי המיוצר באופן טבעי, BlaC, לצורך זיהוי נוכח כל זני. מאפיינים אלו REF הדמיה כלי רב ערך במחקרים קליניים שחפת באופן כללי כדי להקל על טיפולית, חיסון הערכה, כמו גם ניתוח של פתוגנזה, אך ניתן להחיל גם בסופו של דבר את האבחנה של שחפת מטופלים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:664px;" width="664">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:163px;">VETONE</td>
			<td align="right" style="width:119px;">501027</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:216px;">CNIR800</td>
			<td style="width:163px;">Custom synthesized</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Fatal Plus solution</td>
			<td style="width:163px;">Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">7H9 Middlebrook broth</td>
			<td style="width:163px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">OADC Middlebrook enrichment</td>
			<td style="width:163px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">212351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sporcidin</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;">RE-1284F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">7H11 Middlebrook Agar</td>
			<td style="width:163px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">212203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Madison Chamber</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IVIS Spectrum</td>
			<td style="width:163px;">Perkin Elmer</td>
			<td align="right">124262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">XGI-8-gas Anesthesia System</td>
			<td style="width:163px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Living Imaging software</td>
			<td style="width:163px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Transparent nose cones</td>
			<td style="width:163px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">M. tuberculosis strain CDC1551</td>
			<td style="width:163px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Female BALB/C mice, 5-7 weeks</td>
			<td style="width:163px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging mycobacterium tuberculosis in mice with reporter enzyme fluorescence

כתב אנזים קרינה פלואורסצנטית (שופט) מנצל סובסטרטים ספציפיות עבור אנזימים המצויים אורגניזמים היעד עניין לדימות או זיהוי על-ידי קרינה פלואורסצנטית או ביולומינסנציה. אנו מנצלים BlaC, אנזים צורונים לידי כל זני מ. שחפת . REF מאפשר כימות מהירה של חיידקים בריאות של עכברים נגועים. לאותה הקבוצה של עכברים יכולים לדימות בנקודות זמן רבים, הפחתת עלויות, ספירת חיידקים מהר יותר, ומאפשר תצפיות הרומן באינטראקציות פתוגן-פונדקאי ו הגברת עוצמה סטטיסטית, מאז יותר חיות לכל קבוצה נשמרים בקלות מאוד . שופט הוא רגיש בשל אופיו קטליטי של הכתב אנזימטי BlaC מאוד מסוים עקב העברת האנרגיה של תהודה flourescence מותאם אישית (סריג) או fluorogenic סובסטרטים בשימוש. שופט אינו דורש זנים רקומביננטי, הבטחת אינטראקציות פתוגן-פונדקאי נורמלי. אנו מתארים ההדמיה של מ. שחפת זיהום באמצעות מצע סריג עם פליטות מקסימלי 800 ננומטר. אורך הגל של המצע מאפשר הדמיה רקמות עמוק רגיש אצל יונקים. אנחנו מתאר תרסיס זיהום של עכברים עם מ. שחפת, הרדמה של עכברים, הניהול של המצע REF, וכן הדמיה אופטית. שיטה זו הוחלה בהצלחה על הערכת פתוגן-פונדקאי אינטראקציות והיעילות של אנטיביוטיקה מיקוד מ. שחפת.

REF הדמיה של עכברים נגועים עם מ. שחפת יחד עם נגוע השליטה בעכבר מוצגות באיור איור 1א'. העכברים הנגועים המיוצר באופן משמעותי (P = 0.0057) אות גבוה יותר קרינה פלואורסצנטית מהריאות ב 6 שבועות לאחר הפגיעה לעומת שליטה על המצע המינהל. קורס טיפוסי זמן ללמוד את היעילות הטיפולית נגד מ. שחפת באמצעות שופט יכול להיות הדמיה בשבוע 1, 2, 4, 6, 15, 24 שעות לאחר הפגיעה. עוצמת קרינה פלואורסצנטית הוא לכמת באמצעות epi-תאורה בשביל לרקמות ריאות (איור 1B). האות באופן עקבי הולך וגדל משבוע 2 שבוע 6 בריאות של עכברים נגועים מציע REF זו בהצלחה יכול לזהות את מ. שחפת ויוו. ירידה האות רקע של בקרת עכברים בנקודת זמן מאוחרת יותר (איור 1B) ניתן לייחס את הגידול בגוף מסה ונפח של עכברים על פני תקופה של 6 שבועות, ובכך מקצר את החדירה גל עירור. שחזור תלת-ממד פליט של מקורות קרינה פלואורסצנטית עכברים נגועים מ. שחפת מיוצג באיור 2א. רצפי תמונות נרכשים בנקודות הטרנס-תאורה מרובים באמצעות עירור באותה סדרה של מסננים פליטת עכבר. רצפי תמונות אלה משמשים מכן שחזור תלת-ממד פליט להפצה פלורסנט מקור בתוך נושא בעלי חיים. איור 2 A-D מדגים לזרמים שונים (הפרונטליים, הווריד ו- transaxial) של העכבר טומוגרפיה עם ריאות איברים רישום. יעילות NTF מפות לבדיקת איכות שחזור מיוצגים איור 2E. NTF מאפשר הפחתה רקע זליגות אור הטרנס-תאורה תמונות באמצעות דימוי נוסף שנתפסו עם דחיסות נייטרלית מסנן. התמונה שצולמה עם המסנן עירור ספציפי (איור 2נמדד-E) הוא מנורמל לתמונה השידור נמדד עם פליטה באותו המסנן, מסנן פתוח עירור (איור 2E - מדומה) לתת האות המיוצר על ידי המצע לבד. דומה נמדד, מדומה NTF פרופיל יעילות הן אופקי (איור 2F) ופרופילים (איור 2G) אנכי עם כמעט 0% אחוז שגיאה (איור 2E-% שגיאה) מספק ראיות של שחזור תלת-ממד באיכות טובה עם חפצים מופחתת, אות משופרת לוקליזציה ורגישות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56801/56801fig1.jpg"> איור 1 . הדמיה של מ. שחפת עם הפניה למעורר (א) אין ויוו הדמיה של עכברים uninfected, שנדבקו בשחפת מ - 2, 4 ו- 6 שבועות לאחר הפגיעה. סרגל הצבע מייצג את עוצמת האות פלורסנט בפוטונים לשניה לכל ס מ2 נמוך (צהוב) גבוהה (אדום). (ב) כימות עוצמת קרינה פלואורסצנטית של עכברים נגועים עם מ. שחפת. קרינה פלואורסצנטית ערכים עבור שני פקד (שחור), נגוע (אדום) מוצגים יחד עם שגיאת התקן עבור כל נקודת זמן. המשמעות של תוצאות נקבע על ידי סטודנטים t-לבדוק, p ערכים של < 0.05 נחשבו משמעותית. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56801/56801fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56801/56801fig2.jpg"> איור 2 . שחזור תלת-ממד פליט של מקורות קרינה פלואורסצנטית עכברים נגועים בשחפת מ. טומוגרפיה העכבר ייצג לכיוונים שונים; א) הפרונטליים, ב) הווריד, ו- C) transaxial עם ריאות ד) איברים רישום. האזור תלת-ממד של הריבית (ROI) מיוצג קובייה אדומה בריאה למדידות מקור. (E) NTF יעילות מפות של נמדד, סימולציה לבדיקת איכות הבנייה מחדש. פרופיל יעילות NTF מדומה הסלסולים נמשל, לספק איכות טובה של שחזור תלת-ממד (דומה מדומה הסלסולים NTF יעילות). האות אנכי אופקי F) ו- G) פרופילים ייצוג נמדד (כחול), מדומה (אדום) NTF יעילות עיקול. הסורגים האדומים אופקיים ואנכיים מציינות את מיקום המקור. סרגל הצבע מייצג את עוצמת האות פלורסנט בפוטונים לשניה לכל ס מ2 נמוך (כחול) גבוהה (אדום). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56801/56801fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence at JoVE.com

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

אנו מתארים את הדמיה אופטית של עכברים נגועים עם שחפת Mycobacterium (מ. שחפת) באמצעות כתב אנזים קרינה פלואורסצנטית (שופט). פרוטוקול זה מאפשר את זיהוי רגיש וספציפי של מ. שחפת במודלים של בעלי חיים פרה-קליניים למחקר פתוגנזה, therapeutics וחיסון.

הדמיה שחפת Mycobacterium בעכברים עם הכתב אנזים קרינה פלואורסצנטית

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

imaging-mycobacterium-tuberculosis-mice-with-reporter-enzyme

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

7.2K Views.  Texas A&M Health Science Center. אנו מתארים את הדמיה אופטית של עכברים נגועים עם שחפת Mycobacterium (מ. שחפת) באמצעות כתב אנזים קרינה פלואורסצנטית (שופט). פרוטוקול זה מאפשר את זיהוי רגיש וספציפי של מ. שחפת במודלים של בעלי חיים פרה-קליניים למחקר פתוגנזה, therapeutics וחיסון.

Video: Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) drug-resistant strains threatens to derail current disease control efforts. Thus, there is an urgent need to develop drugs and vaccines that are more effective than those currently available. The genome of M. tuberculosis has been known for more than 10 years, yet there are important gaps in our knowledge of gene function and essentiality. Many studies have since used gene expression analysis at both the transcriptomic and proteomic levels to determine the effects of drugs, oxidants, and growth conditions on the global patterns of gene expression. Ultimately, the final response of these changes is reflected in the metabolic composition of the bacterium including a few thousand small molecular weight chemicals. Comparing the metabolic profiles of wild type and mutant strains, either untreated or treated with a particular drug, can effectively allow target identification and may lead to the development of novel inhibitors with anti-tubercular activity. Likewise, the effects of two or more conditions on the metabolome can also be assessed. Nuclear magnetic resonance (NMR) is a powerful technology that is used to identify and quantify metabolic intermediates. In this protocol, procedures for the preparation of M. tuberculosis cell extracts for NMR metabolomic analysis are described. Cell cultures are grown under appropriate conditions and required Biosafety Level 3 containment,1 harvested, and subjected to mechanical lysis while maintaining cold temperatures to maximize preservation of metabolites. Cell lysates are recovered, filtered sterilized, and stored at ultra-low temperatures. Aliquots from these cell extracts are plated on Middlebrook 7H9 agar for colony-forming units to verify absence of viable cells. Upon two months of incubation at 37 &deg;C, if no viable colonies are observed, samples are removed from the containment facility for downstream processing. Extracts are lyophilized, resuspended in deuterated buffer and injected in the NMR instrument, capturing spectroscopic data that is then subjected to statistical analysis. The procedures described can be applied for both one-dimensional (1D) 1H NMR and two-dimensional (2D) 1H-13C NMR analyses. This methodology provides more reliable small molecular weight metabolite identification and more reliable and sensitive quantitative analyses of cell extract metabolic compositions than chromatographic methods. Variations of the procedure described following the cell lysis step can also be adapted for parallel proteomic analysis.

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

The metabolomic profile of Mycobacterium tuberculosis is determined after growth in broth cultures. Conditions can be varied to test the effects of nutritional supplements, oxidants, and anti-tuberculosis agents on the metabolic profile of this microorganism. Procedure for extract preparation is applicable for both 1D 1H and 2D 1H-13C NMR analyses.

לדוגמא הכנה של<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; תמציות ללימודי metabolomic תהודה מגנטיים גרעיניים

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

גידול של שחפת Mycobacterium Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

מודל ניסיוני לחקר המלריה שחפת-coinfection על הילוכים טבעיים של חפת Mycobacterium ו Berghei Plasmodium</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

הוכחת סמים רבים עמידים<em&gt; חפת Mycobacterium</em&gt; Microarray ההגברה

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us understand the disease mechanisms and advance the discoveries of new treatment options. In vitro cell cultures of monolayers or co-cultures lack the three-dimensional (3D) environment and tissue responses. Herein, we describe an innovative in vitro model of a human lung tissue, which holds promise to be an effective tool for studying the complex events that occur during infection with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The 3D tissue model consists of tissue-specific epithelial cells and fibroblasts, which are cultured in a matrix of collagen on top of a porous membrane. Upon air exposure, the epithelial cells stratify and secrete mucus at the apical side. By introducing human primary macrophages infected with M. tuberculosis to the tissue model, we have shown that immune cells migrate into the infected-tissue and form early stages of TB granuloma. These structures recapitulate the distinct feature of human TB, the granuloma, which is fundamentally different or not commonly observed in widely used experimental animal models. This organotypic culture method enables the 3D visualization and robust quantitative analysis that provides pivotal information on spatial and temporal features of host cell-pathogen interactions. Taken together, the lung tissue model provides a physiologically relevant tissue micro-environment for studies on TB. Thus, the lung tissue model has potential implications for both basic mechanistic and applied studies. Importantly, the model allows addition or manipulation of individual cell types, which thereby widens its use for modelling a variety of infectious diseases that affect the lungs.

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

דגם רקמות 3D ריאות אדם ללימודים פונקציונליים ב<em&gt; חפת Mycobacterium</em&gt; זיהום

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that enhances the phagocytic functionality of neutrophils. Although extensive studies have unveiled the existence and importance of neutrophil priming during infection and injury, means of visualizing this process in vivo have been unavailable. The protocol provided enables monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals by combining three methodologies: 1) DsRed reporter signal &#8212; used as a measure of priming 2) in vivo neutrophil labeling &#8212; achieved by injection of fluorescence-conjugated anti-lymphocyte antigen 6G (Ly6G) monoclonal antibody (mAb) and 3) intravital confocal imaging. Several critical steps are involved in this protocol: oxazolone-induced mouse ear skin inflammation, appropriate sedation of animals, repeated injections of anti-Ly6G mAb, and prevention of focus drift during imaging. Although a few limitations have been observed, such as the limit of continuous imaging time (~ 8 hr) in one mouse and the leakage of fluorescein isothiocyanate-dextran from blood vessels in the inflammatory state, this protocol provides a fundamental framework for intravital imaging of primed neutrophil behavior and function, which can easily be expanded to examination of other immune cells in mouse inflammation models.

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

הדמיה Intravital של Priming נויטרופילים שימוש IL-1β מונחה יזם עכברים Reporter DsRed

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

מערכת לסינון יעילות Cytotoxicity של מעכבי מיקוד תאי<em&gt; שחפת Mycobacterium</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Assay תואם תפוקה גבוהה כדי להעריך יעילות התרופה נגד Macrophage passaged<em&gt; שחפת Mycobacterium</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

ניתוח של 18FDG PET/CT הדמיה ככלי לימודי שחפת Mycobacterium זיהום וטיפול פרימטים לא אנושית

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this bacterium causes a wide disease spectrum in humans ranging from a sterilized infection to an actively progressing deadly disease. The most common form is the latent tuberculosis, which is asymptomatic, but has the potential to reactivate into a fulminant disease. Adult zebrafish and its natural pathogen Mycobacterium marinum have recently proven to be an applicable model to study the wide disease spectrum of tuberculosis. Importantly, spontaneous latency and reactivation as well as adaptive immune responses in the context of mycobacterial infection can be studied in this model. In this article, we describe methods for the experimental infection of adult zebrafish, the collection of internal organs for the extraction of nucleic acids for the measurement of mycobacterial loads and host immune responses by quantitative PCR. The in-house-developed, M. marinum-specific qPCR assay is more sensitive than the traditional plating methods as it also detects DNA from non-dividing, dormant or recently dead mycobacteria. As both DNA and RNA are extracted from the same individual, it is possible to study the relationships between the diseased state, and the host and pathogen gene-expression. The adult zebrafish model for tuberculosis thus presents itself as a highly applicable, non-mammalian in vivo system to study host-pathogen interactions.

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Here, we present a protocol to model human tuberculosis in an adult zebrafish using its natural pathogen Mycobacterium marinum. Extracted DNA and RNA from the internal organs of infected zebrafish can be used to reveal the total mycobacterial loads in the fish and the host&#39;s immune responses with qPCR.

מידול שחפת ב דג נגוע זברה בוגרת התחממות עולמית

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...