This work was supported by BC Lung Association and Mitacs.

1. זן חיידקים וצמיחה בינוני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך דקסטרוז אלבומין פתרון מניות מלח (ADS) על ידי solubilizing 25 גרם של אלבומין בסרום שור, 10.0 גרם של דקסטרוז, ו 4.05 גרם של נתרן כלורי ב 460 מ&quot;ל של מים ללא יונים. מסנן לעקר את המודעות ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 7H9 מרק ידי הוספת 4.7 גרם של 7H9 אבקה 2 מ&quot;ל של גליצרול כדי 900 מ&quot;ל של מים מטוהרים. החיטוי מרק 7H9 ב 121 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאפשר לו להתקרר לטמפרטורת החדר לפני שתמשיך. הפוך 7H9ADST ידי הוספת 100 מ&quot;ל של מודעות 0.5 מ&quot;ל של Tween80 כדי 900 מ&quot;ל של 7H9 מרק. חנות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול 50 מ&quot;ג של סולפט kanamycin ו להתמוסס 1 מ&quot;ל של מים ללא יונים; הריכוז הסופי הוא 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל. מסנן לעקר ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. להוסיף 0.5 מ&quot;ל של Kanamycin פתרון מניות לכל 1 ליטר של 7H9ADST. הערה: בינוני זה צריך להיעשות טרי, כך לטפס על הכרכים כראוי בהתאם לגודל התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול מ שחפת ב 7H9ADST בתוספת kanamycin בעמידת התרבות. Shake התרבות היומי לדלל אותו לפני OD600 מגיע 1.0 להימנע clumping. הערה: זן שחפת המשמש לפיתוח שיטה זו H37Rv טרנספורמציה עם pJAK2.A פלסמיד 12. pJAK2.A הוא פלסמיד אינטגרטיבי המבוסס על וקטור pMV361, המאפשר ביטוי ברמה גבוהה של הגן בלוציפראז גחלילית מן האמרגן hsp60 וניתן לבחור באמצעות kanamycin. </li></ol> 2. THP-1 בינוני ותחזוקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 50 מ&quot;ל של סרום שור העובר חום מומת (FBS) ו 5 מ&quot;ל של 200 מ&quot;מ L- גלוטמין ל 500 מ&quot;ל של RPMI 1640 כדי להפוך RPMI בינוני שלם (כ 10% FBS ו 2 גלוטמין מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על תרבית תאים THP-1 על פי פרוטוקול סטנדרטי 13. בקצרה, לגדל תאים THP-1 במדיום שלם RPMI תוך שמירה על צפיפות התאים שערכה 0.2 1 מיליון דולר מ&quot;ל של מדיום בין pasחכם. </li></ol> 3. תפוקה גבוהה הקרנת תאיים באמצעות H37Rv שחפת להביע בלוציפראז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הצפיפות האופטית של השעיה חיידקי ומתרחבת ספקטרופוטומטר באורך גל של 600 ננומטר. חשב את צפיפות חיידקים באמצעות גורם המרה של 0.1 OD 600 = 3 x 10 7 חיידקים למ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה את החיידקים מספיק ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 10: 1 לתוך צינור צנטריפוגות חדשות. גלולה ב 3000 XG במשך 10 דקות לשאוב את הנוזל. להוסיף 50 μL של בסרום אדם 450 μL של RPMI1640. סולם נפח לנכס ערכים לצורך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי opsonize החיידקים, להשעות את הגלולה בצפיפות של 1 x 10 8 חיידקים לכל 500 μL של RPMI1640 המכילים 10% בסרום אדם. אפשר התערובת כדי לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. קביעת צפיפות תרבית התאים THP-1 על ידי ספירה עם hemocytometer ו microsco הפוכהפ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולת התאים ב מבחנות צנטריפוגה סטריליים 100 XG ו 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לשאוב supernatant מחדש להשעות התאים RPMI שלם בצפיפות של 1 מיליון תאים למ&quot;ל. להוסיף phorbol-12-myristate-13-אצטט (PMA) לריכוז 40 ng / mL הסופי. הערה: זה יהיה המכונה תמהיל הבידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים שחפת opsonized עם תערובת בידול THP-1 בכל פנים של 10: 1 ו aliquot התמהיל הסופי 100 μL לכל היטב צלחת לבנה 96-היטב שטוחה תחתונה. באופן קבוע ומערבבים את התערובת על מנת להבטיח אחידות. אפשר בידול וזיהומים להמשיך לילה בשעה 37 ° C חממה humidified המכיל 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הבארות פעמיים עם 100 μL של RPMI כל. הוספת תרכובות בדילול אל הריכוז הרצוי RPMI שלם דגירה במשך 3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום מהבארות. להוסיף 50 μL של מגיב בדיקה לוציפראז היטב כל אחד. חותם את הצלחות עם tאיטום צלחת דבק ransparent. אפשר 5 דקות של דגירה על 22 מעלות צלזיוס ולאחר מכן לקבל הודעה בתוך luminometer ב 1 s לכל היטב. </li></ol> 4. ניתוח Cytotoxicity שימוש 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-י.ל) -2,5-diphenyltetrazolium ברומיד (MTT) Assay 14 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדו להבחין בתאי THP-1 ב RPMI בתוספת שלמה עם 40 ng / mL של PMA צלחות 96-היטב ברורות. לשמור על צפיפות התאים של 1 מיליון דולר מ&quot;ל ו aliquot 100 μL לכל טוב. אפשר בידול כדי להמשיך לילה בשעה 37 ° C חממה humidified המכיל 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום מבאר ולשטוף אותם פעמים עם RPMI 1640. הוספת תרכובות מדוללות RPMI שלמים אל הבארות. דגירה של 3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 0.5 גרם של MTT ב 100 מ&quot;ל של בופר פוספט (PBS) כדי להפוך את פתרון המניות של 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל. מסנן וחנות סטריליים -20 ° C, הרחק מאור; עדיף לעשות את הפתרון הזה טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2.5 h beforדואר תום תקופת הדגירה 3 ימים, להוסיף 25 μL של פתרון MTT היטב כל ולהשלים את תקופת הדגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50% N, לפוראמיד -dimethyl N (DMF) על ידי ערבוב 250 מ&quot;ל של DMF עם 250 מ&quot;ל מים ללא יונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ החילוץ MTT כדלקמן: לשקול 100 גרם של SDS בבקבוק 500 מ&quot;ל ולהוסיף 300 מ&quot;ל של 50% DMF. החל חום נמוך כדי לאפשר SDS להתמוסס. להוסיף 10 מ&quot;ל של חומצה אצטית טהורה 12.5 מ&quot;ל של 1 M HCl. מלאו עד לציון 500 מ&quot;ל עם 50% DMF; ההרכב הסופי של חיץ החילוץ הוא 50% DMF, 20% SDS, 2.5% חומצה אצטית, ו 2.5% 1 חומצה הידרוכלורית M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתום תקופת הטיפול, להוסיף 100 μL של חיץ חילוץ (מחומם 45 מעלות צלזיוס כדי לפזר כל גבישים) זה טוב. אפשר תערובת כדי לדגור לילה בשעה 37 ° C חממה humidified המכיל 5% CO 2. קראו את הספיגה ב 570 ננומטר. הערה: assay cytotoxicity מבוצע טוב במקביל עם intracellמסך ular שימוש באותן-אצווה וגיל של תאים THP-1. </li></ol> 5.-מרק ניתוח פעילות באמצעות 3 Assay Resazurin <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול מ שחפת ב 7H9ADST לשלב אמצע יומן (~ 0.5 - .8 OD 600). לדלל את התרבות עם 7H9ADST כדי 0.01 OD 600. לדלל את התרכובות ב 7H9ADST פי 2 ריכוזי בדיקות aliquot 100 μL של כל תרכובת מדוללת לתוך זה גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 100 μL של השעית החיידקים מדולל לתוך זה גם. אפשר הצלחות לדגור על 37 מעלות צלזיוס חממה humidified עבור 5 ימים. ממיסים 10 מ&quot;ג של resazurin ב 100 מ&quot;ל של מים ללא יונים ולסנן סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 30 μL של פתרון resazurin ולנטר את שינוי הצבע אחרי 48 h; התפתחות חיידקים מצוינת על ידי מרת צבע מכחול לורוד. הערה: ניתוח כמותי יכול להתבצע גם על ידי מדידת גם את הקרינה בבית 590 ננומטר עם עירור ב 530 - 560ננומטר או את הספיגה ב 570 ננומטר ו 600 15 ננומטר. </li></ol>

<ol>
	<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Global tuberculosis report 2015. , (2016).</li><li>Yajko, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+method+for+determining+MICs+of+antimicrobial+agents+for+Mycobacterium+tuberculosis.">Colorimetric method for determining MICs of antimicrobial agents for Mycobacterium tuberculosis.</a> J Clin Microbiol. 33, 2324-2327 (1995).</li><li>Khare, G., Kumar, P., Tyagi, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+screening-based+identification+of+inhibitors+against+the+intraphagosomal+survival+of+Mycobacterium+tuberculosis.">Whole-cell screening-based identification of inhibitors against the intraphagosomal survival of Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 57, 6372-6377 (2013).</li><li>Andreu, N., Fletcher, T., Krishnan, N., Wiles, S., Robertson, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+measurement+of+antituberculosis+drug+activity+in+vitro+and+in+macrophages+using+bioluminescence.">Rapid measurement of antituberculosis drug activity in vitro and in macrophages using bioluminescence.</a> J Antimicrob Chemother. 67, 404-414 (2012).</li><li>Mak, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screen+to+identify+inhibitors+of+ATP+homeostasis+in+non-replicating+Mycobacterium+tuberculosis.">A high-throughput screen to identify inhibitors of ATP homeostasis in non-replicating Mycobacterium tuberculosis.</a> ACS Chem Biol. 7, 1190-1197 (2012).</li><li>Pethe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+genetic+screen+in+Mycobacterium+tuberculosis+identifies+carbon-source-dependent+growth+inhibitors+devoid+of+in+vivo+efficacy.">A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy.</a> Nat Commun. 1, 57 (2010).</li><li>Hmama, Z., Pena-Diaz, S., Joseph, S., Av-Gay, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoevasion+and+immunosuppression+of+the+macrophage+by+Mycobacterium+tuberculosis.">Immunoevasion and immunosuppression of the macrophage by Mycobacterium tuberculosis.</a> Immunol Rev. 264, 220-232 (2015).</li><li>Ramon-Garcia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+drug+combinations+for+tuberculosis+therapy+identified+by+a+novel+high-throughput+screen.">Synergistic drug combinations for tuberculosis therapy identified by a novel high-throughput screen.</a> Antimicrob Agents Chemother. 55, 3861-3869 (2011).</li><li>Lam, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitazoxanide+stimulates+autophagy+and+inhibits+mTORC1+signaling+and+intracellular+proliferation+of+Mycobacterium+tuberculosis.">Nitazoxanide stimulates autophagy and inhibits mTORC1 signaling and intracellular proliferation of Mycobacterium tuberculosis.</a> PLoS Pathog. 8, e1002691 (2012).</li><li>Sorrentino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+Intracellular+Screen+for+New+Compounds+Able+To+Inhibit+Mycobacterium+tuberculosis+Growth+in+Human+Macrophages.">Development of an Intracellular Screen for New Compounds Able To Inhibit Mycobacterium tuberculosis Growth in Human Macrophages.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60, 640-645 (2015).</li><li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+broad-range+of+recombination+cloning+vectors+in+mycobacteria.">A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria.</a> Plasmid. 62, 158-165 (2009).</li><li>. THP-1 (ATCC TIB-202) Available from: <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx">https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx</a> (2016)</li><li>Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-examination+and+further+development+of+a+precise+and+rapid+dye+method+for+measuring+cell+growth/cell+kill.">Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill.</a> J Immunol Methods. 119, 203-210 (1989).</li><li>Invitrogen. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> AlamarBlue assay. , (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handbook+of+anti-tuberculosis+agents.+Introduction.">Handbook of anti-tuberculosis agents. Introduction.</a> Tuberculosis (Edinb). 88 (2), 85-86 (2008).</li><li>Riss, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Viability Assays. , (2004).</li><li>Meyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+efficacy+of+apramycin+in+murine+infection+models.">In vivo efficacy of apramycin in murine infection models.</a> Antimicrob Agents Chemother. 58, 6938-6941 (2014).</li><li>Ballell, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fueling+open-source+drug+discovery:+177+small-molecule+leads+against+tuberculosis.">Fueling open-source drug discovery: 177 small-molecule leads against tuberculosis.</a> ChemMedChem. 8, 313-321 (2013).</li><li>Grundner, C., Cox, J. S., Alber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tyrosine+phosphatase+PtpA+is+not+required+for+Mycobacterium+tuberculosis+growth+in+mice.">Protein tyrosine phosphatase PtpA is not required for Mycobacterium tuberculosis growth in mice.</a> FEMS Microbiol Lett. 287, 181-184 (2008).</li><li>Wong, D., Bach, H., Sun, J., Hmama, Z., Av-Gay, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+protein+tyrosine+phosphatase+(PtpA)+excludes+host+vacuolar-H+-ATPase+to+inhibit+phagosome+acidification.">Mycobacterium tuberculosis protein tyrosine phosphatase (PtpA) excludes host vacuolar-H+-ATPase to inhibit phagosome acidification.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 19371-19376 (2011).</li><li>Bach, H., Papavinasasundaram, K. G., Wong, D., Hmama, Z., Av-Gay, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+virulence+is+mediated+by+PtpA+dephosphorylation+of+human+vacuolar+protein+sorting+33B.">Mycobacterium tuberculosis virulence is mediated by PtpA dephosphorylation of human vacuolar protein sorting 33B.</a> Cell Host Microbe. 3, 316-322 (2008).</li><li>Chanput, W., Peters, V., Wichers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , 147-159 (2015).</li><li>Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection.">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> J Vis Exp. , e51960 (2014).</li><li>Ferguson, J. S., Weis, J. J., Martin, J. L., Schlesinger, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+protein+C3+binding+to+Mycobacterium+tuberculosis+is+initiated+by+the+classical+pathway+in+human+bronchoalveolar+lavage+fluid.">Complement protein C3 binding to Mycobacterium tuberculosis is initiated by the classical pathway in human bronchoalveolar lavage fluid.</a> Infect Immun. 72, 2564-2573 (2004).</li><li>Andreu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+bioluminescent+reporters+for+use+with+mycobacteria.">Optimisation of bioluminescent reporters for use with mycobacteria.</a> PLoS One. 5, e10777 (2010).</li><li>Queval, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microscopic+phenotypic+assay+for+the+quantification+of+intracellular+mycobacteria+adapted+for+high-throughput/high-content+screening.">A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening.</a> J Vis Exp. , e51114 (2014).</li><li>Christophe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+screening+identifies+decaprenyl-phosphoribose+2'+epimerase+as+a+target+for+intracellular+antimycobacterial+inhibitors.">High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors.</a> PLoS Pathog. 5, e1000645 (2009).</li><li>Pethe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+Q203,+a+potent+clinical+candidate+for+the+treatment+of+tuberculosis.">Discovery of Q203, a potent clinical candidate for the treatment of tuberculosis.</a> Nat Med. 19, 1157-1160 (2013).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests for this work.

מטרת המחקר הנוכחי הייתה ליצור שיטת HTS פשוטה וחסכונית באמצעות מודל זיהום תאיים אדם עבור שחפת. שחפת היא מחלה אנושית מתאפיינת הזיהום של מקרופאגים המכתשית ידי מ שחפת. בשל בעיות בטיחות ביולוגיות, המחקר מעורב מודלים ביולוגיים של שני החיידק ואת תאי המארח נעשה שימוש בעבר. עם זאת, הוכיח כי השימוש של חיידקים פונדקאיים ומודלים לא אנושיים הם מנבאים עניים של להיט-to-Lead הצלחה בפיתוח תרופה, המציין כי הקרנת תרופה נעשית בצורה טובה ביותר עם תאים אנושיים נגועים שבחפת מ 19, 20, 21, 22. בשיטה זו, אנו מתקדמים המותאמים פרוטוקולי הקרנת המדינה- of-the-art נוכחיים עבור תא-קו THP-1 מקרופאג דמוי אדם. על מנת להשיג גבוהתפוקה, הצגנו שיפורים טכנולוגיים כמה פרוטוקול הזיהום. בראש ובראשונה, החלפנו את כל השלבים כרוכים נחישות CFU והחלפתי אותם עם מערכת כתב מבוסס luciferase. luciferase גחלילית הנבחר בשל assay סוף הנקודות הפשוטות, השפלה המהירה ידי אנזימי הליזוזום תא מארח, ואת דרישות ציוד המינימאליות. החלפה זו באופן יעיל בוטלה תקופת דגירה 30 יום, כמו גם את עלויות העבודה מתכלה הקשורים צעדי ציפוי מושבה-ספירה. שיפור ניכר שני הצגנו היה יצווה עיבוד זיהום, אשר משפר עוד יותר את תפוקה עקבית בין הבארות עם פרוטוקול זיהום פשוט. על ידי שילוב של צעדי בידול זיהום לתוך אחד צעד, הצלחנו לקצר את הפרוטוקול על ידי יום אחד. במקביל, הצלחנו להפחית את שלושת סבבי כביסה כי שבדרך כלל מתרחשים בין דיפרנציאציה infection, המהווה מקור אובדן התא THP-1 אפשרי בשל ריחוק. פרוטוקול זה פותח לסינון בתוך שורת התאים THP-1, אשר מקנה מספר יתרונות. THP-1, כמו שורת תאים הונצח, יכול להיות מתורבת מהימנה במבחנה במשך 20 פסקאות 23. זה חשוב במיוחד עבור קמפייני הקרנה גדולים, שבו זה יכול להיות מאתגר לשמור תאים מספיק כדי לספק התקנת תפוקה גבוהה. בנוסף, בדיקות THP-1 מספקות רקע גנטי הומוגני ממזער השתנות תוצאות. זה מועיל מאוד עבור תרכובות בדיקות המשפיעות תגובות תא מארחת 10. כבונוס נוסף, ביטוי גנים בקו תא THP-1 יכול להיות למטה מוסדר על ידי RNAs התערבות קטנה (siRNAs) 24. זה מספק כלי רב ערך עבור חקירות במורד למצב פעולה של תרכובות להיט. אמנם שיטה זו נועדה באמצעות שורת תאים THP-1, אותוניתן להתאים בקלות עבור תאים ראשוניים אדם, כגון תאי דם היקפיים mononuclear (PBMC), כפי שהוכח בעבר 10. כדי טוב ביותר לחקות את האינטראקציה בפועל בין מקרופאגים המכתשית ו מ שחפת, פרוטוקול assay התאי כולל צעד opsonize החיידקים. Opsonization עם שחפת מעילים בסרום האדם ומקל כניסת התא באמצעות השלמה קולטן 3 (CR3) 25. חיידקי Naked נוטים יותר להיכנס מקרופאגים דרך קולטן לקטינים 8. בהתחשב בעובדה ידועה הנוזל ברונכואלוואולרית להכיל רכיבים של נסיוב אדם 25, opsonization, או היעדרה, עשויים להשפיע מהותית על תוצאות ההקרנה. עם זאת, כמה יכול לבחור לדלג על שלב זה על מנת להמשיך ולפשט את תהליך הזיהום 16, או שזה לא יכול להיות ריאלי להשיג בסרום אדם מספיק עקב גודלו של library שהוקרן 11. את assay התאי כולל צעד להסיר את כל הנוזל המכיל חומר שאינו מחובר המבארות לפני התוספת של מגיב luciferase. צעד זה נועד להגדיל את יחס אות לרעש תוך הפחתת מגיב סכום המשמש לכל טוב. עם זאת, הכללת צעד זה עשויה ליצור נתונים חיוביים שגויים עבור תרכובות להרוג THP-1 אך לא M. שחפת, מאז מנותקת lysed THP-1 ו- &quot;פנויות&quot; שחפת יוסרו. לכן, הפרוטוקול של היצרן הציע להוסיף כמויות שווות של ריאגנט luciferase (100 μL) זה טוב, יש לפעול על מנת assay להישרדות מ שחפת בבארות המכילות תרכובות ציטוטוקסיות. בניגוד למערכת בלוציפראז הגחלילית, מערכת לוקס החיידקים אינה מחייב ריאגנטים חיצוני עבור דור אות 26. למרות זאת,מערכת הגחלילית עדיפה על פני מערכת הלוקס מהסיבות הבאות: ראשית, מערכת החיידק עשויה להיות רעילה mycobacteria 26. שנית, מערכת כתב מורכבת יותר (5 גנים עבור לוקס לעומת 1 גן הגחלילית) היא רגישה יותר לאותת עיכוב על ידי תרכובות מבחן. לבסוף, ריאגנטים זמינים מסחרי עבור assay בלוציפראז הגחלילית לספק את התנאים הדרושים לייצור אותות אופטימלי. מצד השני, מערכת luciferase החיידקים מסתמכת על ייצור ATP ואת הקו-הפקטורים הנוכחים בתוך החיידקים לייצור אות. אלה יכולים להשתנות בין טיפולים שונים והם לא קלים כמו לשלוט. לכן, התוספת של מגיב luciferase למערכת גחלילית סטנדרטיזציה בתנאי התגובה ומספקת מדידות אמינות יותר של פעילות לוציפראז בכל הטיפולים. נחישות CFU כבר מזמן להיות תקן הזהב עבור לכימות צפיפות חיידקים. בשנת חוזה, bioluminescence, כמו רוב הכתבים, אינו מהווה מדד ישיר של חיידקים. במקום זאת, RLU היא פונקציה של שני CFU והמדינה מטבולית של חיידקים. אחרים הדגימו את הקשר הליניארי בעיקר בין RLU ו CFU עבור mycobacteria bioluminescent בתנאים ספציפיים 5. בכל מקרה, הפחתה משמעותית של האות בדיקת לוציפראז, לא משנה את הבסיס של סיבה אחרת מאשר עיכוב בפועל של פעילות-יהיה אנזים luciferase מצביעים על ירידה של כושר מ שחפת בתוך התא המארח. לכן, תרכובות אלה תהיינה עניין מבחינת הקרנה בסמים ולא צריך להיות מחוץ בפיתוח שיטה. חלופת פרוטוקול ההקרנה תאית מבוסס luciferase היא פלורסנט האוטומטי מיקרוסקופיה מבוסס בגישה 11, 27, 28, 29. בלוציפראזפלט assay נמדד על ידי luminometer, והנתונים המתקבלים הם כמוני, בעוד מיקרוסקופ פלואורסצנטי מייצר תמונות כי הם איכותיים. עם זאת, באמצעות תכנות מחשב חכם, ניתן לנתח את התמונות כדי להפיק נתונים כמותיים. יתר על כן, מיקרוסקופ פלואורסצנטי מאפשר fluorophores מרובים כדי לשמש במקביל, וזה מאוד עוזר לאיסוף פרמטרים חשובים כגון כדאיות התא, ספירת תאי, וקצב בפועל של זיהום. כפי שניתן לחזות, היתרונות הללו באים עם כישלונות מסוימים. ההשקעה הראשונית על ציוד מיקרוסקופ פלואורסצנטי האוטומטי היא פעמים רבות יותר מאשר העלות של luminometer או fluorometer ולכן הוא מחוץ להישג ידם של מעבדות מחקר רבות. למי יש גישה לציוד, עיבוד המדגם חייב להיחשב לפני רכישת תמונה וניתוח נתונים. שני הצעדים האלה משפיעים על השקעת הזמן הכולל עם עליות בגודל ספרייה. הכללת תוויות ניאון נוספות בתאי מארח requirתיקון, צביעת es, וצעדי כביסה, דבר שיחייבו השקעות התערבות וזמן נוספות של משתמש. יתר על כן, איסוף וניתוח נתונים מיקרוסקופ פלואורסצנטי, למרות אוטומטיות, עדיין דורשים הרבה יותר זמן ומשאבים מאשר את הודעת בדיקה לוציפראז הפשוטה. לכן, luciferase כתב מבוסס שיטת ההקרנה התאית היא פשוט מסוגל תפוקה גבוהה יותר. שיטת ההקרנה התאית מבוסס luciferase יש אחד מגבלה משמעותית בהשוואה לשיטות הקרנה מבוססת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. זאת בשל העובדה כי הבדיקה לוציפראז מספקת אין נתונים בדבר מצב בריאותו של מקרופאגים מארחים. תרכובות ציטוטוקסיות תגרומנה למותו של מקרופאגים, וכך חיידקים חיים עשויים להשתחרר לתוך בינוני כבר לא לתרום את אות בדיקה לוציפראז הסופית. כתוצאה מכך, תרכובות ציטוטוקסיות תופענה לגרום למותו של שחפת תאיים ובכך generatEA מספר רב של תוצאות חיוביות שגויות. כדי לטפל בבעיה זו, אנו משלימים את השיטה שלנו עם מבחן MTT להעריך את רעילות לתאים של תרכובות על מקרופאגים המארח. מודול זה של שיטת ההקרנה נותן לנו מידע נוסף על drugability של תרכובות של עניין ומאפשר הביטול המוקדם של מועמדי סמים פחות מ-אידיאלי. לחלופין, אפשר גם להשתמש assay התאי מבוסס luciferase לפני ביצוע מיקרוסקופ פלואורסצנטי האוטומטי. מסכי ספריות מתחם גדול, זה מאפשר הערכה מהירה ויעילה של האפקטיביות מתחם במודל זיהום מקרופאג. כתוצאה מכך, ניתן להזמין מיקרוסקופ פלואורסצנטי האוטומטי עבור מחקרים מפורטים על מועמדים טובים יותר, כפי שמודגם על ידי מחקר שפורסם בעבר 11. העלות הנמוכה והטבע פשוט של assay התאי מבוסס luciferase גם מאוד נהנו חוקרים המעוניינים לבחון קטןאה ספריות כימיות. בסך הכל, assay התאי מבוסס luciferase הוכיח להיות כלי גמיש מאוד עבור מעבדות מחקר של כל הקליברים וכן לסינון פרויקטים בגדלים שונים.

שחפת Mycobacterium, הסוכן סיבתי של שחפת (TB), היא הסיבה המובילה לתחלואה ותמותה בעולם. Drug-רגיש TB היא מחלה שניתן לטפל הדורשת אנטיביוטיקה מרובה לתקופה של 6 חודשים. למרות היותו מחלה שניתן לטפל בה, תמותת TB נאמד ב -1.5 מיליון 2015 1. בשנת 10 השנים האחרונות, התרבו חששות השכיחים של שחפת עמידה לתרופות. Multidrug העמיד TB (MDR-TB) מוגדר TB כי הוא עמיד לפחות איזוניאזיד (INH) ו ריפמפיצין (RMP), ורוב זני MDR-TB הם עמידים גם לבחור סמי TB קו שני, ובכך להגביל את אפשרויות טיפול . ההשפעות של עמידות לתרופות ליצור אתגר גדול לטיפול בחולים במשותף נגועים בנגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV); 400,000 חולים ברחבי העולם מתו משחפת HIV הקשורים ב 2015 1. למרבה האכזבה, ארצות הברית המזון והתרופות Administיחס אישר תרופה חדשה TB אחד בלבד נגד MDR-TB, bedaquiline, ב 2 40 השנים האחרונות. מקדם במציאת טיפולי TB טובים יותר קצרים יותר יש צורך דחוף כדי להקדים במאבק נגד שחפת MDR-TB. באופן מסורתי, מסכי סמי TB מבוצעים בתנאי גידול במבחנה במדיום גידול, לפיו תרכובות מתווספות תרבות גוברת והאפקטיביות שלהם בביעור מיקרואורגניזמים נקבעות על ידי ספירת יחידות מושבה להרכיב (CFU) על מדיום מוצק. כמו ספירת CFU הם עבודה אינטנסיבית, גוזל זמן יקר, שיטות עקיפות שונות פותחו כדי להקל על בעיה זו. שיטות אלו כוללות את assay הכדאיות הכחולה Alamar 3, קביעה של קרינה 4 מ חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) או הארה 5 מחיידקים להביע בלוציפראז, ואת הערכת אדנוזין אדנוזין הכולל (אTP) 6, 7. TB האופיינית מאופיינת זיהום שחפת של הריאות, שבו החיידקים מתגוררים ולשכפל בתוך phagosomes של מקרופאגים המכתשית 8. מסך פנוטיפי ב-מרק פשוט עשוי להתאים פתוגנים תאיים; עם זאת, בפרספקטיבה היסטורית, פגע תרכובות נגד שחפת מזוהה בשיטה זו לעיתים קרובות אינם מצליחים לעמוד בציפיות במהלך השלבים אימות במורד הזרם מודלים זיהום. אנו מציעים כי תרופת TB מבוצעת טוב מודל זיהום תא מארח תאי. עם זאת, מודלים תאיים בעלי חסמים טכנולוגיים ביולוגיים רבים לפיתוח הקרנת תפוקה גבוהה (HTS). מכשול גדול הוא המורכבות של תהליך ההדבקה, שהודגם על ידי צעדים רבים וההסרה המשוכללת של חיידקים תאיים על ידי ב-בין הכביסה. משוכה משמעותית שנייה היא מחדש הזמן הממושךquirements, כמו גילוי גידול, בדרך כלל נעשה על ידי CFU לספור על צלחות תרבות, הוא תהליך שלוקח מעל 3 שבועות כדי להשלים. פתרון אחד כדי להחליף ספירת CFU סופק על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי האוטומטי בשילוב עם חיידקים פלורסנט. עם זאת, פתרון זה דורש השקעה בציוד ראשונית כי הוא מחוץ להישג ידם של מעבדות מחקר רבות. פשוט, בעלות נמוכה, ושיטת HTS הרלוונטית-מחלה היו מאוד לשפר את תהליך גילוי תרופות. במחקר זה, אנו מדווחים מערכת HTS חדשה, מודולרי, המכוונת מתן מהיר, ו מדרגית, עדיין חסכוני, assay מתאים לקביעת הפעילות של תרכובות נגד שחפת תאיים. מערכת זו מורכבת משלושה מודולים: (i) תאי, (ii) רעיל לתאים, וכן (iii) מבחנים-מרק. התוצאה הסופית בשילוב מספקת תיאור מקיף של התכונות המתחמות, עם מידע נוסף לגבי מצב פוטנציאלי פעולה. SC זהreening מערכת נעשה שימוש במספר פרויקטים עם ספריות מתחמות שונות למקד במצב של פעולה, כוללים הניתוח של סינרגיה סמי 9, הגירוי של autophagy 10, ואת העיכוב של שחפת -secreted גורם ארסי (לא פורסם). תרכובות של מצב ידוע של פעולה גם נחקרו 11. גרסה שונה של שיטה זו אומצה גם על ידי שיתוף הפעולה עם התעשייה שלנו כשיטת ההקרנה העיקרית לזהות תרכובות חדשות נגד שחפת תאיים מ 11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12483020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>271210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween80</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>T164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, Bovine pH7</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>10857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethylformamide (DMF)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Hydrocholoric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>351279212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>351269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resazurin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B21187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>TIB-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M. tuberculosis H37Rv</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well flat bottom white plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95-well flat bottom clear plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent plate sealer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AB-0580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Biomate 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate spectrophotometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Epoch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>luminometer</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>Tropix TR717</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

system for efficacy and cytotoxicity screening of inhibitors targeting intracellular mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

תפוקה גבוהה הקרנה תאית באמצעות שחפת לבטא את הגן בלוציפראז איור 2A ולוח 1 מכילים את הנתונים הגולמיים שנאספו על ידי luminometer, המבוטא ביחידות זורחות יחסית (RLU), מראים את ההשפעה של ריכוז גדל והולך של ריפמפיצין סמי TB על שחפת בתוך תאי THP-1. איור 2 א היא פיזור עלילה של הארת הגלם נמדדת RLU עבור ריכוזים שונים של ריפמפיצין. הברים שגיאה מציינים את סטיית התקן של הממוצע (SEM). איור 2B מראה את הפחתת אחוז הארת בארות מטופלים לעומת בארות מטופל. מהנתונים עולה כי ריפמפיצין הוא מסוגל להפחית&gt; 99.9% של RLU משחפת תאיים מ בריכוז של 0.1 מיקרוגרם / מ&quot;ל. זהו בהתאם previously שפורסם MIC בין 0.1 לבין 0.4 מיקרוגרם / מ&quot;ל 16. הארה מיוצר בכל טוב הוא אינדיקציה luciferase הכולל הביע ידי שחפת ולכן הוא אינדיקטור של המצב המטבולי של שחפת בתוך הבאר. זה נורמלי רמות זורחות גלם להשתנות בין ניסויים. ככזה, השוואה של נתונים גולמיים תעורר מסקנות לא אמינות. לפיכך, הנתונים צריכים להיות מנורמלים נגד כביקורת שלילית מוגדרת, אשר תהיינה הדגימות שטופלו DMSO בלבד. הערכים הנובעים יכול לבוא לידי ביטוי כמו הפחתת אחוז מ שחפת בארות (איור 2B). ניתוח Cytotoxicity באמצעות מבחן MTT מבחן MTT הוא assay ומבוססת על רעילות לתאים איקריוטיים. assay colorimetric זה מצביע תאים חיים באמצעות המרה של MTT (צהוב) כדיformazan סגול בצבע. Assay זה מבוצע ללא זיהום שחפת כי החיידקים מסוגלים חילוף חומרי MTT, אשר מפחית את הרעילות הנצפית של התרכובות. הצעה משותפת מבחן MTT היא להשתמש במדיה ללא פנול האדום pH אינדיקטור בשל הספיגה ב 570 17 ננומטר. עם זאת, מיצוי חיץ acidified המתוארים בשיטה זו הוא מסוגל למזער הפרעה הנגרמת על ידי פנול 17 אדום. איור 3 ממחיש את רעילות לתאים הנגרם על ידי ריכוז גדל והולך של G1-1H מתחם מבחן מקודד. בדרך כלל, ריכוז מעכב 50% (IC 50) מועסק כדי לציין את רמת רעילות לתאים. במקרה של G1-1H, בריכוזים של 10 מיקרומטר ו 3 מיקרומטר הם בבירור מתחת ריכוז 50 IC. In-מרק ניתוח פעילות לנוברישום כוזב של assay resazurin את assay resazurin הוא נפוץ לניתוח רעיל לתאי תאים איקריוטיים, אבל זה יכול לשמש גם כדי לפקח חיידקים חיים במרק 3. את assay resazurin הוא assay מבוסס-חיזור דומה מבחן MTT. הוא מודד את רמות NADPH ופעילות NADPH דהידרוגנז דרך המרה של resazurin לתוך resorufin, A fluorophore אדום. הדרך הקלה והמהירה ביותר כדי לקבוע יעילות תרופה היא לחפש את ריכוז הטיפול הנמוך ביותר שבו הבארות להישאר בצבע כחולה. איור 4 מציג חלק צלחת 96-היטב המציגה את השפעות ריכוזים שונים של apramycin האנטיביוטי יש על resazurin המרה על ידי מ שחפת. את המיקרופון ב-מרק היה נחוש בדעתו להיות בין 2.5 ו 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל. זה גבוה במקצת מהערך שפורסם בעבר של 1.5 מיקרוגרם / מיליליטר 18, אבל זה עדיין טוב בתוך acceptabמגוון le. במקרים רבים, שינוי הצבע די הדרגתי, כך שקשה להכריע בטוח. בתנאים אלה, עדיף לכמת את הסכום בפועל של resazurin המרה באף ספיגת או פלואורסצנטי. בשל המאפיינים הספיגים הדומים של resazurin ו resorufin, נחישות MIC באמצעות ספיגה דורשת מדידות באמצעות שני אורכים גל שונים וחישובים מורכבים 15. לכן, השיטה הטובה ביותר היא למדוד קרינה באמצעות 530- ל 560 ננומטר אורכי גל עירור באורך גל פליטה 590 ננומטר, כמתואר בספרות היצרן 15. איור 4 ממחיש מקור פוטנציאלי של חוסר עקביות הקשורים incubations multiday שיכול לשנות את תוצאות ההקרנה באופן דרסטי. בשל humidifying הפסולה של 37 מעלות צלזיוס החממה המשמשת בניסוי זה, בארות על הקצוות של p<html> lates סבל באופן משמעותי יותר אידוי. כל 15 בארות שטופלו DMSO אמורים להיות זהים, אבל בארות בשולי שמאלה העליון הפחית כרכים. בארות אלה מופיעים גם לקבל בצבעים שונים מאשר בארות DMSO שטופלה האחרות באמצע הצלחת. אותו חוסר עקביות יכול להיות גם ציין 2.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​בארות apramycin שטופלו. במקרה זה, נפח מופחת גם יוביל קריאה כמותית על ידי ספקטרופוטומטר ו fluorometer. התאיידות הופכת משמעותית עבור כל הניסויים עם זמני דגירה ממושכים, ולכן יש להקפיד לשמור אינקובטורים היטב humidified להימנע מקור זה של חוסר עקביות. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55273/55273fig1.jpg" /> איור 1: שרטוטי שיטה. תרשים המתאר שרטוטים assay עבור 3 מודולים נפרדים של מערכת הקרנת תפוקה גבוהה.<html> &quot;Target = &#39;_upload / 55,273 / 55273fig1large.jpg _ blank&#39;&gt; אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55273/55273fig2.jpg" /> איור 2: נציג הנתונים לקוחים תאיים כדי לבחון את האפקטיביות של ריפמפיצין בחיסול שחפת בתוך THP-1 תאים. (א) גרף של ההארה מתכוונת לקרוא (ביחידות הארה יחסית) עבור כל ריכוז טיפול (ריפמפיצין). הברים שגיאה לציין את שגיאת התקן של הממוצע עבור כל בשלושה עותקים. (ב) גרף של הפחתת האחוז מחושב הארה נגרמה על ידי טיפול של ריפמפיצין, שבו ערכים גבוהים יותר מצביעים על יעילות רבה יותר. 90% ריכוז מעכבות (IC 90) במקרה זה הוא איפשהו בין 0.01 לבין 0.1 מיקרוגרם / מ&quot;ל.nk &quot;&gt; אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55273/55273fig3.jpg" /> איור 3: נציג נתונים מתוך Cytotoxicity (MTT) Assay כדי לבחון את ההשפעות הרעילות של G1-1H מתחם על Differentiated THP-1 תאים. גרף של ערכי &quot;אחוזים מכלל שליטה&quot; מחושב עבור כל ריכוז של G1-1H מתחם טיפול, שבו ערכים גבוהים יותר מצביעים על תאים THP-1 בריא. IC 50 במקרה זה הוא איפשהו בין 10 לבין 30 מיקרומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55273/55273fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/55273/55273fig4.jpg" /> איור 4: נציג נתונים מתוך Assay Resazurin לבדיקת Effectiveness של Apramycin מעכב M. שחפת In-מרק. נתונים איכותיים בלבד נאסף במקרה זה בשל מגבלות הציוד במעבדה 3 בטיחות ביולוגית ברמה (BSL3). התמונה מראה חלק צלחת 96-היטב המכיל שחפת שטופלה או DMSO או כמויות משתנות של apramycin. הבארות שטופל DMSO הציגו מרה של resazurin כדי resorufin, כפי שמצוין על ידי מרת הצבע מכחול לורוד. הדגימות שטופלו apramycin בבירור עברו המרה צבע מתחת 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55273/55273fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> [ריפמפיצין] </td><td> Rep1 </td><td> Rep2 </td><td> Rep3 </td><t<html> ד&gt; ממוצע </td><td> הפחתת% </td></tr><tr><td> 4 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td><td> 184 </td><td> 190 </td><td> 210 </td><td> 195 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td><td> 244 </td><td> 215 </td><td> 159 </td><td> 206 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 0.1 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td><td> 1037 </td><td> 731 </td><td> 976 </td><td> 915 </td><td> 98 </td></tr><tr><td> 0.01 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td><td> 19,200 </td><td> 24,400 </td><td> 23,919 </td><td> 22,506 </td><td> 54 </td></tr><tr><td> 0 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td><td> 39,877 </td><td> 49,655 </td><td> 57,728 </td><td> 49,087 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table> טבלה 1: נתונים גולמיים assay בלוציפראז עבור קביעת 90 IC תאיים של ריפמפיצין. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" f</html style=";text-align:right;direction:rtl">o: לשמור-עם-next.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <tbody><tr><td> [G1-1H] </td><td> A570 נציג 1 </td><td> A570 נציג 2 </td><td> A570 נציג 3 </td><td> A570 הממוצע </td><td> % של מטופל </td></tr><tr><td> 30 מיקרומטר </td><td> 0.056 </td><td> 0.056 </td><td> 0.055 </td><td> 0.056 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> 10 מיקרומטר </td><td> 0.518 </td><td> 0.488 </td><td> 0.492 </td><td> 0.499 </td><td> 62 </td></tr><tr><td> 3 מיקרומטר </td><td> 0.652 </td><td> 0.638 </td><td> 0.656 </td><td> 0.649 </td><td> 80 </td></tr><tr><td> 0 מיקרומטר </td><td> 0.822 </td><td> 0.782 </td><td> 0.815 </td><td> 0.806 </td><td> 100 </td></tr></tbody></table> טבלה 2: נתונים גולמיים מבחן MTT עבור קביעת G1-1H Cytotoxicity של המבחן המתחם בבית DiffereNT ריכוזים.

Watch this Scientific Journal Video about System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis at JoVE.com

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

פתחנו מערכת הקרנה מודולרית תפוקה גבוהה לגילוי תרכובות רומן נגד שחפת Mycobacterium, מיקוד תאי ב-המרק גובר חיידקים כמו גם רעילה לתאים נגד התא המארח היונק.

מערכת לסינון יעילות Cytotoxicity של מעכבי מיקוד תאי<em&gt; שחפת Mycobacterium</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

system-for-efficacy-cytotoxicity-screening-inhibitors-targeting

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

8.5K Views.  University of British Columbia.  פתחנו מערכת הקרנה מודולרית תפוקה גבוהה לגילוי תרכובות רומן נגד שחפת Mycobacterium, מיקוד תאי ב-המרק גובר חיידקים כמו גם רעילה לתאים נגד התא המארח היונק. 

Video: System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) drug-resistant strains threatens to derail current disease control efforts. Thus, there is an urgent need to develop drugs and vaccines that are more effective than those currently available. The genome of M. tuberculosis has been known for more than 10 years, yet there are important gaps in our knowledge of gene function and essentiality. Many studies have since used gene expression analysis at both the transcriptomic and proteomic levels to determine the effects of drugs, oxidants, and growth conditions on the global patterns of gene expression. Ultimately, the final response of these changes is reflected in the metabolic composition of the bacterium including a few thousand small molecular weight chemicals. Comparing the metabolic profiles of wild type and mutant strains, either untreated or treated with a particular drug, can effectively allow target identification and may lead to the development of novel inhibitors with anti-tubercular activity. Likewise, the effects of two or more conditions on the metabolome can also be assessed. Nuclear magnetic resonance (NMR) is a powerful technology that is used to identify and quantify metabolic intermediates. In this protocol, procedures for the preparation of M. tuberculosis cell extracts for NMR metabolomic analysis are described. Cell cultures are grown under appropriate conditions and required Biosafety Level 3 containment,1 harvested, and subjected to mechanical lysis while maintaining cold temperatures to maximize preservation of metabolites. Cell lysates are recovered, filtered sterilized, and stored at ultra-low temperatures. Aliquots from these cell extracts are plated on Middlebrook 7H9 agar for colony-forming units to verify absence of viable cells. Upon two months of incubation at 37 &deg;C, if no viable colonies are observed, samples are removed from the containment facility for downstream processing. Extracts are lyophilized, resuspended in deuterated buffer and injected in the NMR instrument, capturing spectroscopic data that is then subjected to statistical analysis. The procedures described can be applied for both one-dimensional (1D) 1H NMR and two-dimensional (2D) 1H-13C NMR analyses. This methodology provides more reliable small molecular weight metabolite identification and more reliable and sensitive quantitative analyses of cell extract metabolic compositions than chromatographic methods. Variations of the procedure described following the cell lysis step can also be adapted for parallel proteomic analysis.

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

The metabolomic profile of Mycobacterium tuberculosis is determined after growth in broth cultures. Conditions can be varied to test the effects of nutritional supplements, oxidants, and anti-tuberculosis agents on the metabolic profile of this microorganism. Procedure for extract preparation is applicable for both 1D 1H and 2D 1H-13C NMR analyses.

לדוגמא הכנה של<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; תמציות ללימודי metabolomic תהודה מגנטיים גרעיניים

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

גידול של שחפת Mycobacterium Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

מודל ניסיוני לחקר המלריה שחפת-coinfection על הילוכים טבעיים של חפת Mycobacterium ו Berghei Plasmodium</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

הקרנת תפוקה גבוהה לספקטרום רחב כימיים מעכבי RNA וירוסים

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

הוכחת סמים רבים עמידים<em&gt; חפת Mycobacterium</em&gt; Microarray ההגברה

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

הקרנה מהירה של HIV ההפוך טרנסקריפטאז וintegrase המעכבים

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us understand the disease mechanisms and advance the discoveries of new treatment options. In vitro cell cultures of monolayers or co-cultures lack the three-dimensional (3D) environment and tissue responses. Herein, we describe an innovative in vitro model of a human lung tissue, which holds promise to be an effective tool for studying the complex events that occur during infection with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The 3D tissue model consists of tissue-specific epithelial cells and fibroblasts, which are cultured in a matrix of collagen on top of a porous membrane. Upon air exposure, the epithelial cells stratify and secrete mucus at the apical side. By introducing human primary macrophages infected with M. tuberculosis to the tissue model, we have shown that immune cells migrate into the infected-tissue and form early stages of TB granuloma. These structures recapitulate the distinct feature of human TB, the granuloma, which is fundamentally different or not commonly observed in widely used experimental animal models. This organotypic culture method enables the 3D visualization and robust quantitative analysis that provides pivotal information on spatial and temporal features of host cell-pathogen interactions. Taken together, the lung tissue model provides a physiologically relevant tissue micro-environment for studies on TB. Thus, the lung tissue model has potential implications for both basic mechanistic and applied studies. Importantly, the model allows addition or manipulation of individual cell types, which thereby widens its use for modelling a variety of infectious diseases that affect the lungs.

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

דגם רקמות 3D ריאות אדם ללימודים פונקציונליים ב<em&gt; חפת Mycobacterium</em&gt; זיהום

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Assay תואם תפוקה גבוהה כדי להעריך יעילות התרופה נגד Macrophage passaged<em&gt; שחפת Mycobacterium</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

הדמיה שחפת Mycobacterium בעכברים עם הכתב אנזים קרינה פלואורסצנטית

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability to multiply inside such cells. These virulence traits render M. abscessus pathogenic, especially in vulnerable hosts with underlying structural lung disease, such as cystic fibrosis, bronchiectasis or tuberculosis. How patients become infected with M. abscessus remains unclear. Unlike many mycobacteria, M. abscessus is not found in the environment but might reside inside amoebae, environmental phagocytes that represent a potential reservoir for M. abscessus. Indeed, M. abscessus is resistant to amoebal phagocytosis and the intra-amoeba life seems to increase M. abscessus virulence in an experimental model of infection. However, little is known about M. abscessus virulence in itself. To decipher the genes conferring an advantage to M. abscessus intracellular life, a screening of a M. abscessus transposon mutant library was developed. In parallel, a method of RNA extraction from intracellular Mycobacteria after co-culture with amoebae was developed. This method was validated and allowed the sequencing of whole M. abscessus transcriptomes inside the cells; providing, for the first time, a global view on M. abscessus adaptation to intracellular life. Both approaches give us an insight into M. abscessus virulence factors that enable M. abscessus to colonize the airways in humans.

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Here, we present two protocols to study Phagocyte-Mycobacterium abscessus interactions: the screening of a transposon mutant library for bacterial intracellular deficiency and the determination of bacterial intracellular transcriptome from RNA sequencing. Both approaches provide insight into the genomic advantages and transcriptomic adaptations enhancing intracellular bacteria fitness.

זיהוי סמנים התקפה אלימה של Mycobacterium abscessus עבור שכפול תאיים ב Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...