המחברים רוצה להכיר אליזבת הלנה Bruun, שרה כריסטין כריסטנסן ו נילס מ Kristiansen לקבלת סיוע טכני, קרן לונדבק להעניק מספר R155-2013-14113.

מחברי הדו ח אין ניגוד אינטרסים.

טיהור והתפשטות של pBEC
במהלך ההליך טיהור, שלבים קריטיים כוללות הסרה מהירה ויעילה של קרומי המוח והפרדה של חומר לבן ואפור, וזה חשוב עבור טיהור ביבול ובאיכות טוהר ועבור הקמת הדגם המתאים. לדגם הציג במבחנה BBB באמצעות pBECs, יש שיפור ואנו פשוטה הליך טיהור בהתבסס על המגון מכני של החומר האפור מבודד, גודל סלקטיבית סינון עבור בידוד של microvessels, מערכת העיכול עם collagenase , DNase וטריפסין, עם תרבות הראשונית של קטעים microvessel. באופן כללי, אחד האתגרים הגדולים במהלך טיהור והטיפוח של תאים העיקרי הוא חיסול של תאים מזהמים. ניסיון עם טיהור תאי אנדותל מוח ראשוניים מצביעים כי הסרה יסודית של קרומי המוח וגם חומר לבן תוצאות שיפור טוהר ועם תשואה של נימים, וכן גדל תא אנדותל הצמיחה וביטוי של BBB המאפיינים. מסיבה זו, זהיר הסרה של קרומי המוח (כולל בתוך sulci) בפרוטוקול הציג נועד להבטיח הסרה של תאים leptomeningeal (אשר יש תכונות כמו פיברובלסט), כמו גם של תאי שריר חלק עורקים ו arteriolar, אשר גדלים במהירות רבה יותר מאשר תאי אנדותל בתרבות. באופן דומה, וצמצום של החומר הלבן גרמו בתרבויות תא אנדותל מזוכך, עם תאים מזהמים פחות גדל מן השברים נימי מבודד. עם זאת, זה פשוטה שיטה מהירה חלה לבידוד מוריד את התשואה של נימים מבודד ו אופטימיזציה של החומר האפור בידוד יכול לשפר באופן משמעותי את התשואה של כל המוח. הדרגה צפיפות, אשר כלולה של פרוטוקול חלופי טיהור69, ניתן לבודד תאי אנדותל חינם ושיפור תא אנדותל טוהר, אבל זמן רב והוא גם יכול להוריד את התשואה. שתי השיטות לטיהור יש כבר בהרחבה בשימוש, מאופיין, ולשתף את מאפייני יצירת מודלים pBEC TEER גבוהה ב- MC והן אסטרוציט תרבות משותפת (בדרך כלל 500-1500 Ω ס מ2)7,16, 21,22,49,57,70,71.
כדי לבסס את monolayers עם paracellular גבוהה restrictiveness, הניסיון הוכיח כי חייבים לסלק pericytes של תרבויות אנדותל ה-16. המוח חזירי pericytes בדרך כלל לגדול מתחת לשכבות pBEC, ולעולם לא לגרום חורים בשכבות אנדותל, כפי שנצפה על תרבויות של עכברוש המוח תאי אנדותל72,73. Pericytes ב pBEC תרבויות לעשות, לעומת זאת, נוטים להשפיע על המורפולוגיה של תאי אנדותל, אשר מופיעים רחבה יותר, עם תאים חריגים הדיירים16. כי תאי אנדותל המוח אקספרס רמות גבוהות יותר של מובילי בזרימת (למשל P-גליקופרוטאין) מאשר סוגי תאים אחרים, microvessels, מספר התאים מזהמים יכול להיות מופחת על ידי טיפול puromycin74. בנוסף, שימוש בסרום נגזר פלזמה (PDS) יותר מאשר העגל עוברית או neonatal נגזר טובות בסרום הצמיחה של תאי אנדותל, כמו PDS יש ריכוז נמוך יותר של גורמי גדילה כמו נגזר טסית פקטורי גדילה וצמיחה אנדותל כלי הדם פקטור, אשר מוצגים כדי להגדיל את חדירות BBB ולעורר אנגיוגנזה14,75,76,77. על ידי היכרות עם תרבות הראשונית של קטעים נימי מבודד ושילוב זה עם טיפול puromycin (4 µg/mL) ושימוש PDS, הצלחנו מאוד לצמצם את מספר התאים מזהמים שנותרו לאחר הטיהור, כך לאחר מכן נוכל להקים monolayers אנדותל חזק על קרום חדיר מוסיף. על מנת להבטיח המצורף הטוב ביותר של תאי אנדותל על תרבות מנות והן קרום חדיר הוספה משטחים, זה נצפתה תערובת לציפוי של קולגן מסוג IV (מן השליה האנושית) fibronectin מגדיל מאוד התפשטות התשואות, התערובת משולב ולכן היה להעדפה על השיטה המסורתית באמצעות רק קולגן מסוג I78.
התמיינות של תאים ושל הקמת מודל TEER גבוהה במבחנה BBB
PBECs ב- MC שומרים בדרך כלל על BBB מפתח תכונות רבות בעקבות בידוד, כך תרבות משותפת עם האסטרוציטים אינה חיונית עבור גרימת צמתי צר פונקציונלי ולהשיג גבוהה TEER ערכי16,57. המאמצים כדי למטב את התנאים התמיינות של תאי אנדותל לתוך BBB פנוטיפ כוללות שימוש בסרום המכילות בינוני בתוספת 8-CPT-מחנה, הידרוקורטיזון7 (עולה תאיים מחנה רמה13), RO 20-1724 (שמירה על רמת המחנה תאיים), אשר לפי הקודם ממצאים74,79 יחד בהצלחה משופרת ההידוק מכשול, גדל TEER, ייתכן סייעו גם לשחזר יותר אין ויוו כמו ביטוי גנים פרופיל80. עם זאת, השימוש של הידרוקורטיזון עבור הידוק של שכבת אנדותל רשאית לשנות את התגובה של תאי אנדותל לגירויים מסוימים, ולצורך באמצעות המודל לחקירה של התגובות הכימותרפיה, ציטוקינים בעת דלקת, השימוש הידרוקורטיזון, ייתכן שיהיה עליך להימנע.
מחקרים השוואתיים עם MC, MC עם ACM, אסטרוציט תרבויות משותפת במעבדות שני המשתתפים ובמקומות אחרים, הוכח כי התרומה astrocytic הוא מסוגל לשיפור תכונות BBB אנדותל והגברת ההידוק מכשול 21 , 40 , 42 , 49 , 79 , 81 , 82 , 83. כדי להשיג כזה ביטוי גבוהה של BBB פנוטיפ ב- pBECs, אנחנו הוקמה NCC עם האסטרוציטים ומצא כי שניהם חזירי האסטרוציטים העיקרי חולדה היו מועיל, כמו גם נצפתה אחרים מעבדות22. במהלך הקמת אסטרוציט NCCs, הניסיון הוכיח כי הטוהר ואת הגיל של התרבויות אסטרוציט להשפיע ההדיקות המכשול אנדותל וכתוצאה מכך, with הגיל האופטימלי של האסטרוציטים להיות 2-8 שבועות, אשר עולה בקנה אחד עם החלפת נצפתה ב המורפולוגיה אסטרוציט לאורך זמן. ביום שלפני הקמת את NCC, שינוי בינונית עבור האסטרוציטים נועד להסיר מטבוליטים מזיקות, לאפשר מספיק זמן האסטרוציטים לשחרר איתות הגורמים המשפיעים על התפתחות מכשול ולניתוח. כאשר שיתוף culturing תאי אנדותל של האסטרוציטים במערכת הוספה קרום חדיר, חשוב להקדיש תשומת לב מיוחדת כדי הטיפול של המודל מכשול. במהלך שינוי בינוני, השאיפה וגם תוספת של המדיום, את התנועות של התוספות חייב להיעשות בקפידה על מנת למזער שיבושים של המכשול אנדותל.
הפארמצבטית ואמינות
אתגר גדול בעת שימוש ראשוני התאים להקמת מודלים במבחנה היא להשיג הפארמצבטית גבוהה בין תרבויות. סטנדרטיזציה כזה יכול להתקיים לפי הבחירה של השיטה, השימוש בכלים איכותיים, ריאגנטים, וניסיון microdissection. הפארמצבטית גבוהה עם נמוכה וריאציה אצווה-כדי-אצווה עבור פעולת השירות הציג לכן תלויים במידה רבה הקפדה על ההליכים המתוארים.
כדי להשיג על הפארמצבטית טוב בין אצוות בקבוקונים במהלך TEER מדידות, תא המדידה של התנגדות רקמות או אפיתל מדי מתח עם אלקטרודות מיניאטורי נוקשה, יותר מאשר אלקטרודות המקל גמיש יכול לשמש, הפחתת השתנות של ערכים TEER הנצפה. בנוסף השגת ערכים גבוהים של TEER (איור 4), אישר את המהימנות של המודל הציג את המתאימה נמוכה קטנים ממס החדירות (איור 4), וכן אפיון immunocytochemical pBECs (איור 5 ).
מגבלות של שיטה יישומית, מודל
השימוש של חזירים הטרנסגניים ו זעיר גדל במהלך העשורים האחרונים, אבל כמות הנתונים בתוך vivo הוא עדיין מוגבל בהשוואה לנתוני מודלים מכרסמים, ולכן עשוי להוות אתגר להשוואת הנתונים במבחנה חזירי עם תוצאות ויוו . עם זאת, כפי הביולוגיה של החזיר משקף הביולוגיה האנושית באופן הדוק יותר חיות הוקמה מעבדה רבות, חזיר מהונדס מודלים עבור הלומדים מחלות נוירולוגיות כגון מחלת אלצהיימר כבר עכשיו נוסדה84, הזמינות של אין ויוו נתונים צפוי להיות פחות בעייתי עם הזמן.
מגבלה של קרום חדיר להוסיף מערכת מודלים הנוכחית של BBB הוא חוסר היכולת לחקות את זרימת הדם ב- microvessels. In vivo, גזירה הוכח כדי להשפיע על היבטים רבים של תאי אנדותל פיזיולוגיה כגון החטיבה, בידול, הגירה, אפופטוזיס85,86, וכדי להשפיע על המאפיינים החשובים של BBB כגון הביטוי של חלבונים מהחיבור, ואת אינדוקציה קיטוב של מובילי61,85,87. כדי להציג את תנאים, microfluidic פיתח מערכות יכול להיחשב88,89,90.
שיטה שימושית כדי לתקן עבור האפקט של שכבת מים unstirred (שכבת גבול מימית) מנתוני חדירות ' במבחנה הוא להפיק את החזוי 'חדירות מהותי' ויוו, באמצעות גישה מבוססת-תוכנה21. תוכנה זו יכולה לשמש גם עבור ניתוח נתונים מפורט חדירות21.
יישומים עתידיים ועל כיווני השיטה
כפי הרכיבים של יחידת נוירו-וסקולריים הוכחו תפקיד חשוב ב גרימת ושמירה על תכונות BBB, מודל לא במבחנה הנוכחי עדיין לא הצליח לחקות באופן מלא את התנאים ויוו , המרכיבים החשובים ו אינטראקציות עדיין עלול להיות חסר. המאמצים הנוכחיים בפיתוח הדגם הציג כוללים הקמת טריפל-תרבות דגמים עם האסטרוציטים, pericytes וגם ניסויים שילוב תאים של מינים שונים. תיאגוד pericytes כה לא נצפתה להגדיל באופן משמעותי את רמות TEER של המכשול. עם זאת, מודלים חזירי syngeneic נצפו דומות לאלו לשלש תרבויות באמצעות תאי אנדותל המוח חזירי, האסטרוציטים חולדה עכברוש pericytes מכשול אטימות, ביטוי של חלבונים סימן ההיכר האופייניים המוח אנדותל22. כדי לפתח מודל המבוסס על תאים אנושיים, התפתחויות עתידיות של במבחנה BBB מודלים עבור גילוי תרופות ואספקה עשוי להסתמך על ההטיה של גזע pluripotent האנושית ואת גזע בוגרים ו/או קדמון תאים21.

המבנה התאי ותפקוד מחסום הדם - מוח
-הממשק של הדם ומרכזי מערכת העצבים (CNS), BBB משמש אתר רגולטורי המפתח לשליטה homoeostatic של microenvironment מערכת העצבים המרכזית, שהוא חיוני לתפקוד תקין והגנה של מערכת העצבים. האתר של BBB הוא התאים אנדותל המצפים לומן כלי דם. נימים המוח, תאי אנדותל ליצור מורכבות המערכת צמתי צר, ביטוי חזק מקוטב דפוסים של מובילי זרם, בזרימת מסוים להבטיח תחבורה מולקולרי ספציפי מאוד בין הדם של המוח 1. מרכיביה המבניים של מתחמי צמוד לצומת לכלול חלבונים מן המשפחה occludin, claudin, zonula occludens (זואי) חלבונים, cingulin, ומקושרת מולקולות אדהזיה מהחיבור (ריבות). Claudin 5 חשוב במיוחד ההגבלה מהחיבור paracellular. תחזוקה של פנוטיפ אנדותל האופיינית הזאת BBB לערב דינמי אינטראקציות עם התאים שמסביב, כולל pericytes, האסטרוציטים, נוירונים, את הקרומים המרתף, אשר יחד עם המוח אנדותל תאים טופס נוירו-וסקולריים יחידה (NVU)2,3. המנגנונים המעורבים אינטראקציות אלה אינם עדיין לגמרי מובנים, אבל כוללים חילופי אותות כימיים בין תאים, אשר מאפשר אפנון של BBB חדירות בטווח הקצר ומשרה BBB לטווח ארוך כולל4. האסטרוציטים במיוחד ידועים לתרום ותפקיד תאי אנדותל המוח, הם מקור של גורמים רגולטוריים כגון פקטור (להשפיע על מחנה תאיים) גליה נגזר neurotrophic5, בסיסי פיברובלסט גורם הגדילה6, הידרוקורטיזון7, הפיכת גורם הגדילה β (TGF-β)8. עם זאת, ההשפעה של TGF-β, כבר התווכחו9.
In Vivo במבחנה BBB
מחקרים in vivo להמשיך לספק מידע רב ערך על BBB ביולוגיה. עם זאת, מודלים התרבות התא יכול לספק תובנות נוספות ומהווים כלים שימושיים להבנת היבטים פונקציונליים המולקולריים מפורט של BBB על בריאות ומחלה. יחסי גומלין מורכבים סוגי תאים ומרכיבים של BBB אמנם קשה להשיג באופן מלא דגמים במבחנה , היה, מאז הטיהור הראשון של תאי אנדותל המוח ויישום של אלה בתרבויות-מונו 10 , 11 , 12, פיתוח נרחב של תהליכי טיהור, תנאי הגידול של BBB תא מודלים תרבות, וכתוצאה מכך דמיון גדול עד המחסום ויוו . הדגמים BBB נפוץ במבחנה מבוססים על ראשי תאים של מכרסמים, חזירי, ומקור שור ועל שורות תאים מונצח. כל דגם כולל החסרונות והיתרונות שונים. השוואה ומודל בחירה, סמני אימות כגון הביטוי של BBB אנזימים, שנאים, קולטנים חלבונים מבניים משמשות ליצירת סקירות ויצר מודלים הנוכחית1.
מטרת הפרוטוקול
תכונה חשובה אחת של BBB מכשול מהבלוטות ומניעת TEER גבוהה, אך מספר גדול של הדגמים זמינים ואינם משקפים היטב את רמות ויוו . שילוב תרומות פיתוח ואופטימיזציה של מספר מעבדות, המטרה של פרוטוקול זה היא להציג שיטה להקמת גבוהה TEER במבחנה BBB מודל המבוסס על pBECs ראשי MC עם או בלי ACM, או NCC עם ראשי האסטרוציטים של עכברוש או מקור חזירי. הליכים שהוחל והקמת המודל כוללות מאמצים לחסל תאים מזהמים וכדי לשפר את הבידול של pBECs לתוך הפנוטיפ BBB. עבודה זו הובילה להקמת מודלים TEER אמינים, עם חדירות נמוכה paracellular וביטוי פונקציונליים טוב של מפתח חלבונים מהחיבור חזק, שנאים, קולטנים. עם זאת, כפי האסטרוציטים גורם תורם פנוטיפ תא אנדותל המוח, שלושה מצבים שונים של תרבות מייצגים שלוש פנוטיפים שונים של תאי אנדותל המוח. מודל NCC שימושית במיוחד עבור מחקרים של מנגנונים מיוחדים מסוימים מעורב גילוי תרופות, מחקרים תחבורה וסחר תאיים, כמו גם עבור חקירת האינטראקציות תא-תא איפה ביטוי מכסימלי של BBB תכונות יתרון.
מקור והיסטוריה של הפרוטוקול
המודל pBEC המתוארים כאן מבוסס במידה רבה על המודל חזירי שפותחה במעבדות Eisai (לונדון) על ידי ד ר לואיס מורגן ועמיתיו, חישבת בהתבסס על מוצלחת קודמת המוח שור תא אנדותל דגם13. שיטת ההכנה התא המקורי היה רשתות שינוי סינון בשני שלבים באמצעות ניילון כדי לתפוס את microvessels, ואחריו צעד subculturing כדי לשפר את טוהר. בפיתוח קודמות של השיטה, אטימות פנוטיפ ומכשול BBB אופטימלית הושגו על ידי גידול בינוני שהושלם, כולל ACM. שינויים ותיקונים נוספים לשיטת נעשו על ידי ר' סקינר במעבדה של פרופ ' / ח' ש רותוול מנצ'סטר בבריטניה14,15. השיטה אומצה על ידי המעבדה אבוט, אשלגן כלורי לונדון, שם Patabendige עשה את זה משמעותי יותר פשוט להכין על ידי הימנעות משימוש האסטרוציטים או ACM בהריגת תאים מזהמים כמו pericytes עם puromycin. העיתונים הראשון אישר כי דגם MC נשמר כמה תכונות חשובות של ה- ויוו BBB, כולל צמתי צר יעיל, מערכות תחבורה ממברנה קולטן בתיווך transcytosis16,17 , 18 , 19 , 20. אח כ ס Yusof שוב נבדק תרבות משותפת אסטרוציט ונמצא זה לשפר באופן משמעותי TEER, אז זה הגרסה המועדפת כיום בשימוש המעבדה אבוט21. המודל כבר עכשיו בהצלחה להעביר את נילסן מ מעבדה בארהוס, איפה היו שינויים ותיקונים נוספים הציג (פרוטוקול זה), כולל גריי מפשט משנה החילוץ, באמצעות שלב סינון רשת אחת בלבד, וצעד ציפוי מסננים יחידה שילוב של קולגן, fibronectin. ההליך שימושית עבור בידוד של חזירי האסטרוציטים (פרוטוקול זה) התבססה על פרוטוקולים שפותחה על ידי המעבדה טי Moos באולבורג, שתואר על ידי תומסון ואח22. את TEER ומאפיינים אחרים של המודל שנוצר ב לונדון וב אהרחוס דומים, אשר מקנה בטחון לרעיון המודל בקלות מועברים בין מעבדות ומגיב היטב כדי התבוננות מעמיקה, רציונליזציה של שיטת השלבים. אכן, Yusof ס הקימה כעת דגם MC במדינה טרופית (מלזיה)23, אשר מעורבים התאמה נוספת עבור תנאים מקומיים ומקורות רקמות.
יתרונות על פני שיטות אלטרנטיביות וכיום הקימה מודלים
בהשוואה לתאי אנדותל מוח של פרה ומקור מכרסמים, pBECs לספק את היתרון של בעל שיעור נמוך יותר של אובדן ויוו BBB פנוטיפ בעקבות בידוד24. יתר על כן, pBECs מסוגלים להרכיב את המחסומים אנדותל צר יחסית, אפילו כאשר גדל ב- MC (Ω 800 ס מ2)16 לעומת רמות בדרך כלל דיווחו על monolayers של שורות תאים כגון bEND.5 ו- bEND.3 (50 Ω ס מ2) 25 , 26 , 27, cEND (300-800 Ω ס מ2)28,29,30, ואת cerebEND (500 Ω ס מ2)29,31,32, ומוח ראשוניים תאי אנדותל של העכבר (100-300 Ω ס מ2)האס. אס = "xref" > 33,34,35,36 , עכברוש (100-300 Ω ס מ2)37,38. עם זאת, TEER מראה תלות על ההליכים טיהור ותרבות. ברוב המקרים, התוספת של ACM או תרבות משותפת עם האסטרוציטים מראה השפעות המבדילים על תאי אנדותל ועלייה ב אטימות של שכבות אנדותל1. ובכל זאת, עם מאמצים כדי למטב את התנאים culturing, רק המודלים מבוססי שור הראו ערכי TEER להשוות המודלים מבוססי-חזירי (ממוצע של 800 Ω ס מ2 ב- MC, עד 2500 Ω ס מ2 בתרבות שיתוף אסטרוציט)13 ,39,40,41,42,43,44,45. כמו הדגמים בהתבסס על מוח ראשוניים שור תאי אנדותל הראו וריאציות גדול, בין ובתוך מעבדות14,45,46,47,48. הפארמצבטית יכול להיות בעיה. במודל pBEC שדווחו פה, המעבדות התורמים השיגו TEER דומה מאוד וערכי חדירות paracellular עם השתנות נמוך, והן בין מעבדות. ומכאן, זה צריך להיות אפשרי עבור מעבדות אחרות להקים מודל חזקים עם השתנות נמוך באמצעות השיטה המוצגת כאן. בנוסף ויוצרים שכבות אנדותל חזק, מודלים עם pBECs יש בעבר מאומתים על-ידי ביטוי של חלבונים צומת חזק, מובילי BBB פונקציונלי, רצפטורים, אנזימים והפגינו התאמה למגוון רחב של מחקרים15 , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59. יתר על כן, transcriptome שלא פורסמו נתונים על תרבויות המשנה pBECs מציגה פרופיל הצפוי של מובילי BBB, קולטנים (שלא פורסמו תוצאות, נילסן. et al.).
המודל מבוסס על חזירי BBB יש יתרון נוסף כמו הגנום, אנטומיה, פיזיולוגיה, ומשקפים התקדמות המחלה של החזיר הביולוגיה האנושית ברמה גבוהה מאשר דגמים אחרים הוקמה60, אשר הם חיוביים כולל בתעשייה הפרמצבטית. כמו חזירי המוח הם תופעת לוואי נפוצה של תעשיית הבשר, הם מהווים מקור נגיש בקלות של המוח תאי אנדותל, צמצום מספר בעלי חיים לצורך הניסויים, וגם לספק תשואה גבוהה טיהור מהמוח חזירי אחד. למרות טיהור והטיפוח של תאים העיקרי הוא במידה מסוימת זמן רב ודורש מומחיות התקינה מתארגנת המודל, ראשי תאים מפיקים הדגמים BBB הכי אמין. שורות תאים מונצחים לא יכול להיות תחליף, כמו תכונות חשובות כגון מכשול אטימות, פרופילי ביטוי טרנספורטר, ורגולציה microenvironment אינן משקפות את ממצאי הניסוי ויוו61, 62. מודלים במבחנה לספק יתרון לחיות תאים הדמיה עם רזולוציה גבוהה יותר, כך ויזואליזציה של תהליכים תאיים מאפשר מתן אפשרות גישה בסמיכות לתאי שנדגמו או שנצפה, באמצעות מטרות עם הגדלה גבוהה יותר, איכות אופטית טובה יותר63. זה אינו המקרה לשימוש של מיקרוסקופ שני הפוטונים בבעלי חיים. יתר על כן, במבחנה מודלים מספקים את היכולת transfect תאים, המאפשר ויזואליזציה של חלבונים מתויג והחקירה של סחר שלהם.
יישומים של המודל
הפונקציה של BBB אינו קבוע, יכול להיות מאופנן באופן דינמי פיזיולוגיה והן פתולוגיה. מחלות נוירולוגיות רבות, כולל ניווניות, במחלות דלקתיות וזיהומיות, הפרעה, חדירות מוגברת של BBB נצפית64,65,66,67 . על מנת להפחית ולמנוע התקדמות המחלה ונזק עוקבות, זיהוי ואפיון של המנגנונים המולקולריים שבבסיס של האפנון של BBB הם בעלי חשיבות גדולה. בהקשר זה, מודלים אמינים במבחנה יש ביקוש גבוה על ידי תעשיית התרופות, יתר על כן תפקיד חשוב בחיזוי BBB החדירות של סמים על מערכת העצבים. כל במבחנה דגם הגשה המסך חדירות צריך להציג מסלול paracellular מגבילים, ארכיטקטורה התא מבחינה פיזיולוגית מציאותי, ביטוי פונקציונאלי של טרנספורטר מנגנונים68. הפגינו ב מחקרים קודמים16,17,57, ועל ידי paracellular חדירות וביטוי של טי-ג'יי, ג'יי חלבונים כאן, המודל הציג עונה על כל הקריטריונים האלה ומתאים לטווח של BBB מחקרים בולטים בשני פיזיולוגיה נורמלי בפתולוגיה. נקודות החוזק של שיטת טיהור וטיפוח הציג כוללים שילוב של פשטות, הפארמצבטית ואת היכולת לכלול astrocytic להשפיע בדגם שנוצר עמיד ואמין גבוהה TEER במבחנה BBB. בשביל זה מטרה, האסטרוציטים של חזירי ואלשין מקור הוכחו להגדיל את ותפקיד BBB של pBECs בצורה דומה22.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-719F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Low Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma derived serum (PDS)</td>
			<td>First Link UK Ltd.</td>
			<td>60-00-89</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>10-270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-CPT-cAMP</td>
			<td>Biolog</td>
			<td>C010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RO 20-1724</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Sulfate</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-518Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20,824,296</td>
			<td>Mix the 70 % solution from the 96 % EtOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse 1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase CLS2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made with Elga System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Transwell inserts (Cell permeable membrane inserts)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>CLS3401</td>
			<td>12-well plate, 12 mm diameter, 0.4 &#956;m polycarbonate membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml centrifuge tubes</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tubes</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>377224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 ml bottle</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>159910/159920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels</td>
			<td>Swann-Morten</td>
			<td>REF0211</td>
			<td>Type 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue homogenizer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>140 &#956;m filters</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>NY4H04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m filters</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndOhm chamber system</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>ENDOHM-12</td>
			<td>EndOhm chamber for 12mm Culture Cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM2 electrode system</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>300523+STX100C</td>
			<td>TEER measurement system with rigid STX-100C electrode pair</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long needle</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Attach to a syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tip curved forceps</td>
			<td>KLS Martin</td>
			<td>12-409-12-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Broad tip forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter holder</td>
			<td>MERCK Milipore</td>
			<td>Swinnex-47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4617509F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SSt20ESI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Occludin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab31721</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p120 Catenin antibody</td>
			<td>BD Transduction laboratories</td>
			<td>610133</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ZO-1 antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>61-7300</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Claudin 5 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4502981</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rabbit IgG conjugated with Alexa Flour 568</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A10042</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti mouse IgG conjugated with Alexa Flour 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A21202</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEC100X250UC</td>
			<td>0.15&#181;l/ml final working conc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lucifer Yellow</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0144</td>
			<td>10 &#181;g/ml final working conc</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved method for the establishment of an in vitro blood-brain barrier model based on porcine brain endothelial cells

המטרה של פרוטוקול זה מציג את הליך בלתי אופטימליים לטיהור ודה הטיפוח של pBECs ולהקים במבחנה מחסום הדם - מוח (BBB) מודלים בהתבסס על pBECs, מונו-תרבות (MC), MC ממוזגים אסטרוציט בינונית (ACM), ו תרבות משותפת (NCC) עם האסטרוציטים של חזירי ללא מגע או עכברוש מקור. pBECs היו מבודדים ותרבותית של שברי נימים מ cortices המוח של חזירים במשפחה בת 5-6 חודשים. קטעים אלה היו מטוהרת על-ידי הסרת זהיר של קרומי המוח, בידוד המגון של החומר האפור, סינון, עיכול אנזימטי צנטריפוגה. לחסל עוד תאים מזהמים, שברי נימי היו תרבותי עם puromycin המכילות בינוני. כאשר 60-95% confluent, pBECs גדל מן השברים נימי היו passaged את קרום חדיר המסנן מוסיף והקימו במודלים. כדי להגדיל את מחסום מהבלוטות ומניעת BBB פנוטיפ אופייני של pBECs, התאים שטופלו הגורמים בידול הבאים: ממברנה permeant 8-CPT-מחנה (מחנה מקוצר כאן), הידרוקורטיזון, מעכב phosphodiesterase, RO-20-1724 (RO). ההליך בוצע על פני תקופה של 9-11 ימים, בעת יצירת מודל NCC, האסטרוציטים היו תרבותי 2-8 שבועות מראש. ההקפדה ההליכים המתוארים בפרוטוקול אפשרה את הקמת שכבות אנדותל עם חדירות paracellular מוגבלת מאוד, עם NCC המודל מראה על ממוצע transendothelial ההתנגדות החשמלית (TEER) 1249 ± Ω 80 ס מ 2, ו paracellular חדירות (Papp) עבור לוציפר צהוב 0.90 10-6 ± 0.13 10-6 ס מ סק-1 (זאת אומרת ± SEM, n = 55). הערכה נוספת של פנוטיפ pBEC הזה הראה ביטוי טוב claudin חזק חלבונים מהחיבור 5, זואי-1, occludin ו adherens של catenin p120 של צומת חלבון. המודל המוצג יכול לשמש למגוון רחב של מחקרים של BBB על בריאות ומחלה, עם החדירות paracellular מאוד מגבילה, מודל זה מתאים ללימודי תחבורה, וגדילת.

הקמתה של הדגמים במבחנה BBB
בשיטה שלו שהוצגו, אופטימיזציה, טיפוח של pBECs והקמת מערכת הוספה קרום חדיר עם MC או בלי ACM או NCC עם האסטרוציטים (איור 1) בוצע לתקופה של 9-11 ימים (איור 2). לבחירה של תאי אנדותל, תרבות הראשונית של קטעים נימי מטוהרים היה בשילוב עם טיפול puromycin לתקופה מקסימלית של 5 ימים, אשר חיסלה את רוב התאים מזהמים וקידם את הצמיחה של תאי אנדותל בצורת כישור מ צינור קפילר שברי (איור 3 א-ג). -יום 4-6, pBECs היה התרבו כדי confluency של % 60-95, גדל ככל שאינם חופפים, עכבות-קשר, מיושר longitudinally תאים. כאשר התאים הגיעו את confluency הרצויה, pBECs מצופים קולגן IV ו fibronectin מצופה קרום חדיר הוספת מסנן ממברנות (1.12 ס"מ2 פני השטח, נקבוביות מיקרומטר 0.4)-צפיפות של 1.1 x תאים5 10/הוספה, על אילו הם בדרך כלל נוצר confluent monolayers אחרי 4 ימים (יום 8-10 לפרסם בידוד). כאשר שיתוף culturing pBECs, האסטרוציטים של עכברוש או מקור חזירי מצופים על התחתון מצופה פולי-L-ליזין בארות למשך תקופה מינימלית של 2 שבועות לפני שמתחילים את NCC (דמות תלת-ממד). בעת יצירת את NCC, הניסיון הוכיח כי האסטרוציטים תרבותי 2-8 שבועות מספק את התמיכה המיטבית לקידום של פנוטיפ BBB ב pBECs; בתוך הזמן הזה, האסטרוציטים הקים תרבויות confluent עם תאים המסודרות במבנה דמוי חלת דבש (3E איור-F). ביום 4 במודל המערכת של קרום חדיר הוספה (יום 8-10 פוסט בידוד), התאים היו מגורה עם מחנה, הידרוקורטיזון RO כדי להגדיל את מחסום מהבלוטות ומניעת BBB דפוס ביטוי אופייני של חלבונים מהחיבור חזק, מובילים, ו קולטנים.
אפיון pBEC פנוטיפ, חדירות Paracellular
בדיקה חזותית תא בשילוב עם TEER מדידה דרכים באופן שגרתי האמינים ביותר להעריך את confluency ואת אטימות השכבה תא אנדותל גוברת על התוספות קרום חדיר לפני הניסויים. איור 4 מציג תוצאות שתי סדרות של ניסויים כדי להעריך מולקולה קטנה חדירות התרופה דרך BBB, בקרת פרמטרים של TEER (המשקף חדירות יוניים) בשילוב עם חדירות לכאורה21 (Papp, s ס מ-1) של סוכרוז radiolabeled או לצבוע מעקב לוציפר הצהוב (LY), המשקף paracellular חדירות של מולקולות קטנות לגמילה מסמים (~ 200-600 Da). תרכובת של עניין עם Papp גדול מ- Papp של סוכרוז או LY (בהתאם המשקל המולקולרי של התרופה) יכול להציע transcellular חדירות ו/או תעבורה על-פני התאים. איור 4 מראה כי קרום חדיר הוספת עם pBECs תרבותי מעל עכברוש האסטרוציטים, אצוות טוב של pBEC (למשל כאן LY מוגדר) יפיק TEERs טווח 500-2000 Ω ס מ2, עם כמה גבוה או נמוך. כמה סטיות תקן, במיוחד במהלך השלבים המוקדמים של למידה הפרוטוקול, ייתכן TEERs התחתון סביב 100-900 Ω ס מ2 (למשל כאן מוגדר סוכרוז). TEER מדידה מאפשר בחירה של מסננים, לדוגמה עם החל TEER &#62; ס מ 500 Ω2, מעל טווח של TEER המוצג, Papp היא עצמאית יחסית של TEER, מעידה על שכבת מחסום חזק מספיק ניסויים אלה. הפרוטוקול למדידת חדירות תלוי בסוג של ממס/לבנות. לקבלת תיאור של ההליך למדידת חדירות של מולקולות קטנות ב- NCC, פרוטוקול המתואר Yusof, SR, ואח. al21. הערכת ביטוי החלבונים צומת חזק ב- pBECs ב- NCC עם עכברוש האסטרוציטים הראה לוקליזציה של claudin 5 occludin, זואי-1 לאורך צמתי תא-תא, כפי שהראה immunofluorescence (איור 5A-C). כמו כן, catenin p120 adherens חלבון צומת הראה הפצה מוגדרים היטב לאורך צמתי תא-תא (איור 5D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56277/56277fig1.jpg"> 
איור 1: ייצוג סכמטי של הדגמים BBB במבחנה יישומית- ייצוג סכמטי של קרום חדיר להוסיף מערכת מודלים של pBECs MC (א), MC עם ACM (B)ו- NCC עם האסטרוציטים (C). ב במועדון, או מדיום הגידול pBEC או ACM הוחלו ב הבארות התחתון, ואילו ב- NCC, מוסיף עם pBECs הונחו בבארות עם 2-8-בת שבוע האסטרוציטים. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56277/56277fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56277/56277fig2.jpg"> 
איור 2: תרשים זרימה של השלבים העיקריים במהלך הטיפוח-תרגול pBEC והקמה של הדגמים שהוצגו. עבור סקירה וגם ציר הזמן עבור פעולת השירות, מצגת סכמטית זו מסכמת את השלבים העיקריים ההליך culturing של pBECs ואת הקמתה של הדגמים שהוצגו, קרי MC עם או בלי ACM, NCC עם האסטרוציטים. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56277/56277fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56277/56277fig3.jpg"> 
איור 3: מסלול הזמן נציג של תרבויות הראשונית של האסטרוציטים ועכברוש, pBECs. שלב חדות תמונות מיקרוסקופ של תרבויות של pBECs (A-C) ו האסטרוציטים (D-F) צפו ב במשך 5 ימים. מטוהר שברי נימי ביום הראשון של התרבות הראשונית הראתה נוכחות של נימים והן ההרסנית תאים (A, יום 1), איזה שינוי בינוני אחרי יום 2 וביום נוספים של צמיחה, הראה מבחר pBECs, החל הצמיחה שלהם השברים נימי (B, יום 3). Monolayers confluent של pBECs הושגו בדרך כלל ביום 4-6, ובו בזמן pBECs הראו מורפולוגיה בצורת כישור, היו מיושרים longitudinally (ג). האסטרוציטים עכברוש נזרע בתחתית בארות בדרך כלל התרבו לשכבות confluent בתוך 5 ימים (D-F), שימשו לדגמי NCC לאחר 2 שבועות של צמיחה. סרגל קנה מידה עבור כל התמונות: 200 מיקרומטר. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56277/56277fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56277/56277fig4.jpg"> 
איור 4: צומת חזק שלמות של pBECs. חדירות נראית לעין (Papp) של pBECs לסמני paracellular סוכרוז (MW 342.5 14C-מתויג, 14.8-25.9 GBq/mmol), המותווה לוציפר צהוב (MW 521.57, µg 10 מ ל-1), נגד TEER. pBECs גדלו ב- 1.12 ס"מ2 קרום חדיר הוספת מסננים מעל עכברוש האסטרוציטים בבסיס של טוב, סמני הוסיף לתא הפסגה. לאחר שעה-37 & #730; C, המראה של סמן בבית הבליעה הבזליים היה הפסגה-כדי-הבזליים הסלסולים Papp (x 10-6 ס מ סק-1) מחושב. TEER נמדדה &#62; h 3 לפני Papp, באמצעות אלקטרודות STX100C EVOM, תיקן עבור מסנן הוספה קרום חדיר ריק עם התנגדות 150 Ω. TEER הממוצע עבור ערכת הנתונים צהוב לוציפר היה 1249 ± 80 Ω ס מ2 (זאת אומרת ± SEM, n = 55). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56277/56277fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56277/56277fig5.jpg"> 
איור 5: אפיון Immunocytochemical pBECs. עבור pBECs גדל על 1.12 ס"מ2 קרום חדיר הוספה מסנן מוסיף מעל עכברוש האסטרוציטים הבאר הבסיס, immunofluorescence ניתוח מיקרוסקופיה של הרכיבים צמוד לצומת Claudin () 5 (B) Occludin (ג) זואי-1. adherens צומת חלבון (D) p120 catenin הראה לוקליזציה מוגדרים היטב ובצמתים תא-תא חשף המוח confluent שכבות תאי אנדותל עם תאים בצורת כישור, שאינם חופפים. סרגל קנה מידה עבור כל התמונות: 10 מיקרומטר. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56277/56277fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells at JoVE.com

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

שיפור שיטה להקמת במבחנה מחסום הדם - מוח מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי

המטרה של הפרוטוקול היא להציג את הליך בלתי אופטימליים להקמת במבחנה מחסום הדם - מוח (BBB) מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי הראשי (pBECs). המודל מראה הפארמצבטית גבוהה, אטימות גבוהה, מתאים ללימודי תחבורה, וגדילת גילוי סמים.

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

improved-method-for-establishment-an-vitro-blood-brain-barrier-model

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

14.7K Views.  Aarhus University. המטרה של הפרוטוקול היא להציג את הליך בלתי אופטימליים להקמת במבחנה מחסום הדם - מוח (BBB) מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי הראשי (pBECs). המודל מראה הפארמצבטית גבוהה, אטימות גבוהה, מתאים ללימודי תחבורה, וגדילת גילוי סמים.

Video: Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

MRI-guided Disruption of the Blood-brain Barrier using Transcranial Focused Ultrasound in a Rat Model

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a significant obstacle to pharmaceutical treatments of brain disorders as it limits the passage of molecules from the vasculature into the brain tissue to molecules less than approximately 500 Da in size6. FUS induced BBB disruption (BBBD) is temporary and reversible4 and has an advantage over chemical means of inducing BBBD by being highly localized. FUS induced BBBD provides a means for investigating the effects of a wide range of therapeutic agents on the brain, which would not otherwise be deliverable to the tissue in sufficient concentration. While a wide range of ultrasound parameters have proven successful at disrupting the BBB2,5,7, there are several critical steps in the experimental procedure to ensure successful disruption with accurate targeting. This protocol outlines how to achieve MRI-guided FUS induced BBBD in a rat model, with a focus on the critical animal preparation and microbubble handling steps of the experiment.

Microbubble-mediated focused ultrasound disruption of the blood-brain barrier (BBB) is a promising technique for non-invasive targeted drug delivery in the brain1-3. This protocol outlines the experimental procedure for MRI-guided transcranial BBB disruption in a rat model.

MRI-מודרך שיבוש של מחסום דם מוח באמצעות אולטרסאונד ממוקד Transcranial מודל עכברים

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a ...

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain barrier1. The barrier selectively excludes molecules from crossing between the blood and the brain based upon their size and charge. This function can impede the delivery of therapeutics for neurological disorders. A number of chemotherapeutic drugs, for example, will not effectively cross the blood-brain barrier to reach tumor cells2. Thus, improving the delivery of drugs across the blood-brain barrier is an area of interest.
The most prevalent methods for enhancing the delivery of drugs to the brain are direct cerebral infusion and blood-brain barrier disruption3. Direct intracerebral infusion guarantees that therapies reach the brain; however, this method has a limited ability to disperse the drug4. Blood-brain barrier disruption (BBBD) allows drugs to flow directly from the circulatory system into the brain and thus more effectively reach dispersed tumor cells. Three methods of barrier disruption include osmotic barrier disruption, pharmacological barrier disruption, and focused ultrasound with microbubbles. Osmotic disruption, pioneered by Neuwelt, uses a hypertonic solution of 25% mannitol that dehydrates the cells of the blood-brain barrier causing them to shrink and disrupt their tight junctions. Barrier disruption can also be accomplished pharmacologically with vasoactive compounds such as histamine5 and bradykinin6. This method, however, is selective primarily for the brain-tumor barrier7. Additionally, RMP-7, an analog of the peptide bradykinin, was found to be inferior when compared head-to-head with osmotic BBBD with 25% mannitol8. Another method, focused ultrasound (FUS) in conjunction with microbubble ultrasound contrast agents, has also been shown to reversibly open the blood-brain barrier9. In comparison to FUS, though, 25% mannitol has a longer history of safety in human patients that makes it a proven tool for translational research10-12.
In order to accomplish BBBD, mannitol must be delivered at a high rate directly into the brain's arterial circulation. In humans, an endovascular catheter is guided to the brain where rapid, direct flow can be accomplished. This protocol models human BBBD as closely as possible. Following a cut-down to the bifurcation of the common carotid artery, a catheter is inserted retrograde into the ECA and used to deliver mannitol directly into the internal carotid artery (ICA) circulation. Propofol and N2O anesthesia are used for their ability to maximize the effectiveness of barrier disruption13. If executed properly, this procedure has the ability to safely, effectively, and reversibly open the blood-brain barrier and improve the delivery of drugs that do not ordinarily reach the brain 8,13,14.

Blood-brain barrier disruption aids the delivery of certain drugs to the brain. Mannitol delivered intra-arterially shrinks cells surrounding blood vessels in order to physically disrupt the barrier.

מודל עכברים של שיבוש מחסום דם מוח כדי לאפשר ממוקד Therapeutics Neurovascular

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying mechanisms involved in it are useful for treatment. There are both in vivo and in vitro methods available for this purpose. In vivo models can mimic actual head injury as it occurs during TBI. However, in vivo techniques may not be exploited for studies at the cell physiology level. Hence, in vitro methods are more advantageous for this purpose since they provide easier access to the cells and the extracellular environment for manipulation.
Our protocol presents an in vitro model of TBI using stretch injury in brain microvascular endothelial cells. It utilizes pressure applied to the cells cultured in flexible-bottomed wells. The pressure applied may easily be controlled and can produce injury that ranges from low to severe. The murine brain microvascular endothelial cells (cEND) generated in our laboratory is a well-suited model for the blood brain barrier (BBB) thus providing an advantage to other systems that employ a similar technique. In addition, due to the simplicity of the method, experimental set-ups are easily duplicated. Thus, this model can be used in studying the cellular and molecular mechanisms involved in TBI at the BBB.

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

In vitro traumatic brain injury models are being developed to reproduce in vivo brain deformation. Stretch-induced injury has been employed for astrocytes, neurons, glial cells, aortic, and brain endothelial cells. However, our system uses a blood brain barrier (BBB) model that possesses properties constituting a legitimate model of the BBB to establish an in vitro&#160;TBI model.

למתוח בתאי אנדותל כלי הדם במוח (cEND) כ<em&gt; במבחנה</em&gt; פגיעה מוחי טראומטי דגם של מחסום דם המוח

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

הגדרה למעלה<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום דם מוח חולדה (BBB): פוקוס על BBB האטים ותחבורה בתיווך קולטן

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

הפעלת יתר רעיל גירוי של המוח כMicroslices<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של שבץ

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic cerebrovascular accidents account for 80% of all strokes. A common cause of IR injury is the rapid inflow of fluids following an acute/chronic occlusion of blood, nutrients, oxygen to the tissue triggering the formation of free radicals.
Ischemic stroke is followed by blood-brain barrier (BBB) dysfunction and vasogenic brain edema. Structurally, tight junctions (TJs) between the endothelial cells play an important role in maintaining the integrity of the blood-brain barrier (BBB). IR injury is an early secondary injury leading to a non-specific, inflammatory response. Oxidative and metabolic stress following inflammation triggers secondary brain damage including BBB permeability and disruption of tight junction (TJ) integrity.
Our protocol presents an in vitro example of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) on rat brain endothelial cell TJ integrity and stress fiber formation. Currently, several experimental in vivo models are used to study the effects of IR injury; however they have several limitations, such as the technical challenges in performing surgeries, gene dependent molecular influences and difficulty in studying mechanistic relationships. However, in vitro models may aid in overcoming many of those limitations. The presented protocol can be used to study the various molecular mechanisms and mechanistic relationships to provide potential therapeutic strategies. However, the results of in vitro studies may differ from standard in vivo studies and should be interpreted with caution.

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.

חמצן גלוקוז קיפוח וReoxygenation כ<em&gt; במבחנה</em&gt; איסכמיה reperfusion פציעת דגם לחוסר תפקוד מחסום דם-המוח לומד

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.

This article presents a rapid and simple method for administering bleomycin directly into the mouse trachea via intubation. Key advantages of this method are that it is highly reproducible, easy to master, and does not require specialized equipment or lengthy recovery times.

שיטה משופרת עבור אינטובציה מהירה של קנה הנשימה של עכברים

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

An Anesthesia, Surgery, and Harvest Method for the Evaluation of Transpedicular Screws Using an In Vivo Porcine Lumbar Spine Model

Pedicle screw fixation is the gold standard for the treatment of spinal diseases. However, many studies have reported the issue of loosening pedicle screws after spinal surgery, which is a serious concern. To address this problem, diverse types of pedicle screws have been examined to identify those with good fixation strength and osseointegration in spine bone. The porcine spine is a good alternative for the human spine in the evaluation of pedicle screws due to the anatomical size, mechanical characteristics, and cost. Although several studies have reported that pedicle screws are efficient in the porcine model, no study has described detailed protocols for the evaluation of a pedicle screw using the porcine model. Here, we describe a detailed method for evaluating transpedicular screws using an in vivo porcine lumbar spine model. The technical details for anesthesia, spine surgery, and harvest provided here will facilitate with the evaluation of the transpedicular screw fixation model.

An Anesthesia, Surgery, and Harvest Method for the Evaluation of Transpedicular Screws Using an In Vivo Porcine Lumbar Spine Model

Here, we introduce a method to evaluate transpedicular screws by using an in vivo porcine lumbar spine model.

הרדמה, ניתוח, שיטת הקציר להערכת ברגים transpedicular באמצעות<em&gt; בויבו</em&gt; חור שדרה מותני

Pedicle screw fixation is the gold standard for the treatment of spinal diseases. However, many studies have reported the issue of loosening pedicle ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by astrocytes, pericytes and brain endothelial cells (BECs). Here, we detail methods to assess BBB coverage using single cultures of immortalized human BECs, single cultures of primary mouse BECs, and a humanized triple culture model (BECs, astrocytes and pericytes) of the BBB. To highlight the applicability of the assays to disease states, we describe the effect of oligomeric amyloid-&#946; (oA&#946;), which is an important contributor to Alzheimer&#39;s disease (AD) progression, on BBB coverage. Further, we utilize the epidermal growth factor (EGF) to illuminate the drug screening potential of the techniques. Our results show that single and triple cultured BECs form meshwork-like structures under basal conditions, and that oA&#946; disrupts this cell meshwork formation and degenerates the preformed mesh structures, but EGF blocks this disruption. Thus, the techniques described are important for dissecting fundamental and disease-relevant processes that modulate BBB coverage.

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Maintaining blood-brain barrier coverage is key for the homeostasis of the central nervous system. This protocol describes in vitro techniques to delineate the fundamental and pathological processes that modulate blood-brain barrier coverage.

ב מבחני מבחנה כדי להעריך דם מוח מחסום כמו רשת כלי שיטפון ושיבוש

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Establishment and Evaluation of a Porcine Vein Graft Disease Model

Venous graft disease (VGD) is the leading cause of coronary artery bypass graft (CABG) failure. Large animal models of CABG-VGD are needed for the investigation of disease mechanisms and the development of therapeutic strategies. 
To perform the surgery, we enter the cardiac chamber through the third intercostal space and carefully dissect the internal mammary vein and immerse it in normal saline. The right main coronary artery is then treated for ischemia. The target vessel is incised, a shunt plug is placed, and the distal end of the graft vein is anastomosed. The ascending aorta is partially blocked, and the proximal end of the graft vein is anastomosed after perforation. The graft vein is checked for patency, and the proximal right coronary artery is ligated. 
CABG surgery is performed in minipigs to harvest the left internal mammary vein for its use as a vascular graft. Serum biochemical tests are used to evaluate the physiological status of the animals after surgery. Ultrasound examination shows that the proximal, middle, and distal end of the graft vessel are unobstructed. In the surgical model, turbulent blood flow in the graft is observed upon histological examination after the CABG surgery, and venous graft stenosis associated with intimal hyperplasia is observed in the graft. The study here provides detailed surgical procedures for the establishment of a repeatable CABG-induced VGD model.

In this protocol, novel pig vein bypass grafting was performed through a small incision in the left chest wall without cardiopulmonary bypass. A postoperative pathology study was done, which showed intimal thickening.