אנו מודים חברי המעבדה Jha דיון מועיל וההערות שלהם. סניף נתמך על ידי מענקים קרן מחקר נבחרת סינגפור, סינגפור משרד החינוך תחת שלו מרכזי מחקר ביוזמת מצוינות סרטן המדע מכון של סינגפור (R-713-006-014-271), נבחרת רפואי מועצת המחקר (CBRG-כוש; BNIG11nov001 ו CS-IRG; R-713-000-162-511), קרן מחקר אקדמי משרד החינוך (T1 AcRF Tier 1 מו-2012 Oct -04). Y.Z., G.S.C. ו- C.Y.T. נתמכו על ידי מלגת תואר שני הוענק על ידי סרטן המדע מכון של סינגפור, באוניברסיטה הלאומית של סינגפור.

1. הכנה
<ol><li>להכין MCF10A תרבות בינוני: של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) / F12 (1:1) עם 5% סוסים סרום 20 ng/mL פקטורי גדילה אפיתל, 0.5 מ"ג/מ"ל הידרוקורטיזון, 100 ננוגרם למ"ל כולרה הרעלן, אינסולין µg 10/mL.</li>
	<li>להכין ללא סרום בינוני: DMEM/F12 (1:1) עם 20 ng/mL פקטורי גדילה אפיתל, 0.5 מ"ג/מ"ל הידרוקורטיזון, 100 ננוגרם למ"ל כולרה הרעלן אינסולין µg 10/mL.</li>
	<li>להשתמש ברצף siRNA הבא: siControl: קדימה: 5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3' הפוך: 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3' siTIP60: קדימה: 5'-UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT-3' הפוך: 5'-UCAUAGCUGAACUCGAUCAdTdT-3'</li>
	<li>להשתמש בתרבות תא ס מ-10 מנות וצלחות 24-. טוב.</li>
</ol>2. ארעי דלדול של TIP60 באמצעות siRNA
<ol><li>יום 1, aliquot 15 µL של תרביות תאים ריאגנט (למשל, Lipofectamine RNAiMAX) ו- 2 מיליליטר מופחת סרום בינונית (למשל, Opti-מ) ומערבבים אותם עם 10 µL של כל siRNA (10 מיקרומטר מלאי), בהתאמה.</li>
	<li>דגירה התערובת בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.</li>
	<li>זרע עונה 1 פרק 10 תאים6 MCF10A יחד עם 3 מ"ל של תרבות בינוני בקערה 10 ס מ. לספור את התאים באמצעות hemocytometer.</li>
	<li>להוסיף את התערובת siRNA טיפה על ידי שחרור המנה 10 ס מ.</li>
	<li>לנער את המנה כדי להבטיח כי התאים מופצים בצורה שווה לפני לשים אותו לתוך החממה 37 º C.</li>
	<li>לאחר 6 שעות של דגירה, החלף המדיום המכיל siRNA 8 מ של טרי בינוני תרבות.</li>
	<li>יום 2, להכין עוד קבוצה של siRNA תערובות, דגירה אותם בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.</li>
	<li>תשאף החוצה 8 מ של המדיום לתרבות הוסיף ביום 1 ולהחליף אותו עם 3 מ"ל של מדיום תרבות טריים.</li>
	<li>להוסיף הקבוצה השנייה של תערובת siRNA המנות טיפה על ידי ירידה. לנער את הכלים על מנת להבטיח כי ריאגנטים מעורבבים באופן מלא לפני ומכניסים אותם לתוך החממה.</li>
	<li>לאחר 6 שעות, החלף המדיום המכיל siRNA 8 מ של טרי בינוני תרבות.</li>
</ol>3. זרע תאים עבור וזמינותו ריפוי פצע
<ol><li>יום 3, למחוק את המדיום ולשטוף את התאים פעם אחת עם 2 מ"ל באגירה פוספט מאגר (PBS) מלוחים. לבטל את המאגר PBS.</li>
	<li>Trypsinize את siControl ואת התאים siTIP60 שטופלו על-ידי הוספת 1 מ"ל של 1 x טריפסין-EDTA מאגר לצלחת. תכניס אותו בחזרה החממה במשך 20 דקות.</li>
	<li>להוסיף 4 מיליליטר בינוני תרבות שלמה כל צלחת, resuspend את התאים על ידי pipetting, וכן להעביר אותם ל צינור 15-mL.</li>
	<li>צנטריפוגה-200 גרם במשך 5 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע.</li>
	<li>מחדש להשעות את התאים עם 5 מיליליטר בינונית ללא סרום ולספור את התאים באמצעות hemocytometer.</li>
	<li>להתכונן תא השעיה של 6 x 105 תאים למ"ל siControl והן siTIP60; ודא כי התאים נמצאים מעורבב היטב. להוסיף 500 µL של התליה תא אחד טוב של צלחת 24-טוב כדי להבטיח 100% confluency. זרע בארות 5 עד 6 כל עבור siControl ו- siTIP60.</li>
	<li>לנער בעדינות את צלחת הלוך ולאחר מכן מצד לצד כדי להבטיח הפצה אפילו. הימנע תנועה מעגלית. השאירו את הצלחת החממה במשך 24 שעות ביממה.</li>
	<li>לקצור את התאים הנותרים כדי לבדוק את יעילות תמונות ציפורים TIP60. כדי לעשות זאת, centrifuge התליה תא הנותרים-200 גרם במשך 5 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע.</li>
	<li>לבודד RNA באמצעות תגובה כימית מסחרי, הפרוטוקול של היצרן, והמשך PCR כמותי בזמן אמת כדי להעריך את היעילות תמונות ציפורים.</li>
</ol>4. ליצור את הפצע
<ol><li>בדוק במיקרוסקופ ניגוד שלב על מנת להבטיח כי התאים מחוברים באופן מלא. לבחון את התאים במיקרוסקופ (4 X 10 X, 20 X הגדלה) כדי להבטיח התאים מחוברים באופן מלא טפט confluent של תאים הקימה. הערה: תאים siControl לצרף בדרך כלל טוב יותר תאים siTIP60. זה צפוי כי דלדול של TIP60 גורם לתאים mesenchymal כמו עוד20. כאן, נעשה שימוש במיקרוסקופ ניגוד benchtop רגילה שלב אור לבן.</li>
	<li>כדי להפיק את הפצע, לגרד בעדינות בקו ישר על פני המרכז של הבאר עם טיפ פיפטה 200 µL; האורך של הפצע שנוצר הוא בדיוק כמו הקוטר של הבאר. חזור על שלב זה עבור כל בארות הנותרים. השתמש טיפ פיפטה חדש עבור כל טוב.</li>
	<li>בעדינות לשטוף כל טוב 5 פעמים שימוש ללא סרום בינוני כדי להסיר תאים מנותקת.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של מדיום ללא סרום כל טוב והמשך הדמיה לחיות תאים.</li>
</ol>5. כיוונון של הדמיה לחיות תאים
<ol><li>הפעלת המיקרוסקופ, בקרת טמפרטורה לפחות שעה לפני הגדרת לחיות תאים הדמיה כדי לוודא הטמפרטורה בתא יגיע 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הפעל את אספקת גז פחמן דו-חמצני (CO2) לפני שמתחילים את הדמיה לחיות תאים. הגדר CO2 ריכוז 5%.</li>
	<li>למקם את הצלחת 24-טוב על הבמה של המיקרוסקופ ובחר את העדשה המטרה עם 10 X הגדלה עבור הדמיה. לכוון האור הנפלט עיניות במקום המצלמה והתאימו את המוקד כדי לאתר את הפצע והתאים סביבו. הערה: במקרה זה, אור לבן עם ניגודיות שלב שימש.</li>
	<li>להשתמש במערכת הצופה לחיות תאים כדי לסמן את המיקום של הפצע כל טוב. הערה: השלב אוטומטיות של מערכת הדמיה לחיות תאים מאפשרת ייבוא תמונות מרובות ומעמדות. תמונות נלקחים על המיקום מסומן כל פעם בכל פרק זמן.</li>
	<li>להגדיר את התנאי זמן: 1 h מרווח הזמן ואת משך 72 h; על פי הגדרה זו, המערכת תיקח תמונות במיקום מסומנים כל כל שעה במשך 72 ה להגדיר את מרווח הזמן הרצויים ותקופת לניטור. הערה: כאן, משך זמן של 72 h הוא הטוב ביותר כי תאים אלה יתחילו למות לאחר 72 h במדיום נטול סרום.</li>
</ol>6. מעקב אחר תנועה תא בודד
<ol><li>יצא את הנתונים לאחר ה 72 לייצא את הנתונים כמו תמונות בתבנית JPEG וכן קטעי וידאו בפורמט AVI. הערה: זה חשוב כי התוכנה ImageJ רק יכול לזהות קטעי וידאו בפורמט AVI. המהירויות נדידת תאים שונים בין תאים siTIP60 ו- siControl יכול להיות שנצפו בבירור את הוידאו.</li>
	<li>פתח את וידאו AVI בתוכנה ImageJ.</li>
	<li>פתח את התוסף MTrackJ (התוסף בטח יורדו ויותקנו בנפרד): תוספים > MtrackJ.</li>
	<li>הוסף מסלול תאים בודדים שנבחרו מן הווידאו על-ידי לחיצה על הכרטיסיה 'הוסף' בסרגל הכלים MtrackJ. בחר תא בקצה הקדמי פולשנית תא יכול להעביר בכוחות עצמו (תא בודד העברה). לעקוב אחר התנועה של התאים שבחרת על הוידאו ולאתר אותם באמצעות MtrackJ.</li>
	<li>למדוד את המרחק של התנועה על-ידי לחיצה על הכרטיסיה "מדידה" בסרגל הכלים. הערה: כאן, כמעט לא התאים siControl עבר כמו תאים בודדים, עושה את זה קשה למדוד את תנועת מתא בודד, ואילו רבים מן התאים siTIP60 מתנועעות כמו תאים בודדים. עם זאת, התנועה של תאים הממוקמים בחזיתו פולשנית יכול עדיין להיות במעקב ומחושבים בתאים הן siControl והן siTIP60.</li>
	<li>לשמור את הווידאו עם שירים בפורמט AVI.</li>
</ol>7. כימות של יכולת העברה תא
<ol><li>על כימות, בחר תמונות ב- 0 h תמונות ב- h "n", איפה "n" מפנה timepoint כאשר תאים siTIP60 או siControl לחלוטין לסגור את הפצע. הערה: כאן, 48 שעות נבחר, כמו הפצעים בתאים siTIP60 נסגרו כמעט לחלוטין.</li>
	<li>לכמת את ההעברה אחוז שימוש ImageJ באמצעות הנוסחה הבאה: (אזור הפצע-0 h - אזור הפצע ב h "n") / אזור הפצע ב- h 0 x 100.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Fernandes, N., Price, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+Tip60+histone+acetyltransferase+in+the+acetylation+and+activation+of+ATM.">A role for the Tip60 histone acetyltransferase in the acetylation and activation of ATM.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13182-13187 (2005).</li><li>Sykes, S. M., Stanek, T. J., Frank, A., Murphy, M. E., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylation+of+the+DNA+binding+domain+regulates+transcription-independent+apoptosis+by+p53.">Acetylation of the DNA binding domain regulates transcription-independent apoptosis by p53.</a> J Biol Chem. 284 (30), 20197-20205 (2009).</li><li>Jha, S., Shibata, E., Dutta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Rvb1/Tip49+is+required+for+the+histone+acetyltransferase+activity+of+Tip60/NuA4+and+for+the+downregulation+of+phosphorylation+on+H2AX+after+DNA+damage.">Human Rvb1/Tip49 is required for the histone acetyltransferase activity of Tip60/NuA4 and for the downregulation of phosphorylation on H2AX after DNA damage.</a> Mol Cell Biol. 28 (8), 2690-2700 (2008).</li><li>Sapountzi, V., Logan, I. R., Robson, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+functions+of+TIP60.">Cellular functions of TIP60.</a> Int J Biochem Cell Biol. 38 (9), 1496-1509 (2006).</li><li>Squatrito, M., Gorrini, C., Amati, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tip60+in+DNA+damage+response+and+growth+control:+many+tricks+in+one+HAT.">Tip60 in DNA damage response and growth control: many tricks in one HAT.</a> Trends Cell Biol. 16 (9), 433-442 (2006).</li><li>Sun, Y., Xu, Y., Roy, K., Price, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage-induced+acetylation+of+lysine+3016+of+ATM+activates+ATM+kinase+activity.">DNA damage-induced acetylation of lysine 3016 of ATM activates ATM kinase activity.</a> Mol Cell Biol. 27 (24), 8502-8509 (2007).</li><li>Sykes, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylation+of+the+p53+DNA-binding+domain+regulates+apoptosis+induction.">Acetylation of the p53 DNA-binding domain regulates apoptosis induction.</a> Mol Cell. 24 (6), 841-851 (2006).</li><li>Tang, Y., Luo, J., Zhang, W., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tip60-dependent+acetylation+of+p53+modulates+the+decision+between+cell-cycle+arrest+and+apoptosis.">Tip60-dependent acetylation of p53 modulates the decision between cell-cycle arrest and apoptosis.</a> Mol Cell. 24 (6), 827-839 (2006).</li><li>Chen, G., Cheng, Y., Tang, Y., Martinka, M., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Tip60+in+human+melanoma+cell+migration,+metastasis,+and+patient+survival.">Role of Tip60 in human melanoma cell migration, metastasis, and patient survival.</a> J Invest Dermatol. 132 (11), 2632-2641 (2012).</li><li>Gorrini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tip60+is+a+haplo-insufficient+tumour+suppressor+required+for+an+oncogene-induced+DNA+damage+response.">Tip60 is a haplo-insufficient tumour suppressor required for an oncogene-induced DNA damage response.</a> Nature. 448 (7157), 1063-1067 (2007).</li><li>Jha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destabilization+of+TIP60+by+human+papillomavirus+E6+results+in+attenuation+of+TIP60-dependent+transcriptional+regulation+and+apoptotic+pathway.">Destabilization of TIP60 by human papillomavirus E6 results in attenuation of TIP60-dependent transcriptional regulation and apoptotic pathway.</a> Mol Cell. 38 (5), 700-711 (2010).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+a+metastasis+suppressor+gene+by+Tip60+and+beta-catenin+complexes.">Transcriptional regulation of a metastasis suppressor gene by Tip60 and beta-catenin complexes.</a> Nature. 434 (7035), 921-926 (2005).</li><li>Sakuraba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+Tip60+gene+as+a+potential+marker+for+the+malignancy+of+colorectal+cancer.">Down-regulation of Tip60 gene as a potential marker for the malignancy of colorectal cancer.</a> Anticancer Res. 29 (10), 3953-3955 (2009).</li><li>Subbaiah, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E3+ligase+EDD1/UBR5+is+utilized+by+the+HPV+E6+oncogene+to+destabilize+tumor+suppressor+TIP60.">E3 ligase EDD1/UBR5 is utilized by the HPV E6 oncogene to destabilize tumor suppressor TIP60.</a> Oncogene. , (2015).</li><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-cell+invasion+and+migration:+diversity+and+escape+mechanisms.">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li><li>Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis:+from+dissemination+to+organ-specific+colonization.">Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization.</a> Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).</li><li>Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+steps+of+metastasis:+cell+invasion+and+endothelial+transmigration.">Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration.</a> Mutat Res. 728 (1-2), 23-34 (2011).</li><li>Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+epithelial-mesenchymal+transition.">Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 178-196 (2014).</li><li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIP60+inhibits+metastasis+by+ablating+DNMT1-SNAIL2-driven+epithelial-mesenchymal+transition+program.">TIP60 inhibits metastasis by ablating DNMT1-SNAIL2-driven epithelial-mesenchymal transition program.</a> J Mol Cell Biol. , (2016).</li><li>Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+wound-healing+assays+for+probing+collective+cell+migration.">Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration.</a> J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).</li><li>Jonkman, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy.">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).</li></ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

זה ידוע כי בתהליך נדידת תאים, התאים יכול ולהעביר בצורה של חסיד גיליונות; אשכולות חופשי; או תאים בודדים, מבודדים. מצב ואת הדינמיקה של הפלישה תא יכול להשתנות ממצב אחד למשנהו, ולשנות פנוטיפ בתוך שעות. וזמינותו ריפוי פצע המסורתית מבוססת על תמונה תמונות שנלקחו מיקרוסקופ עם מרווח זמן, כגון 12 או 24 ?...

HIV-טאט-אינטראקטיבי חלבון 60 kDa (TIP60) הוא acetyltransferase ליזין זה יכול acetylate היסטון והן הלא-היסטון חלבונים1,2. הפונקציות שלה נמצאים יש השלכות במשעולים איתות מרובים, כולל תמלול, תיקון נזק לדנ א של אפופטוזיס1,3,4,5,6, 7 , 8. יתר על כן, TIP60 הוא לרוב downregulated ב סרטן, ואת downregulation שלו הוא מתואם עם גרורות סרטן,9,10,11,12, שיעורי ההישרדות המסכן 13,14. גרורות הגידול הוא הגורם העיקרי של מוות מסרטן. זהו תהליך רב שלבי, השלב הראשוני של גרורות מערבת את ההעברה ואת הפלישה של תאים סרטניים לתוך לרקמות סמוכות15,16. לשם כך, תאים סרטניים תחילה יש לנתק בין המוני הגידול העיקרי, גם בצורה של גיליון תא קולקטיבי הפולש או כמו מנותק תאים בודדים17. במהלך תהליך זה, תאים סרטניים לעתים קרובות עוברים אפיתל המעבר mesenchymal (אמבולנס), וכתוצאה מכך לשינויים מורפולוגיה ותא אדהזיה יכולת17,18.
כמה טכניקות פותחו כדי ללמוד את ההעברה, הפלישה יכולת גידול של תאי במבחנה. ביניהם, וזמינותו ריפוי פצע הוא הכי יעיל וחסכוני19. ראשית, שיטה זו כרוכה היצירה של הפער המלאכותי טפט confluent של תאים, ובכך מאפשר לתאים להעביר ולסגור את הפער. שנית, ניתן ללכוד תמונות של הפערים-ההתחלה ואת הסוף של הניסוי. לבסוף, השוואה של סגירת הפער משמש כדי לקבוע את הקצב של נדידת תאים. מיקרוסקופ שלב-ניגודיות משמש בדרך כלל כדי ללכוד תמונות עבור קונבנציונאלי מבחני ריפוי פצע. יתרון נוסף של ריפוי פצע וזמינותו היא כי חלקית דומה ויוו נדידת תאים סרטניים. באופן דומה ל ויוו גרורות הגידול, נדידת תאים במבחני ריפוי פצע מציג את ההעברה קולקטיבית של גיליונות אפיתל והן את ההעברה של תאים בודדים מנותקת.
עם זאת, נדידת תאים ידוע להיות דינמי, יש צורך לתעד את התנועה של תאים בזמן אמת. למשל, וזמינותו המקובלת ריפוי פצע אינו מאפשר חוקר לנתח את התנועה תא בודד. מצד שני, תאים תרבותי עבור מבחני ריפוי פצע לעיתים קרובות מורעבים סרום כדי לעכב את התפשטות תאים. זה נעשה כדי לשלול את האפשרות של סגירת הפער עקב התפשטות תאים. למרות זאת, עדיין יהיו כמה התפשטות מוות תאי ואת שלב-ניגודיות מתמונות שצולמו לפני ואחרי הניסוי אינם מסוגלים להבחין ביניהם.
טכניקת דימות לחיות תאים מטפל ם קונבנציונאלי מבחני ריפוי פצע. באמצעות מיקרוסקופ הדמיה לחיות בשילוב עם CO2 החממה ואת בקרת הטמפרטורה המתאימה, חוקרים יכולים למדוד את גודל הפער, את קצב סגירת לאורך זמן תוך מעקב תנועת פעיל העברת תאים הממוקם בקצות חזית פולשני. לפיכך, המימוש של תאים חיים הדמיה לעקוב אחר נדידת תאים לא נספק רק כדי שתראי טוב יותר של נדידת תאים, אך יאפשר גם את האפשרות להבחין בין נדידת תאים והתפשטות תאים, ובכך מספק יותר ניתוח אמין של נדידת תאים.
במחקר זה, לתאי האפיתל של השד MCF10A שימשו כדי להדגים את השילוב של ריפוי פצע assay, תאים חיים הדמיה כדי לחקור את התפקיד של TIP60 ב נדידת תאים. דלדול של TIP60 תוצאות יכולות העברה מוגברת בתאי MCF10A.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="874">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">MCF10A cell</td>
			<td style="width:211px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-10317TM</td>
			<td style="width:257px;">Breast epithelial cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">DMEM/F12 media (1:1)</td>
			<td style="width:211px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11330-032</td>
			<td>MCF10A culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Epithelial growth factor (EGF)</td>
			<td style="width:211px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">AF-100-15</td>
			<td>Supplements for MCF10A culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Cholera Toxin</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C-8052</td>
			<td>Supplements for MCF10A culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H-0888</td>
			<td>Supplements for MCF10A culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Insulin</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I-1882</td>
			<td>Supplements for MCF10A culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">House serum</td>
			<td style="width:211px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">16050-122</td>
			<td>Supplements for MCF10A culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Trypsin</td>
			<td style="width:211px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td>For MCF10A detach from plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:211px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">267110</td>
			<td>For counting cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Opti-MEM reduced serum media</td>
			<td style="width:211px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31985-070</td>
			<td>For siRNA mixture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Lipofectamine RNAiMAX</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">56532</td>
			<td>Transfect reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Trizol reagent</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15596-026</td>
			<td>For mRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td style="width:211px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">170-8891</td>
			<td>For cDNA generation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">iTaq Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td style="width:211px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">172-5125</td>
			<td>For real time qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">7500 Fast Real Time PCR system</td>
			<td style="width:211px;">Biosystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Real time qPCR mechine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">10-cm dish</td>
			<td style="width:211px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:119px;">664160</td>
			<td>For Knockdown experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">24-well plate</td>
			<td style="width:211px;">Cellstar</td>
			<td style="width:119px;">662160</td>
			<td>For wound healing assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">siControl siRNA</td>
			<td style="width:211px;">Self designed</td>
			<td style="width:119px;">Self designed</td>
			<td>CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">siTIP60 siRNA</td>
			<td style="width:211px;">Self designed</td>
			<td style="width:119px;">Self designed</td>
			<td>UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Live cell observer</td>
			<td style="width:211px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Zeiss inverted Cell Observer for live cell experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-imaging of breast epithelial cell migration after the transient depletion of tip60

ריפוי פצע וזמינותו יעיל ואחת הדרכים החסכונית ביותר ללמוד תא העברה בתוך חוץ גופית. כמקובל, תמונות נלקחים ב ההתחלה ואת הסוף של ניסוי בעזרת מיקרוסקופ שלב-ניגודיות, היכולות ההעברה של תאים מוערכות על-ידי סגירת פצעי. עם זאת, תנועת התא הוא תופעה דינמית, שיטה המקובלת אינה מאפשרת מעקב אחר תנועה תא בודד. כדי לשפר את מבחני ריפוי פצע הנוכחי, אנו משתמשים בטכניקות הדמיה לחיות תאים לעקוב אחר נדידת תאים בזמן אמת. שיטה זו מאפשרת לנו לקבוע את קצב ההעברה תא מבוססת על תא מערכת מעקב ומספק הבחנה ברורה בין נדידת תאים והתפשטות תאים. . הנה, נדגים את השימוש הדמיה לחיות תאים של ריפוי פצע מבחני ללמוד על היכולות ההעברה שונה של תאי אפיתל כנגד השד מושפע הנוכחות של TIP60. כמו תא תנועתיות הוא דינמי מאוד, השיטה שלנו מספק יותר תובנות תהליכי ריפוי מאשר תמונה של סגירת הפצע שצולמו באמצעות טכניקות הדימות המסורתי המשמש עבור מבחני ריפוי פצע הפצע.

גנרל סכימה של תא מבוססת הדמיה לחיות תאים ההעברה Assay איור 1A הוא סכימה של פרוטוקול זה. MCF10A תאים transfected עם siControl הראו מורפולוגיה אפיתל טיפוסי. לאחר דלדול של TIP60, תאים MCF10A היו mesenchymal יותר בהשוואה לתאי בקרה (איור 1B).
<p class="jove_content" fo:keep-toge...

Watch this Scientific Journal Video about Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60 at JoVE.com

Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

הדמיה חיה של נדידת תאים אפיתל השד לאחר דלדול ארעית של TIP60

כאן, אנו מציגים את ניטור בזמן אמת של נדידת תאים בשיטת ריפוי פצע באמצעות תאי האפיתל של השד מדולדל TIP60 MCF10A. היישום של טכניקות הדמיה לחיות תאים בפרוטוקול שלנו מאפשר לנו נתח והמחש תא בודד תנועה בזמן אמת ולאורך זמן.

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the ...

live-imaging-breast-epithelial-cell-migration-after-transient

Research

JoVE Journal

Cancer Research

6.8K Views.  National University of Singapore. כאן, אנו מציגים את ניטור בזמן אמת של נדידת תאים בשיטת ריפוי פצע באמצעות תאי האפיתל של השד מדולדל TIP60 MCF10A. היישום של טכניקות הדמיה לחיות תאים בפרוטוקול שלנו מאפשר לנו נתח והמחש תא בודד תנועה בזמן אמת ולאורך זמן.

Video: Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery of the next generation of novel drug targets. It is becoming apparent that more complex models of cancer are required to fully appreciate the contributing factors that drive tumorigenesis in vivo and increase the efficacy of novel therapies that make the transition from pre-clinical models to clinical trials.
Here we present a methodology for generating uniform and reproducible tumor spheroids that can be subjected to siRNA functional screening. These spheroids display many characteristics that are found in solid tumors that are not present in traditional two-dimension culture. We show that several commonly used breast cancer cell lines are amenable to this protocol. Furthermore, we provide proof-of-principle data utilizing the breast cancer cell line BT474, confirming their dependency on amplification of the epidermal growth factor receptor HER2 and mutation of phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PIK3CA) when grown as tumor spheroids. Finally, we are able to further investigate and confirm the spatial impact of these dependencies using immunohistochemistry.

Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

ניצול הקרנת Genomics פונקציונלית כדי לזהות מטרות תרופה חדשנית פוטנציאלי תרבויות אליפטית תא סרטני

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast cancer metastasis, and results in poor outcomes with median survival rates of only 4.8 - 15 months. Current rodent models of breast cancer metastasis, including primary tumor cell xenograft and spontaneous tumor models, rarely metastasize to the liver. Intracardiac and intrasplenic injection models do result in liver metastases, however these models can be confounded by concomitant secondary-site metastasis, or by compromised immunity due to removal of the spleen to avoid tumor growth at the injection site. To address the need for improved liver metastasis models, a murine portal vein injection method that delivers tumor cells firstly and directly to the liver was developed. This model delivers tumor cells to the liver without complications of concurrent metastases in other organs or removal of the spleen. The optimized portal vein protocol employs small injection volumes of 5 - 10 &#956;l, &#8805; 32 gauge needles, and hemostatic gauze at the injection site to control for blood loss. The portal vein injection approach in Balb/c female mice using three syngeneic mammary tumor lines of varying metastatic potential was tested; high-metastatic 4T1 cells, moderate-metastatic D2A1 cells, and low-metastatic D2.OR cells. Concentrations of &#8804; 10,000 cells/injection results in a latency of ~ 20 - 40 days for development of liver metastases with the higher metastatic 4T1 and D2A1 lines, and &#62; 55 days for the less aggressive D2.OR line. This model represents an important tool to study breast cancer metastasis to the liver, and may be applicable to other cancers that frequently metastasize to the liver including colorectal and pancreatic adenocarcinomas.

A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.

מודל הזרקת Portal Vein לחקר גרור בכבד של סרטן השד

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Live Imaging to Study Microtubule Dynamic Instability in Taxane-resistant Breast Cancers

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane resistance in cancerous cells drastically reduces the effectiveness of the drugs' long-term usage. Accumulated evidence suggests that the mechanisms underlying taxane resistance include both general mechanisms, such as the development of multidrug resistance due to the overexpression of drug-efflux proteins, and taxane-specific mechanisms, such as those that involve microtubule dynamics. 
Because taxanes target cell microtubules, measuring microtubule dynamic instability is an important step in determining the mechanisms of taxane resistance and provides insight into how to overcome this resistance. In the experiment, an in vivo method was used to measure microtubule dynamic instability. GFP-tagged &#945;-tubulin was expressed and incorporated into microtubules in MCF-7 cells, allowing for the recording of the microtubule dynamics by time lapse using a sensitive camera. The results showed that, as opposed to the non-resistant parental MCF-7CC cells, the microtubule dynamics of docetaxel-resistant MCF-7TXT cells are insensitive to docetaxel treatment, which causes the resistance to docetaxel-induced mitotic arrest and apoptosis. This paper will outline this in vivo method of measuring microtubule dynamic instability.

In this paper, we report a protocol describing an in vivo method to measure microtubule dynamic instability in docetaxel-resistant breast cancer cells (MCF-7TXT). In this method, a deconvolution microscopy imaging system is used to detect the expression of GFP-tubulin in target cells.

הדמיה חיה לחקר חוסר יציבות microtubule דינמי סרטן השד עמיד taxane

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane ...

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying cancer metastasis in vivo, other efficient, reliable, low-cost models are needed to quickly access the potential effects of (epi)genetic changes or pharmacological compounds. As such, we illustrate and explain the feasibility of xenograft models using human breast cancer cells injected into zebrafish embryos to support this goal. Under the microscope, fluorescent proteins or chemically labeled human breast cancer cells are transplanted into transgenic zebrafish embryos, Tg (fli:EGFP), at the perivitelline space or duct of Cuvier (Doc) 48 h after fertilization. Shortly afterwards, the temporal-spatial process of cancer cell invasion, dissemination, and metastasis in the living fish body is visualized under a fluorescent microscope. The models using different injection sites, i.e., perivitelline space or Doc are complementary to one another, reflecting the early stage (intravasation step) and late stage (extravasation step) of the multistep metastatic cascade of events. Moreover, peritumoral and intratumoral angiogenesis can be observed with the injection into the perivitelline space. The entire experimental period is no more than 8 days. These two models combine cell labeling, micro-transplantation, and fluorescence imaging techniques, enabling the rapid evaluation of cancer metastasis in response to genetic and pharmacological manipulations.

Here, we describe xenograft zebrafish models using two different injection sites, i.e., perivitelline space and duct of Cuvier, to investigate the invasive behavior and to assess the intravasation and extravasation potential of human breast cancer cells, respectively.

התנהגות פולשנית של תאים סרטניים בשד אדם עוברי הזברה

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move within tissues in a tightly orchestrated manner. During tumor development, this equilibrium is disturbed, and tumor cells leave the epithelium of origin to invade the local microenvironment, to travel to distant sites, and to ultimately form metastatic tumors at distant sites. The dot assay is a simple, two-dimensional unconstrained migration assay, to assess the net movement of cell sheets into a cell-free area, and to analyze parameters of cell migration using time-lapse imaging. Here, the dot assay is demonstrated using a human invasive, lung colony forming breast cancer cell line, MCF10CA1a, to analyze the cells' migratory response to epidermal growth factor (EGF), which is known to increase malignant potential of breast cancer cells and to alter the migratory phenotype of cells.

Cell migration is essential for development, tissue maintenance and repair, and tumorigenesis, and is regulated by growth factors, chemokines, and cytokines. This protocol describes the dot assay, a two-dimensional, unconstrained migration assay to assess the migratory phenotype of attached, cohesive cell sheets in response to microenvironmental cues.

באמצעות וזמינותו נקודה כדי לנתח את ההעברה של גיליונות תא

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include rapid proliferation and pervasive invasion into the normal brain. Recurrence is thought to result from the presence of radio- and chemo-resistant brain tumor stem cells (BTSCs) that invade away from the initial cancerous mass and, thus, evade surgical resection. Hence, therapies that target BTSCs and their invasive abilities may improve the otherwise poor prognosis of this disease. Our group and others have successfully established and characterized BTSC cultures from GBM patient samples. These BTSC cultures demonstrate fundamental cancer stem cell properties such as clonogenic self-renewal, multi-lineage differentiation, and tumor initiation in immune-deficient mice. In order to improve on the current therapeutic approaches for GBM, a better understanding of the mechanisms of BTSC migration and invasion is necessary. In GBM, the study of migration and invasion is restricted, in part, due to the limitations of existing techniques which do not fully account for the in vitro growth characteristics of BTSCs grown as neurospheres. Here, we describe rapid and quantitative live-cell imaging assays to study both the migration and invasion properties of BTSCs. The first method described is the BTSC migration assay which measures the migration toward a chemoattractant gradient. The second method described is the BTSC invasion assay which images and quantifies a cellular invasion from neurospheres into a matrix. The assays described here are used for the quantification of BTSC migration and invasion over time and under different treatment conditions.

Here, we describe live-cell imaging techniques to quantitatively measure the migration and invasion of glioblastoma brain tumor stem cells over time and under multiple treatment conditions.

מבחני הדמיה לחיות תאים מחקר המוח גליובלסטומה גידול תאי גזע ההעברה, הפלישה

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon named apoptosis reversal leads to increased tumorigenicity in various cell models under different stimuli. Previous studies have been focused on tracking this process in vitro and in vivo; however, the isolation of real reversed cells has yet to be achieved, which limits our understanding on the consequences of apoptosis reversal. Here, we take advantage of a Caspase-3/7 Green Detection dye to label cells with activated caspases after apoptotic induction. Cells with positive signals are further sorted out by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for recovery. Morphological examination under confocal microscopy helps confirm the apoptotic status before FACS. An increase in tumorigenicity can often be attributed to the elevation in the percentage of cancer stem cell (CSC)-like cells. Also, given the heterogeneity of breast cancer, identifying the origin of these CSC-like cells would be critical to cancer treatment. Thus, we prepare breast non-stem cancer cells before triggering apoptosis, isolating caspase-activated cells and performing the apoptosis reversal procedure. Flow cytometry analysis reveals that breast CSC-like cells re-appear in the reversed group, indicating breast CSC-like cells are transited from breast non-stem cancer cells during apoptosis reversal. In summary, this protocol includes the isolation of apoptotic breast cancer cells and detection of changes in CSC percentage in reversed cells by flow cytometry.

Here, we present a protocol to isolate apoptotic breast cancer cells by fluorescence-activated cell sorting and further detect the transition of breast non-stem cancer cells to breast cancer stem cell-like cells after apoptosis reversal by flow cytometry.

גילוי Cytometric זרימה של תאים, כמו תאי גזע סרטניים בשד החדשה לאחר היפוך אפופטוזיס

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction of differentiation of two mouse breast epithelial cell lines, HC11 and EpH4, and their use to study complementary stages of mammary gland development and neoplastic transformation.
The HC11 mouse breast epithelial cell line originated from the mammary gland of a pregnant Balb/c mouse. It differentiates when grown to confluence attached to a plastic Petri dish surface in medium containing fetal calf serum and Hydrocortisone, Insulin and Prolactin (HIP medium). Under these conditions, HC11 cells produce the milk proteins &#946;-casein and whey acidic protein (WAP), similar to lactating mammary epithelial cells, and form rudimentary mammary gland-like structures termed &#34;domes&#34;.
The EpH4 cell line was derived from spontaneously immortalized mouse mammary gland epithelial cells isolated from a pregnant Balb/c mouse. Unlike HC11, EpH4 cells can fully differentiate into spheroids (also called mammospheres) when cultured under three-dimensional (3D) growth conditions in HIP medium. Cells are trypsinized, suspended in a 20% matrix consisting of a mixture of extracellular matrix proteins produced by Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma cells, plated on top of a layer of concentrated matrix coating a plastic Petri dish or multiwell plate, and covered with a layer of 10% matrix-containing HIP medium. Under these conditions, EpH4 cells form hollow spheroids that exhibit apical-basal polarity, a hollow lumen, and produce &#946;-casein and WAP.
Using these techniques, our results demonstrated that the intensity of the cadherin/Rac signal is critical for the differentiation of HC11 cells. While Rac1 is necessary for differentiation and low levels of activated RacV12 increase differentiation, high RacV12 levels block differentiation while inducing neoplasia. In contrast, EpH4 cells represent an earlier stage in mammary epithelial differentiation, which is inhibited by even low levels of RacV12.

We describe techniques for differentiation induction of two breast epithelial lines, HC11 and EpH4. While both require fetal calf serum, insulin, and prolactin to produce milk proteins, EpH4 cells can fully differentiate into mammospheres in three-dimensional culture. These complementary models are useful for signal transduction studies of differentiation and neoplasia.

הבידול של השד העכבר האפיתל HC11 ו EpH4 תאים

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation capacity of mouse prostate basal and luminal cells during development, tissue-regeneration and transformation. However, evaluating cell-intrinsic and extrinsic regulators of prostate epithelial differentiation capacity using a lineage tracing approach often requires extensive breeding and can be cost-prohibitive. In the prostate organoid assay, basal and luminal cells generate prostatic epithelium ex vivo. Importantly, primary epithelial cells can be isolated from mice of any genetic background or mice treated with any number of small molecules prior to, or after, plating into three-dimensional (3D) culture. Sufficient material for evaluation of differentiation capacity is generated after 7-10 days. Collection of basal-derived and luminal-derived organoids for (1) protein analysis by Western blot and (2) immunohistochemical analysis of intact organoids by whole-mount confocal microscopy enables researchers to evaluate the ex vivo differentiation capacity of prostate epithelial cells. When used in combination, these two approaches provide complementary information about the differentiation capacity of prostate basal and luminal cells in response to genetic or pharmacological manipulation.

Mouse prostate organoids represent a promising context to evaluate mechanisms that regulate differentiation. This paper describes an improved approach to establish prostate organoids, and introduces methods to (1) collect protein lysate from organoids, and (2) fix and stain organoids for whole-mount confocal microscopy.

הערכת יכולת בידול של העכבר תאים אפיתל הערמונית באמצעות תרבות אורגאיד

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary epithelium using transplantation techniques takes advantage of the hormonal environment provided by the adolescent rodent host. These studies are ideally suited to explore the impact of various biological manipulations on mammary gland development and dissect many aspects of mammary gland biology. A common, but limiting, feature is that transplanted epithelial cells are strongly influenced by the surrounding stroma and outcompeted by endogenous epithelium; to utilize native mammary tissue, the abdominal-inguinal white fat pad must be cleared to remove host mammary epithelium prior to the transplantation. A major obstacle when using the rat model organism is that clearing the developing mammary tree in post-weaned rats is not efficient. When transplanted into gland-free fat pads, donor epithelial cells can repopulate the cleared host fat pad and form a functional mammary gland. The interscapular fat pad is an alternative location for these grafts. A major advantage is that it lacks ductal structures yet provides the normal stroma that is necessary to promote epithelial outgrowth and is easily accessible in the rat. Another major advantage of this technique is that it is minimally invasive, because it eliminates the need to cauterize and remove the growing endogenous mammary tree. Additionally, the interscapular fat pad contains a medial blood vessel that can be used to separate sites for grafting. Because the endogenous glands remain intact, this technique can also be used for studies comparing the endogenous mammary gland to the transplanted gland. This paper describes the method of mammary epithelial cell transplantation into the interscapular white fat pad of rats.

This article describes a transplantation method to graft donor rat mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of recipient animals. This method can be used to examine host and/or donor effects on mammary epithelium development and eliminates the need for pre-clearing, thereby extending the usefulness of this technique.

חולדה השתלת תא האפיתל לתוך משטח שומן לבן הגלימה

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary ...