המחברים מודים לד&quot;ר. פאהד באפאקיה וג&#39;ים מנדל על רכישת וזיהוי דגימות החולה, גארט פ&#39;ביילי לעזרה עם אימונוהיסטוכימיה, וכן מאגר ביאורוספטורי ומחקר מחקר רקמות, המרכז לחקר הלב וכלי הדם במרכז ההיסטולוגיה ומכון המחקר ביומולקולרי באוניברסיטה של ​​וירג&#39;יניה. רכישת מדגם, אימונוהיסטוכימיה, והדמיה.

פרוטוקול זה מזהה רכיבים סלולריים דגימות פרפין קבוע מוטבע (FFPE) מוטבע (FFPE), כפי אופייני לדגימות המטופלים קליניים. הטבעה פרפין מאפשר תחזוקה הטובה ביותר של מורפולוגיה הסלולר והרקמות, כמו גם יש אריכות ימים טובה יותר של חלקים. הדגימות המשמשות ניתוח זה היו לגשת דרך אוניברסיטת וירג &#39;יניה Biorepository ו מחקר רקמות מתקן. דגימות החולה נבחרו על ידי נוירופתולוג המבוסס על אבחנה סופית של גלובלסטומה (אסטרוציטומה, WHO דרגה IV), אשר סיימה את תהליך החזרת הגידול באוניברסיטה של ​​וירג&#39;יניה בין השנים 2010 ו -2013, וזוהו לפני ניתוח זה 11 . 1. FFPE דוגמה Deparaffinization ו התייבשות הערה: חלק זה של הפרוטוקול הוא ספציפי דגימות FFPE. בעוד דגימות paraffin- מוטבע יכול להיות שימושי יותר עבור ניתוח זה בגלל שימור של תאים סלולריים ו- Tנושא מורפולוגיה, ניתוח זה יכול להיעשות גם עם חלקים קפואים. אם באמצעות מקטעים קפואים, חלק זה יכול להיות מושמט ולהמשיך ישירות אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את שוטף הבא 5 דקות כל: Xylene, קסילן, אתנול 100%, אתנול 100%, אתנול 95%, אתנול 95%, אתנול 70%, מים deionized, מים deionized </li></ol> 2. אחזור אנטיגן הערה: חלק זה של הפרוטוקול יש צורך לשבור גשרים מתילן נוצר במהלך קיבעון פורמלין של דגימות FFPE ולחשוף אתרי אנטיגן עבור נוגדנים לאגד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל טריס מבוסס גבוה pH אנטיגן מסיר פתרון על המלצה היצרן במים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע אחזור אנטיגן בחום באמצעות מיקרוגל. צורות אחרות של אחזור בתיווך חום (כגון סיר לחץ, סיר אדים או מים רותחים) יספיקו גם הם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את פתרון מסיר מדולל לתוך מיקרוגל לא חתוםכְּלִי שַׁיִט. המקום שקופיות לתוך כלי. המקום שקופיות לתוך מיקרוגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיחים במשך 20 דקות בעוצמה גבוהה. לפקח על רמות נוזלים על אידוי, וכן לחדש עם מים מזוקקים לפי הצורך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר דגימות להתקרר פתרון עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר. </li></ol> 3. אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגם רקמות מתאר עם עט הידרופובי כדי למזער נפח של ריאגנטים הדרושים כדי לכסות מדגם. הערה: הקפד לשמור על דגימות רקמות hydrated ולא נותנים להם להתייבש כמו זה ישפיע על יעילות מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון pipet מספיק permeabilization (טריס שנאגרו מלוחים (TBS) + 0.01% Triton-X) כדי לכסות מדגם רקמות (בדרך כלל על 100-200 μL). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר וזורק פתרון וחזור על שלב 3.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות בטמפרטורת החדר עם פתרון חסימת (פתרון הסרום 2.5% + פתרון permeabilization). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות לילה 4 מעלות צלסיוס עם נוגדנים ראשוניים בדילולב חסימת פתרון. הערה: כל נוגדנים ראשוניים המשמשים כאן הם מדולל ב 1: 200, אבל דילולים אופטימלי ניתן לקבוע באמצעות דילולים סדרתי החל עם המלצה היצרן. מידע מפורט על נוגדנים בשימוש בפרוטוקול זה פורסם בעבר 11 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי נוגדנים ראשוניים באמצעות חזרת peroxidase פולימדיאז מגיב המקביל עם החיה המארח העיקרי נוגדן, בעקבות פרוטוקול היצרנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה פתרון permeabilization מספיק כדי לכסות מדגם הרקמה ו דגירה במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר וזורק פתרון וחזור על שלב 3.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שקופיות 0.3% H 2 O 2 ב 1x TBS במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתח דגימות עם dixinobenzidine peroxidase (DAB) המצע עבור 2 - 10 דקות עד עוצמת הכתם הרצוי מושגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות Counterstain לזהות גרעיני תאים, כגון עם hematoxylin, בעקבות פרוטוקול היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבשים דגימות עם 100%אתנול וקסילן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר דגימות לצמיתות עם התקשורת הרכבה. </li></ol> 4. אזורים של זיהוי אינטרסים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות תמונה תחת מיקרוסקופ brightfield מסוגל תמונות ברזולוציה גבוהה. הערה: השתמש ברכיבים סלולריים להדמיה ברזולוציה של 20x לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר מצלמה לאזורים ספציפיים של עניין בכל דגימות הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור תמונות כקובצי TIFF לכימות. </li></ol> 5. ניתוח תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח תמונות ב- ImageJ לכימות של כיסוי אחוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש תוסף צבע הסף כדי להסיר צבע סגול מן הגרעיני hematoxylin מוכתם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרת תמונה ל -8 סיביות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף סף ללא רקע כהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תהליך התמונה באמצעות אחד 17 טעון מראש מסננים סף ImageJ ( כלומר MaxEntropy) כך רק DAB מנות מוכתמות כלולים בסף. הערה: בחר את מסנן הסף האופטימלי מראש ש - minimizהכללה של מכתים רקע. זה יכול לסמוך על איכות מכתים וספציפיות של נוגדנים. השתמש באותו סף עבור כל משכפל טכני בתוך כל מדגם המטופל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלת סף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את אזור האחוזים של התמונה הסופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממוצע אזור כיסוי כיסוי עבור אזורים מרובים בתוך כל מדגם. </li></ol>

<ol>
	<li>Claes, A., Idema, A. J., Wesseling, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffuse+glioma+growth:+a+guerilla+war.">Diffuse glioma growth: a guerilla war.</a> Acta Neuropathol. 114 (5), 443-458 (2007).</li><li>Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+multiforme:+the+terminator.">Glioblastoma multiforme: the terminator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (12), 6242-6244 (2000).</li><li>Wild-Bode, C., Weller, M., Rimner, A., Dichgans, J., Wick, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sublethal+Irradiation+Promotes+Migration+and+Invasiveness+of+Glioma+Cells.">Sublethal Irradiation Promotes Migration and Invasiveness of Glioma Cells.</a> Cancer Res. 61 (6), (2001).</li><li>Tuettenberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrence+pattern+in+glioblastoma+multiforme+patients+treated+with+anti-angiogenic+chemotherapy.">Recurrence pattern in glioblastoma multiforme patients treated with anti-angiogenic chemotherapy.</a> J. Cancer Res. Clin. Oncol. 135 (9), 1239-1244 (2009).</li><li>Munson, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-invasive+adjuvant+therapy+with+imipramine+blue+enhances+chemotherapeutic+efficacy+against+glioma.">Anti-invasive adjuvant therapy with imipramine blue enhances chemotherapeutic efficacy against glioma.</a> Sci. Transl. Med. 4 (127), 127ra36 (2012).</li><li>Correia, A. L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+is+a+dominant+force+in+multidrug+resistance.">The tumor microenvironment is a dominant force in multidrug resistance.</a> Drug Resist. Updat. 15 (1-2), 39-49 (2012).</li><li>Rubin, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Only+in+congenial+soil:+the+microenvironment+in+brain+tumorigenesis.">Only in congenial soil: the microenvironment in brain tumorigenesis.</a> Brain Pathol. 19 (1), 144-149 (2009).</li><li>Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+promote+glioma+migration.">Microglia promote glioma migration.</a> Acta Neuropathol. 103 (4), 351-355 (2002).</li><li>Le, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploitation+of+astrocytes+by+glioma+cells+to+facilitate+invasiveness:+a+mechanism+involving+matrix+metalloproteinase-2+and+the+urokinase-type+plasminogen+activator-plasmin+cascade.">Exploitation of astrocytes by glioma cells to facilitate invasiveness: a mechanism involving matrix metalloproteinase-2 and the urokinase-type plasminogen activator-plasmin cascade.</a> J. Neurosci. 23 (10), 4034-4043 (2003).</li><li>Ye, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated+microglia/macrophages+enhance+the+invasion+of+glioma+stem-like+cells+via+TGF-&#946;1+signaling+pathway.">Tumor-associated microglia/macrophages enhance the invasion of glioma stem-like cells via TGF-&#946;1 signaling pathway.</a> J. Immunol. 189, 444-453 (2012).</li><li>Yuan, J. X., Bafakih, F. F., Mandell, J. W., Horton, B. J., Munson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analysis+of+the+Cellular+Microenvironment+of+Glioblastoma+to+Develop+Predictive+Statistical+Models+of+Overall+Survival.">Quantitative Analysis of the Cellular Microenvironment of Glioblastoma to Develop Predictive Statistical Models of Overall Survival.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. , (2016).</li><li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Image+Analysis+of+Cellular+Heterogeneity+in+Breast+Tumors+Complements+Genomic+Profiling.">Quantitative Image Analysis of Cellular Heterogeneity in Breast Tumors Complements Genomic Profiling.</a> Sci. Transl. Med. 4 (157), (2012).</li><li>Yi, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+Obstructive+Intimal+Lesions+and+Their+Cellular+Phenotypes+in+Chronic+Pulmonary+Hypertension.">Distribution of Obstructive Intimal Lesions and Their Cellular Phenotypes in Chronic Pulmonary Hypertension.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 162 (4), 1577-1586 (2000).</li><li>Turcan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDH1+mutation+is+sufficient+to+establish+the+glioma+hypermethylator+phenotype.">IDH1 mutation is sufficient to establish the glioma hypermethylator phenotype.</a> Nature. 483 (7390), 479-483 (2012).</li><li>Songtao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDH+mutations+predict+longer+survival+and+response+to+temozolomide+in+secondary+glioblastoma.">IDH mutations predict longer survival and response to temozolomide in secondary glioblastoma.</a> Cancer Sci. 103 (2), 269-273 (2012).</li><li>Shinojima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+Value+of+Epidermal+Growth+Factor+Receptor+in+Patients+with+Glioblastoma+Multiforme.">Prognostic Value of Epidermal Growth Factor Receptor in Patients with Glioblastoma Multiforme.</a> Cancer Res. 63, 6962-6970 (2003).</li><li>Karpel-Massler, G., Schmidt, U., Unterberg, A., Halatsch, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+inhibition+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+in+high-grade+gliomas:+where+do+we+stand?.">Therapeutic inhibition of the epidermal growth factor receptor in high-grade gliomas: where do we stand?.</a> Mol. Cancer Res. 7 (7), 1000-1012 (2009).</li><li>Badie, B., Schartner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+microglia+in+glioma+biology.">Role of microglia in glioma biology.</a> Microsc. Res. Tech. 54 (2), 106-113 (2001).</li><li>Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+function+in+brain+tumors.">Microglia function in brain tumors.</a> J. Neurosci. Res. 81 (3), 447-455 (2005).</li><li>Alves, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+cells:+A+heterogeneous+and+fatal+tumor+interacting+with+the+parenchyma.">Glioblastoma cells: A heterogeneous and fatal tumor interacting with the parenchyma.</a> Life Sci. 89 (15), 532-539 (2011).</li><li>Hambardzumyan, D., Gutmann, D. H., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microglia+and+macrophages+in+glioma+maintenance+and+progression.">The role of microglia and macrophages in glioma maintenance and progression.</a> Nat. Neurosci. 19 (1), 20-27 (2015).</li><li>Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia/macrophages+promote+glioma+progression.">Microglia/macrophages promote glioma progression.</a> Glia. 59 (3), 472-485 (2011).</li><li>Placone, A. L., Qui&#241;ones-Hinojosa, A., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+astrocytes+in+the+progression+of+brain+cancer:+complicating+the+picture+of+the+tumor+microenvironment.">The role of astrocytes in the progression of brain cancer: complicating the picture of the tumor microenvironment.</a> Tumor Biol. 37 (1), 61-69 (2016).</li><li>Rath, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+Enhance+the+Invasion+Potential+of+Glioblastoma+Stem-Like+Cells.">Astrocytes Enhance the Invasion Potential of Glioblastoma Stem-Like Cells.</a> PLoS One. 8 (1), e54752 (2013).</li></ol>

אף אחד.

השיטה המוצעת כאן היא גישה כמותית לניתוח דגימות היסטולוגית מוכתמים באמצעות אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית המסורתית. המתודולוגיה הנוכחית עבור סוג זה של ניתוח כולל פרוטוקולים מכתים דומים ואחריו לדירוג על ידי פתולוגים עצמאיים. שיטה זו היתה מהימנה, אולם עבור מספר יישומים, נדרשת הבנה מדויקת יותר של האיפור הסלולרי, כגון הבנה טובה יותר של ההטרוגניות הקשורה בגידולים וסיכום מדויק של גידולים למחקרים חוץ גופית. פרוטוקול זה מדגים טכניקה פשוטה עבור כמותי ניתוח אוכלוסיות של תאים גליה בתוך microenvironment הגידול במוח. טכניקה זו ניתנת להתאמה רחבה וניתנת להרחבה על מנת לזהות רכיבים רבים אחרים של המיקרו-סביבה, כגון כלי דם, כימוקינים ועוד, וכן סוגי סרטן אחרים, כגון השד או הלבלב, שבהם ניתן לבצע את הניתוחים של הגידולאזורי פרנכימלים גדולים יותר. יתר על כן, טכניקה זו ניתן להתאים לרכוש מדידות אחרות, כגון סעיפים, ואת היקף התאים כדי להעריך את צורת התא, כמו גם המורפולוגיה המורכבת יותר תוצאות איזוטרופיה, אשכולות, אוריינטציה, ועוד. טכניקות אלה אינן מוגבלות גם לסרטן, שכן ניתן להשתמש במתודולוגיות אלה של צביעה וכמות כדי לבצע ניתוחי מוח, כפי שהוכח בכמות המייצרת של פרוטאין אטלס של הרקמה הבריאה, וההשוואה הקודמת שלנו עם רקמות מוח אפילפטיות 11 . צעדים קריטיים במסגרת פרוטוקול זה כוללים הדגירה נכונה ופיתוח של המשני chromogenic. יש להקפיד כך שצבע הכרומוגנים לא יתפתח יתר על המידה. זה יקשה על ההבחנה בין מכתים חיובי רקע. זמן הפיתוח משתנה בהתאם מגיב המצע בשימוש ואת זיקה של הנוגדן העיקרי. אנו משתמשים בשדה בהירמיקרוסקופיה כדי לפקח על הפיתוח כדי להבטיח מכתים אופטימלי תוך צמצום מכתים ברקע. לאחר מכתים, סף תקין במהלך הניתוח יכול לעזור להבדיל רקע מכתים חיובית. המגבלה העיקרית עבור שיטה זו היא חוסר יכולת מרכיבים מרובים כתם בתוך מדגם הרקמה אותו בשל השימוש בפיתוח מכתים כרומוגנית. ניתוח אימונופלורסנציה יכול להתבצע באופן דומה, אך דורש שינוי של כלים דנו בשיטה זו. ספציפית גליובלסטומה, ישנם מספר סמנים וכתמים הסלולר אשר שימשו כדי לנתח דגימות החולה. אלה כוללים IDH1 14 , 15 , EGFRvIII 16 , 17 כמו סמנים פרוגנוסטיים, כמו גם CD11b ו CD45 עבור microglia ומקרופאגים 18 , 19 . השיטה שלנו מרחיבה סוג זה של ניתוחכדי microenvironment הסלולר, מרכיב להתעלם לעתים קרובות של microenvironment הגידול ב glioblastoma. מחקרים בחנו נוכחות מיקרוגליה וצפיפות בגידולים 20 , 21 , 22 וכן תרומות של האסטרוציטים 9 , 23 , 24 . כאן פיתחנו פרוטוקול הבוחן את כל הגליה - אסטרוציטים, מיקרוגליאה ואוליגודנדרוציטים - בגידול של המיקרו-סביבה של הגידול במוח, וכדי להבדיל בין האזורים הסמוכים או הפולשניים של הגידול מהכמות הגדולה של הגידול, שבה מסומנים בדרך כלל בגידולים אלה. בעשותנו זאת, אנו מאמינים שאנו יכולים להעריך בצורה מדויקת יותר את מצב המטופל, משום שקבענו הטרוגניות בין המטופלים והפרסום הקודם שלנו הראה כי ניתוח של מיקומים אלו והכללה במודלים סטטיסטיים הוא חזק יותר בעת ניבוי תוצאות מאשר במיקומים אלוNe או דוגמאות כלליות 11 . יתר על כן, מאז הפלישה glioblastoma הוא מפוזר כל כך, מה שהופך את זה קשה לעקור לחלוטין 1 , 2 , אנו מאמינים הרקמה באזורים הסמוכים מייצג יותר של הרקמה הפולשנית שהושארו אחרי כריתה, מה שגורם להישנות בלתי נמנעת. לכן, הבנה טובה יותר של האזורים הסמוכים עשויה לספק מידע נוסף על הישנות המחלה והתכנון הטיפול בחולה, בניגוד לרקמה בתפזורת שנחקרה באופן מסורתי, שנכרתה לפני הטיפול בחולי גליובלסטומה.

Glioblastoma (GBM), סרטן השד הנפוץ ביותר וממאיר, מאופיין פלישה מפוזר מאוד מן הגידול העיקרי הראש לתוך parenchyma המוח בריא 1 , 2 . הפלישה המפוזרת הזו גורמת לגידול קשה במיוחד להתרחש באופן מלא, ותאי הסרטן הפולשים שנותרו לאחר הטיפול הם הסיבה השכיחה ביותר להישנות בלתי נמנעת 2 , 3 , 4 . בעבר, מצאנו מעכב את הפלישה לתאי גליומה מפוזר להיות מועיל מבחינה טיפולית 5 , אולם מעט ידוע על מנגנונים מורכבים התורמים פלישה GBM. הגידול microenvironment, או רקמות המקיפות את הסרטן, כבר מעורב בהתקדמות של גידולים במספר סוגי סרטן 6 , 7 . הגידול microivironment הגידול glioblastoma, בעמ &#39;ארטיקולרי, הוא יחסית מאופיין והוא מורכב במיוחד, חיבור של תאים גליה מרובים, כגון אסטרוציטים, microglia, ו oligodendrocytes, כמו גם מטריקס תאיים, גורמים מסיסים, גורמים ביו-פיזי. ניסיוני, astrocytes ו microglia הוצגו כדי להגביר את התקדמות glioma ו פלישה 8 , 9 , 10 , אבל את ההרכב של כל תאי גליה של microenvironment המוח האנושי אינו ידוע. הראינו בעבר רכיבים microenvironmental יכול לחזות הישרדות המטופל על ידי כמותית ניתוח מרכיבי הסלולר של microivironment glioblastoma ושילוב הניתוחים שלנו לתוך מודל סיכונים יחסיים 11 . כאן, אנו מתארים את שיטת ניתוח כמותי לזיהוי אוכלוסיות של תאים גליה בתוך הגידול בתפזורת באזורים הסמוכים של resections הגידול מחולה glioblastomaS. השתמשנו אימונוהיסטוכימיה chromogenic כדי לזהות את אוכלוסיות תאים גליה ו ImageJ לנתח את אחוז כיסוי של מכתים עבור כל האוכלוסייה גליה. הערכת אחוז כיסוי יוצר מדידה פשוטה לקביעת הבדלים מורפולוגיים של תאים, במיוחד אלה מושפעים אינטראקציות עם תאים סרטניים. מחקרים קודמים לכימות מכתים היסטופאתולוגיים משתמשים בכתמים סטנדרטיים כגון hematoxylin ו- eosin 12 או Trichrome 13 של Masson, אשר אינם מנצלים את הספציפיות של מכתים אימונוהיסטוכימיים המבוססים על נוגדנים. השיטה שלנו פותחה כדי לכמת ישירות את אוכלוסיות גלייה בתוך resioblastoma החולה גידולים הגידול, אשר אנו שואפים להשתמש כדי להבהיר את microivironment glioblastoma מורכבים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Xylene</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">X3P</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">High pH antigen unmasking solution</td>
			<td style="width:71px;">Vector Labs</td>
			<td>H-3301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TBS</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton-X</td>
			<td style="width:71px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Horse serum</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-ALDH1L1&#160;</td>
			<td style="width:71px;">abcam&#160;</td>
			<td style="width:119px;">ab56777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-Iba1&#160;</td>
			<td style="width:71px;">abcam&#160;</td>
			<td style="width:119px;">ab5076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-Oligodendrocyte Specific Protein1&#160;</td>
			<td style="width:71px;">abcam&#160;</td>
			<td style="width:119px;">ab53041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ImmPRESS anti-goat</td>
			<td style="width:71px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">MP-7405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ImmPRESS Universal (anti-mouse/rabbit)</td>
			<td style="width:71px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">MP-7500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">216763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ImmPACT DAB substrate</td>
			<td style="width:71px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hematoxylin counterstain</td>
			<td style="width:71px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">72404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Histochoice Mounting Media</td>
			<td style="width:71px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">H157-475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Aperio Scanscope</td>
			<td style="width:71px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Image Scanscope</td>
			<td style="width:71px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Super HT PAP Pen</td>
			<td style="width:71px;">Research Products International</td>
			<td style="width:119px;">195506</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative immunohistochemistry of the cellular microenvironment in patient glioblastoma resections

עם העניין הגובר של microenvironment הגידול, יצאנו לפתח שיטה כדי לקבוע במיוחד את רכיבי microenvironment בתוך דגימות החולה של glioblastoma, סרטן המוח הקטלני הפולשני ביותר. לא רק שיטות כמותיות מועילות לתיאור מדויק של רקמות חולים, הם יכולים גם לתרום פרוגנוזה מדויקת יותר, אבחון, ופיתוח של מערכות הנדסה רקמות תחליפים. ב glioblastoma, תאים גליה, כגון microglia ו astrocytes, היו מתואמים באופן בלתי תלוי עם פרוגנוזה גרועה על פי דירוג הפתולוג. עם זאת, מצבם של תאים אלה ורכיבי תא גליה אחרים לא תוארו באופן כמותי. זה יכול להיות קשה בשל תהליכים גדולים לסמן תאים אלה גליה. יתר על כן, רוב הניתוחים היסטולוגית להתמקד מדגם הרקמה הכוללת או רק בתוך חלק הארי של הגידול, בניגוד כימות שרטוט מבוסס על שנינות אזוריםהין הרקמה ההטרוגנית ביותר. כאן, אנו מתארים שיטה לזיהוי כמותי וניתוח של אוכלוסיות של תאים גליה בתוך בתפזורת הגידול באזורים הסמוכים של resections הגידול מחולים glioblastoma. השתמשנו אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית כדי לזהות את אוכלוסיות תאים גליה בגידולים הגידול המטופל ו ImageJ לנתח את אחוז כיסוי של מכתים עבור כל האוכלוסייה גליה. בעזרת טכניקות אלה אנו מסוגלים לתאר טוב יותר את התאים גליה ברחבי אזורים של microivironment הגידול glioma.

לצורך ניתוח זה, זוהו שני אזורים של אינטרסים בגידולים שלנו - הגידול העיקרי של הגידול והאזורים הסמוכים, המורכבים בעיקר מרקמות בריאות עם תאים סרטניים פולשים פולשים ( איור 1 א &#39; , 1 ב&#39; ) - זוהו על ידי נוירופתולוגים משתפי פעולה על hematoxylin ו- eosin דגימות. בתוך כל מדגם המטופל, מכתים חיובי עבור האסטרוציטים ( איור 1C ), microglia ( איור 1D ), ו oligodendrocytes ( איור 1E ) באמצעות אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית זוהה. אוכלוסיות אלה זוהו באמצעות נוגדנים ראשוניים ALDH1L1, Iba1, ו Oligodendrocyte ספציפי חלבון (OSP1) בהתאמה 11 . אופטימיזציה של דילולים נוגדנים מומלץ, כמו גם התייעצות עם פרוטוקולי היצרן כדי לאשר אם מכתים היא מדויקת וחיובית<html> ( איור 2 ). לדוגמה, ביצענו מכתים ללא נוגדן העיקרי עבור שליטה שלילית ( איור 2 א ), היצרן מומלץ ( איור 2 ב ), ו דילולים נוספים ( איור 2 ג , 2 ד ) לפני ההתיישבות על דילול 1: 200 ( איור 2 ג ) בשל מכתים חיובי אופטימלי של הגוף התא ותהליכים עם מזעור רקע נוגדן אנטי ALDH1L1. באמצעות ImageJ, את אחוז כיסוי OSP1 + oligodendrocyte מכתים היה לכמת בסופו של דבר להשוות הבדלים באזורים שלנו של עניין ( איור 3 א ). הסרנו את הגרעינים counterstained מן התמונה באמצעות תוסף צבע סף כדי להעריך אך ורק את מכתים DAB חיובי ( איור 3 ב ). לאחר המרת התמונה ל 8bit (Ss = &quot;xfig&quot;&gt; איור 3 ג), אנו מכן להחיל את סף ברירת המחדל MaxEntropy כדי הנותרים DAB חיובי מכתים ( איור 3D ). כאן, השתמשנו סף ברירת המחדל MaxEntropy כי זה ברירת מחדל סף הטוב ביותר שנתפסו כתם חיובי שלנו תוך מזעור רקע, אבל ספים שונים ניתן להשתמש כדי להבטיח ניתוח של האוכלוסייה של עניין. לאחר סף המתאים הוחל על התמונה ( איור 3E ), את אחוז כיסוי הסף ניתן למדוד ( איור 3F ) בהשוואה לחולים מרובים. כאן, אנו לכמת 3 - 5 אזורים בתוך כל אזור של עניין, בהתאם לאזור הכולל של האזור של עניין, והשווה קבוצות באמצעות זווגות בדיקות עם תוכנת GraphPad פריזמה. השוונו גם את הניתוחים שלנו עם GBM עם מכתים המתאימים שנמצאו ברקמת מוח בריאה במאגר אטלס חלבון ( איור 3F ). בשלנו<html> פרסום קודם, השתמשנו בניתוח זה עבור רכיבים microenvrionmental מרובים (astrocytes, microglia, oligodendrocytes וכלי דם) על פני 33 חולים לפתח מודל סיכונים יחסיים לניבוי הישרדות החולה הכולל 11 . <img alt="איור 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56025/56025fig1.jpg" /> איור 1 : השוואה של הגידול בתפוצה רחבה וגידול אזורים קרובים של עניין עבור תאים גליה. א) מדגם הגידול כולו מהחולה 63 מוכתם hematoxylin ו eosin עם בתפזורת אזורים סמוכים ציין. ב) Hematoxylin ו eosin מכתים, C) ALDH1L1 + astrocytes, D) Iba1 + microglia, ו- E) Oligodendrocyte ספציפי חלבון 1 (OSP1) + oligodendrocytes. סולם בר = 100 מיקרומטר.<html> 25fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56025/56025fig2.jpg" /> איור 2 : דוגמה טיטרציה של נוגדן אנטי-ALDH1L1. א) שליטה שלילית, ב) 1:70 דילול המלצת היצרן מהמלאי, ג) דילול 1: 200 מהמלאי, ו D) דילול 1: 400 מהמלאי. דילול 1: 200 שימש מכתים וניתוח בשל מכתים חיובי אופטימלי של גוף התא ותהליכים עם מזעור רקע. סולם בר = 100 מיקרומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56025/56025fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> Jpg &quot;/&gt; איור 3 : ניתוח ImageJ וכימות כיסוי שטח עבור Oligodendrocytes. א) מקורי OSP1 + מכתים של המטופל 52. ב) הסרת גרעינים סגולים באמצעות תוסף Threshold_Colour. ג) המרה ל 8bit. D) MaxEntropy סף שנתפסו E) להחיל על צמצום מכתים ברקע. F) השוואה של אזורים סמוכים ו בכמות גדולה בחמישה דגימות של מטופלים, כמו גם רקמת מוח בריאה באמצעות אטלס חלבון, עבור כיסוי OSP1 + אחוזים. *** p &lt;0.001, **** p &lt;0.0001 באמצעות בדיקות t משויכות. סולם בר = 100 מיקרומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56025/56025fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Immunohistochemistry of the Cellular Microenvironment in Patient Glioblastoma Resections at JoVE.com

Quantitative Immunohistochemistry of the Cellular Microenvironment in Patient Glioblastoma Resections

אימונוהיסטוכימיה כמותית של Microenvironment נייד בגידולים גליובלסטומה החולה

פרוטוקול זה פותח כדי לזהות כמותית מרכיבים microenvironment הגידול ב resioblastoma החולה resections באמצעות אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית ו ImageJ.

With the growing interest in the tumor microenvironment, we set out to develop a method to specifically determine the microenvironment components within ...

quantitative-immunohistochemistry-cellular-microenvironment-patient

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

9.6K Views.  University of Virginia.  פרוטוקול זה פותח כדי לזהות כמותית מרכיבים microenvironment הגידול ב resioblastoma החולה resections באמצעות אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית ו ImageJ. 

Video: Quantitative Immunohistochemistry of the Cellular Microenvironment in Patient Glioblastoma Resections

Quantitative Visualization and Detection of Skin Cancer Using Dynamic Thermal Imaging

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment for melanoma remains surgical excision, therefore, the key to extended survival is early detection 2,3. Considering the large numbers of patients diagnosed every year and the limitations in accessing specialized care quickly, the development of objective in vivo diagnostic instruments to aid the diagnosis is essential. New techniques to detect skin cancer, especially non-invasive diagnostic tools, are being explored in numerous laboratories. Along with the surgical methods, techniques such as digital photography, dermoscopy, multispectral imaging systems (MelaFind), laser-based systems (confocal scanning laser microscopy, laser doppler perfusion imaging, optical coherence tomography), ultrasound, magnetic resonance imaging, are being tested. Each technique offers unique advantages and disadvantages, many of which pose a compromise between effectiveness and accuracy versus ease of use and cost considerations. Details about these techniques and comparisons are available in the literature 4.
Infrared (IR) imaging was shown to be a useful method to diagnose the signs of certain diseases by measuring the local skin temperature. There is a large body of evidence showing that disease or deviation from normal functioning are accompanied by changes of the temperature of the body, which again affect the temperature of the skin 5,6. Accurate data about the temperature of the human body and skin can provide a wealth of information on the processes responsible for heat generation and thermoregulation, in particular the deviation from normal conditions, often caused by disease. However, IR imaging has not been widely recognized in medicine due to the premature use of the technology 7,8 several decades ago, when temperature measurement accuracy and the spatial resolution were inadequate and sophisticated image processing tools were unavailable. This situation changed dramatically in the late 1990s-2000s. Advances in IR instrumentation, implementation of digital image processing algorithms and dynamic IR imaging, which enables scientists to analyze not only the spatial, but also the temporal thermal behavior of the skin 9, allowed breakthroughs in the field.
In our research, we explore the feasibility of IR imaging, combined with theoretical and experimental studies, as a cost effective, non-invasive, in vivo optical measurement technique for tumor detection, with emphasis on the screening and early detection of melanoma 10-13. In this study, we show data obtained in a patient study in which patients that possess a pigmented lesion with a clinical indication for biopsy are selected for imaging. We compared the difference in thermal responses between healthy and malignant tissue and compared our data with biopsy results. We concluded that the increased metabolic activity of the melanoma lesion can be detected by dynamic infrared imaging.

We demonstrated that malignant pigmented lesions with increased metabolic activity generate quantifiable amounts of heat and the measurement of the transient thermal response of the skin to a cooling excitation allows quantitative identification of melanoma and other skin cancers (vs. non-proliferative nevi) at an early stage of the disease.

ויזואליזציה כמותי וזיהוי של סרטן העור באמצעות הדמיה תרמית Dynamic

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment ...

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic strategies1. To overcome the issue of tumor heterogeneity, it is essential to develop assays and tools enabling phenotypic, (epi)genetic and functional identification and characterization of tumor subpopulations that drive specific disease pathologies and represent clinically relevant targets. It is now well established that tumors exhibit distinct sub-fractions of cells with different frequencies of cell division, and that the functional criteria of being slow cycling is positively associated with tumor formation ability in several cancers including those of the brain, breast, skin and pancreas as well as leukemia2-8. The fluorescent dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) has been used for tracking the division frequency of cells in vitro and in vivo in blood-borne tumors and solid tumors such as glioblastoma2,7,8. The cell-permeant non-fluorescent pro-drug of CFSE is converted by intracellular esterases into a fluorescent compound, which is retained within cells by covalently binding to proteins through reaction of its succinimidyl moiety with intracellular amine groups to form stable amide bonds9. The fluorescent dye is equally distributed between daughter cells upon divisions, leading to the halving of the fluorescence intensity with every cell division. This enables tracking of cell cycle frequency up to eight to ten rounds of division10. CFSE retention capacity was used with brain tumor cells to identify and isolate a slow cycling subpopulation (top 5% dye-retaining cells) demonstrated to be enriched in cancer stem cell activity2. 
This protocol describes the technique of staining cells with CFSE and the isolation of individual populations within a culture of human glioblastoma (GBM)-derived cells possessing differing division rates using flow cytometry2. The technique has served to identify and isolate a brain tumor slow-cycling population of cells by virtue of their ability to retain the CFSE labeling.

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE

This video protocol demonstrates the application of the fluorescent dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) for the identification and separation of different sub-populations of cells in human glioblastoma based on frequency of cell division.

זיהוי ובידוד של תאים מתחלקים לאט בGlioblastoma האנושי באמצעות Carboxy fluorescein Succinimidyl אסתר (CFSE)

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

חי הדמיה של תגובות סמים בmicroenvironment הגידול במודלים עכבריים של סרטן השד

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy

This protocol details the experimental and analytical procedure for a cell-based assay developed in our laboratory as a functional test to predict the prognosis of idiopathic scoliosis in asymptomatic and affected children. The assay consists of the evaluation of the functional status of Gi and Gs proteins in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) by cellular dielectric spectroscopy (CDS), using an automated CDS-based instrument, and the classification of children into three functional groups (FG1, FG2, FG3) with respect to the profile of imbalance between the degree of response to Gi and Gs proteins stimulation. The classification is further confirmed by the differential effect of osteopontin (OPN) on response to Gi stimulation among groups and the severe progression of disease is referenced by FG2. Approximately, a volume of 10 ml of blood is required to extract PBMCs by Ficoll-gradient and cells are then stored in liquid nitrogen. The adequate number of PBMCs to perform the assay is obtained after two days of cell culture. Essentially, cells are first incubated with phytohemmaglutinin (PHA). After 24 hr incubation, medium is replaced by a PHA-free culture medium for an additional 24 hr prior to cell seeding and OPN treatment. Cells are then spectroscopically screened for their responses to somatostatin and isoproterenol, which respectively activate Gi and Gs proteins through their cognate receptors. Both somatostatin and isoproterenol are simultaneously injected with an integrated fluidics system and the cells&#39; responses are monitored for 15 min. The assay can be performed with fresh or frozen PBMCs and the procedure is completed within 4 days.

A structured protocol is presented for a cell-based assay as a functional test to predict the prognosis of idiopathic scoliosis using cellular dielectric spectroscopy (CDS). The assay can be performed with fresh or frozen peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and the procedure is completed within 4 days.

פרוטוקול assay המבוסס תא לחיזוי הפרוגנוזה של Idiopathic עקמת באמצעות סלולרית דיאלקטרי ספקטרוסקופיה

This protocol details the experimental and analytical procedure for a cell-based assay developed in our laboratory as a functional test to predict the ...

Tumor Treating Field Therapy in Combination with Bevacizumab for the Treatment of Recurrent Glioblastoma

A novel device that employs TTF therapy has recently been developed and is currently in use for the treatment of recurrent glioblastoma (rGBM). It was FDA approved in April 2011 for the treatment of patients 22 years or older with rGBM. The device delivers alternating electric fields and is programmed to ensure maximal tumor cell kill1.
Glioblastoma is the most common type of glioma and has an estimated incidence of approximately 10,000 new cases per year in the United States alone2. This tumor is particularly resistant to treatment and is uniformly fatal especially in the recurrent setting3-5. Prior to the approval of the TTF System, the only FDA approved treatment for rGBM was bevacizumab6. Bevacizumab is a humanized monoclonal antibody targeted against the vascular endothelial growth factor (VEGF) protein that drives tumor angiogenesis7. By blocking the VEGF pathway, bevacizumab can result in a significant radiographic response (pseudoresponse), improve progression free survival and reduce corticosteroid requirements in rGBM patients8,9. Bevacizumab however failed to prolong overall survival in a recent phase III trial26. A pivotal phase III trial (EF-11) demonstrated comparable overall survival between physicians&#8217; choice chemotherapy and TTF Therapy but better quality of life were observed in the TTF arm10.
There is currently an unmet need to develop novel approaches designed to prolong overall survival and/or improve quality of life in this unfortunate patient population. One appealing approach would be to combine the two currently approved treatment modalities namely bevacizumab and TTF Therapy. These two treatments are currently approved as monotherapy11,12, but their combination has never been evaluated in a clinical trial. We have developed an approach for combining those two treatment modalities and treated 2 rGBM patients. Here we describe a detailed methodology outlining this novel treatment protocol and present representative data from one of the treated patients.

A novel methodology that is employed for the treatment of recurrent glioblastomas is described. This treatment approach employs the application of alternating electric tumor treating fields (TTFields), known as TTF Therapy in combination with bevacizumab, a targeted agent that is currently FDA approved as monotherapy.

גידול טיפול שדה תרפיה בשילוב עם Bevacizumab לטיפול החוזר וגליובלסטומה

A novel device that employs TTF therapy has recently been developed and is currently in use for the treatment of recurrent glioblastoma (rGBM). It was FDA ...

A "Patient-Like" Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of cancer metastasis are still unclear. Animal models are essential for elucidating the mechanisms and for evaluating novel strategies for the treatment of metastatic cancers. Here, an in-depth description of a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model for exploring the mechanisms of metastasis of solid organ tumors is provided. The survival surgical implantation of BNL 1ME A.7R.1 mouse hepatocellular carcinoma cells directly into the liver (the organ of origin) of the inbred wild-type immune competent laboratory mouse strain, BALB/c is described. The success and reproducibility of this methodology recommends it for widespread use in elucidating the biological mechanisms of solid organ cancer metastasis.

The metastatic spread of cancer is the major cause of cancer-related deaths. We provide an in-depth description of our survival surgery methodology for establishing a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model system for studying the mechanisms of metastasis in solid organ tumors.

&quot;מטופל כמו&quot; Orthotopic syngeneic עכבר הדגם של Hepatocellular Carcinoma גרורה

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor invasion into surrounding brain parenchyma represents an enduring therapeutic challenge. To develop anti-migration therapies for GBM, model systems that provide a physiologically relevant background for controlled experimentation are essential. Here, we present a protocol for generating slice cultures from human GBM tissue obtained during surgical resection. These cultures allow for ex vivo experimentation without passaging through animal xenografts or single cell cultures. Further, we describe the use of time-lapse laser scanning confocal microscopy in conjunction with cell tracking to quantitatively study the migratory behavior of tumor cells and associated response to therapeutics. Slices are reproducibly generated within 90 min of surgical tissue acquisition. Retrovirally-mediated fluorescent cell labeling, confocal imaging, and tumor cell migration analyses are subsequently completed within two weeks of culture. We have successfully used these slice cultures to uncover genetic factors associated with increased migratory behavior in human GBM. Further, we have validated the model&#39;s ability to detect patient-specific variation in response to anti-migration therapies. Moving forward, human GBM slice cultures are an attractive platform for rapid ex vivo assessment of tumor sensitivity to therapeutic agents, in order to advance personalized neuro-oncologic therapy.

Current ex vivo models of glioblastoma (GBM) are not optimized for physiologically relevant study of human tumor invasion. Here, we present a protocol for generation and maintenance of organotypic slice cultures from fresh human GBM tissue. A description of time-lapse microscopy and quantitative cell migration analysis techniques is provided.

A Glioblastoma האדם דגם תרבות פרוסה Organotypic לחקר גידול תאים סרטניים ואפקטים ספציפיים לחולה של תרופות אנטי פולשניות

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.

Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.

דור של Microtumors שימוש 3D אדם Biogel תרבות מערכת תאי Glioblastoma נגזרות חולות להרכבת פרופיל Kinomic ובדיקת תגובה לתרופה

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform extended time-lapse imaging of multicellular interactions in real time, in vivo at single cell resolution.

זמן לשגות Extended הדמיה Intravital של Dynamics תאיים בזמן אמת ב microenvironment הגידול

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. Bone is a dynamic tissue undergoing continuous remodeling with the competing activity of osteoblasts, which produce the new bone matrix, and osteoclasts, whose function is to eliminate mineralized bone. [18F]-NaF is a positron emission tomography (PET) radiotracer that enables visualization of bone metabolism. [18F]-NaF is chemically absorbed into hydroxyapatite in the bone matrix by osteoblasts and can thus noninvasively detect osteoblastic activity, which is occult to conventional imaging techniques. Kinetic modeling of dynamic [18F]-NaF-PET data provides detailed quantitative measures of bone metabolism. Conventional semi-quantitative PET data, which utilizes standardized uptake values (SUVs) as a measure of radiotracer activity, is referred to as a static technique due to its snapshot of tracer uptake in time.&#160; Kinetic modeling, however, utilizes dynamic image data where tracer levels are continuously acquired providing tracer uptake temporal resolution. From the kinetic modeling of dynamic data, quantitative values like blood flow and metabolic rate (i.e., potentially informative metrics of tracer dynamics) can be extracted, all with respect to the measured activity in the image data. When combined with dual modality PET-MRI, region-specific kinetic data can be correlated with anatomically registered high-resolution structural and pathologic information afforded by MRI. The goal of this methodological manuscript is to outline detailed techniques for performing and analyzing dynamic [18F]-NaF-PET-MRI data. The lumbar facet joint is a common site of degenerative arthritis disease and a common cause for axial low back pain.&#160; Recent studies suggest [18F]-NaF-PET may serve as a useful biomarker of painful facetogenic disease.&#160; The human lumbar facet joint will, therefore, be used as a prototypical region of interest for dynamic [18F]-NaF-PET-MRI analysis in this manuscript.

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. We present detailed methodologies for performing and analyzing dynamic [18F]-NaF-PET-MRI data in a patient with facetogenic low back pain using the lumbar facet joints as a prototypical region of interest.

כמותי [18F]-NAF-PET-MRI ניתוח להערכת מחזור עצם דינמי במטופל עם Facetogenic כאבי גב תחתון

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. Bone is a dynamic tissue undergoing ...