המחברים מודים אן Charrié ב Radiobiology שירות (ליון- Sud החולים) ואת הפדרציה הלאומית Suisse (FNS) על התמיכה הכספית שלהם.

1. הכנת תרבות תאים מדיה ופתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מדיה תרבותית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני שגשוג על ידי תוספת של F-10 בינוני עם גלוטמין (2 מ&quot;מ), פניצילין / סטרפטומיצין (5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סופי), 2% עגל סרום בסרום (FCS) ו 2% תחליף בסרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני בידול (DM) על ידי הוספת Dulbecco השתנה הנשר בינוני (DMEM) עם גלוטמין (2 מ&quot;מ), פניצילין / סטרפטומיצין (5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סופי), ו FCS 2%. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פתרונות ספיגת גלוקוז זהירות: טיפול בחומרים רדיואקטיביים מותר רק באזור מוגבל ומבוקר על-ידי כוח מורשה. יש לטפל בחומר ובפסולת בהתאם לנהלים, להנחיות ולחקיקה המקומית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין X-DPBS של X-DBSBCo שנאגרו מלוחים (X-DPBS), לעשות פתרון של DPBS המכיל 0.2% (w / v) (ריכוז סופי)(BSA). סנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר. חנות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין קר 2-deoxy-D- גלוקוז (2dG) פתרון, לשקול 16.4 מ&quot;ג של 2dG ו solubilize ב 10 מ&quot;ל מים מזוקקים כדי לקבל פתרון 10 מ&quot;מ. חנות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 600 μL של 2dG קר 6 μL של radiolabeled [ 3 H] 2dG ל 5400 μL של X-DPBS כדי להשיג את הפתרון 2dG radiolabeled (2dG *). הערה: הריכוז הסופי הוא 1 מ&quot;מ 2 מ&quot;מ ו תיוג הוא 1 μCi / מ&quot;ל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפריש 20 aliquot μL (TC20) של פתרון 2dG radiolabeled *. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תערובות הדגירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תערובת cytochalasin B, להוסיף 2 μL של 20 מ&quot;מ cytochalasin B ל 2 מ&quot;ל של פתרון 2dG radiolabeled *. הערה: פתרון מלאי של cytochalasin B הוא ב 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב dimethyl sulfoxide (DMSO). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תערובת DMSO, להוסיף 4 μL של DMSO ל 4 מ&quot;ל הנותרים של הפתרון 2dG radiolabeled *. </li></Ol&gt; </li></ol> 2. התרבות של תאי שריר ראשוניים של האדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זריעה של 6-צלחות היטב עם תאי שריר אנושיים הערה: השתמש ב-בית (ראה התייחסות 24 לפרטים) או בתאים מסחריים שרירים זמינים מסחרית מ בקבוקון קפוא (המכיל 250,000 תאים). ההליך הבא ניתנת עבור 250,000 תאים על מנת להשיג אחד 6-היטב צלחת הכרחי למדידת ספיגת גלוקוז במצב אחד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר במהירות בקבוקונים קפואים של הבית 24 או הכנות מסחריות של תאי שריר האדם בתאים מראש חימם (37 מעלות צלזיוס) עד רק גוש קרח קטן נשאר הבקבוקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים ישירות לתוך צינור פלסטיק 50 מ&quot;ל המכיל 10 מ&quot;ל של חימם מראש (37 מעלות צלזיוס) PM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 5 דקות ב 500 xg וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות resuspend גלולה התא עם 18 מ&quot;ל של מראש חימם PM (להשיג 42,000 תאים לכל3 מ&quot;ל של המדיום). מפיצים 3 מ&quot;ל בכל היטב של צלחת 6-היטב (9.6 ס&quot;מ 2 ). הערה: שש הבארות הבודדות של צלחת נדרשות לבצע מדידה כפולה של ספיגה של גלוקוז לתנאים הבאים: מעכבי תחבורה פסיבית (בארות 1 ו -2), קצב בסיסי (בארות 3 ו -4) ושיעור מגורה לאינסולין (בארות 5 ו -5) 6). חזור כמו צלחות 6-היטב כמו טיפולים נפרדים נדרשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בתנאי תרבות רגילה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ) עד תאים להגיע מפגש 90%. הערה: שלב זה לוקח בין 48 - 72 שעות בהתאם אצווה התא. אל תשנה מדיום במהלך שלב זה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיפרנציאציה של תאי שריר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PM (לאחר 48-72 שעות) ולהחליף עם מראש חימם DM (3 מ&quot;ל לכל טוב). לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 . הערה: Differentiation לוקח חמישה ימים כדי להגיע למצב יציב שבו תאים מיושרים polynucleated. בדרך כלל, הראשיMyotubes הם מתורבת בינוני 1 גרם / גלוקוז L. לכן, כדי למנוע דלדול הגלוקוז במהלך התרבות, למלא את הצלחת עם בינוני 3 מ&quot;ל על מנת להבטיח כי מספיק גלוקוז המצע זמין עבור התאים בכל עת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף מדיום DM מדי יומיים. הערה: מנקודה זו, המוטובוסים יציבים עד 7 ימים ללא כל שינוי משמעותי מדידת ספיגת גלוקוז יכול להתבצע בכל עת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול בתאי שריר (אופציונלי) הערה: ניתן לטפל בטיפולי מיוטובס ראשוניים במשך מספר ימים כדי לגרום לשינוי (בדיקת סמים, מעכבים / מפעילי נתיב איתות וכו &#39; ) לפני גירוי אינסולין ומדידות ספיגה של גלוקוז. תאי שריר יכולים להיות מוגשים לכל טיפול שעשוי להשפיע על הרגישות לאינסולין, ומדידת ספיגת הגלוקוז תכשיר את ההשפעה הזו. לדוגמה, הדגירה של תאי שריר עם חומצה שומן רווי palmitate מקדם עמידות לאינסולין, תאים להציג מופחת אניNsulin מגורה ספיגת גלוקוז. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 12 מ&quot;ל של DM בתוספת 10% BSA (חומצת שומן חינם) ו 0.5 מ&quot;ל palmitate (PALM). הכן 12 מ&quot;ל של DM בתוספת 10% BSA (חומצת שומן חינם) בלבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו שתי צלחות 6-היטב עם myotubes העיקרי האנושי, תרבות אותם כפי שמתואר בסעיפים 2.1 ו 2.2 (עם 5 ימים של הבחנה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 5, לשטוף היטב עם 2 מ&quot;ל של PBS. כדי צלחת אחת, להוסיף 2 מ&quot;ל של DM המכיל PALM. כדי צלחת אחרת להוסיף 2 מ&quot;ל של BSA רק המכיל DM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 48 שעות ב 37 ° C, 5% CO 2 . </li></ol></li></ol> 3. גירוי אינסולין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף תאים שריר מובחנים פעמיים עם 2 מ&quot;ל PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS בזהירות דגירה עם 3 מ&quot;ל של DM ללא FCS במשך 3 שעות (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ) עבור דלדול בסרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את התקשורת בכל הבארות עם 3 מ&quot;ל של DM ללא FCS. הוסף 100 ננומטר אינסולין לבארות 5 ו 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התרבות מיוטוב האדם עבור1 שעות (37 ° C, 5% CO 2 ). </li></ol> 4. ספיגת גלוקוז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 1 שעות של גירוי אינסולין, לשטוף בארות פעמיים עם X-DPBS (1 מ&quot;ל לכל לשטוף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של תערובת cytochalasin B לארות 1 ו -2, ו 1 מ&quot;ל של תערובת DMSO לבארות 3 - 6. דגירה במשך 15 דקות (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ). בסוף הדגירה, מיד למקם את הצלחת על הקרח. </li></ol> 5. תא תמוגה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים פעמיים עם 1 מ&quot;ל של קרח קר PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse התאים היטב כל עם 600 μL של 50 מ&quot;מ NaOH. דגירה על הקרח במשך 5 דקות ומערבבים בעדינות עם סיבוב אוראלי אטי. הערה: אם lysate הוא צמיג מדי, לדלל עם עד 1.5 מ&quot;ל NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פיפטה, resuspend ולאסוף lysate התא. </li></ol> 6. קביעת גלוקוז Radiolabeled <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים 400 μL של lysate התא בכל נוזל נצנץ ספירת בקבוקון. הכן בקבוקון שליטה שלילית עם 400ΜL של 50 מ&quot;מ NaOH, בקבוקון שליטה חיובית עם 20 μL של TC20 (משלב 1.2.3.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 מ&quot;ל של תמיסת נצנץ נוזלי לכל בקבוקון. סגור את המכסה ומערבבים כל בקבוקון ביסודיות (1-2 s). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכניסים לכל בקבוקון נוזל נצנץ ומודדים את הרדיואקטיביות בהתאם להוראות היצרן. שיא סעיפים לדקה (CPM) עבור כל בקבוקון scintillation במשך 10 דקות. הערה: CPM = &quot;התפרקות לדקה&quot; x &quot;ספירת היעילות&quot;. </li></ol> 7. שיעור ספיגת גלוקוז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש lysate הנותרים (200 μL, משלב 5.2) כדי למדוד את ריכוז החלבון. לקבוע את ריכוז החלבון של lysate תא באמצעות ברדפורד 25 או שיטה המקבילה. חישוב כמות החלבון הכולל (Q) במ&quot;ג עבור כל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבל TC1 (הערך עבור 1 μL של 2dG radiolabeled *), מחלקים את הערך לאלף הופעות של TC20 על ידי 20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל בקבוקון, לחשב tהוא שיעור ספיגת גלוקוז כדלקמן: <img alt="משוואה" src="/files/ftp_upload/55743/55743eq1.jpg" /> הערה: R נמדד ב- pmol / mg / min. ממוצע של R עבור בארות 1 - 2 נותן קצב תחבורה פסיבי, R p . ממוצע של R עבור בארות 3-4 נותן קצב התחבורה הכולל הבסיסי, R BT . ממוצע של R עבור בארות 5-6 נותן אינסולין מגורה שיעור התחבורה הכולל, R זה . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב קצב התחבורה הבסיסי הפעיל (R ba ) כדלקמן: <img alt="משוואה" src="/files/ftp_upload/55743/55743eq2.jpg" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב האינסולין מגורה המפעילים שיעור תעבורה פעיל (R ia ) כדלקמן: <img alt="משוואה" src="/files/ftp_upload/55743/55743eq3.jpg" /> הערה: בתאי התגובה האינסולין כמו myotubes, שיעורי ספיגת גלוקוז מיוצגים בדרך כלל על ידי שלושה ערכים: R Ba , R ia , ואת קיפול אינסולין גירוי כמו RIA / R Ba . </li></ol></li></ol>

למחברים אין מה לגלות.

<html> ספיגת גלוקוז היא מדידה ביולוגית מפתח לבדיקת actators או מעכבי על תרבות התא וכיצד הם משפיעים על השימוש בגלוקוז, ואת היכולת של התא להגיב לאינסולין. השיטה המתוארת כאן הוכחה כמהירה ואמינה ונמצאה בשימוש נרחב במחקרים רבים באמצעות מיוטובים ראשוניים של חולים בריאים ו / או מטופלים עם מטבוליזם 6 , 7 , 10 , 12 , 21 , 26 , 27 , 36 , 37 . עם רק 6 צלחת אחת, גם ניתן להשיג תעריפים בכפילויות עבור התחבורה הבסיסית הכוללת, התחבורה הבסיסית הפעילה ותחבורה פעילה הממריצה אינסולין. אלה שלושה ערכים באופן מלא לתאר את הרגישות לאינסולין של תאים במבחנה בתרבית בתרבית. Ss = &quot;jove_content&quot;&gt; תאי שריר ראשוניים מתרבים באופן שגרתי על צלחות מצופות קולגן. בעת שימוש בקווים תאים כמו C2C12 או L6, לוחות מצופה שאינם יכולים לשמש. כדי למקסם את התגובה האינסולין, חשוב לרוקן אינסולין מן התאים שריר לפני הגירוי על מנת לקבל את המצב הבסיסי הנמוך ביותר האפשרי. זמן הדגירה 3 שעות המצוין בפרוטוקול זה יכול להיות שונה בהתאם ליציבות התא על אינסולין ו / או רעב בסרום. הדגירה 3 שעות עם אינסולין הוא ואחריו הדגירה 15 דקות עם גלוקוז radiolabeled. מטרת הדגירה של שעה עם אינסולין היא לאפשר טרנסלוקציה של כל GLUT4 המכיל שלפוחית ​​זמין לקרום על מנת להשיג מקסימום גלוקוז ספיגה הדולר. בדיקות קודמות הראו כי פעמים הדגירה קצר (15 ו 30 דקות) לא השיגו שיעורי מקסימלית. ההתמדה של גירוי אינסולין במהלך 15 דקות עם 2dG radiolabeled אינו חובה כפי שהוא לא השפיע על המדידה (נתונים אישיים). יתר על כן, אותו radiolabeled<html> תערובת 2dG ניתן להוסיף לכל בארות נבדק. עבור תמוגה התא, את נפח NaOH ניתן לשנות על פי המאפיינים התא. כאשר עובדים עם תאים המכילים רמות גבוהות של חומצות שומן כלומר עבור lysates צמיג מאוד, את נפח NaOH ניתן להגדיל עד 1.5 מ&quot;ל. השיטה משתמשת חומר radiolabeled זה משפר את הרגישות של המדידה, אך דורש כי הפרוטוקול להתבצע באזורים מבוקרים. יש לטפל בחומרים ובפסולת בהתאם להנחיות הבטיחות המקומיות. עבור מעבדות לא מאובזר, כימות colorimetric אחרים פלואורסצנטי 38 שיטות זמינות. ב מבחני רדיואקטיבי, עוצמת הקרינה ניתן למדוד לאחר הדגירה של התאים עם אנלוגי D- גלוקוז פלואורסצנטי -2 [ N - (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) amino] 2-deoxy-D-glucose (2-NBDG). עם אנלוגי זה, קבוצות מסוימות דיווחו כי האינסולין איבד את ההשפעות הפיזיולוגיות שלו בתאי L6, כאשר קבוצות אחרות הראו כי אינסולין עדיין מגביר את ספיגת הגלוקוז (בתאי שריר ראשוניים של בני אדם) 38 . בשל ביטוי נמוך GLUT4, כימות האינסולין מגורה ספיגת גלוקוז בתאי השריר בתרבית מצטמצם לעומת בתנאים vivo 6 , 16 . לכן חשוב לאפיין את היענות האינסולין של תאי השריר התרבותיים באמצעות גישות אחרות. מדידות של מצב זירחון של חלבונים מרכזיים של נתיב איתות האינסולין (כמו Akt / PKB ו / או GSK3) באמצעות immuno- איתור ניתן להשתמש 14 , 21 , 31 . ברמה האנזימטית, סינתזה גליקוגן, גלוקוז ו / או חמצון השומנים ניתן גם להעריך בתנאים עם וללא אינסולין 14 , 26 , 31 . כל cel אחרים<html> סוג l (אם הוא מגיב לאינסולין או לא) יכול תיאורטית להיות מנותח כמו כל התאים יכולים באופן פעיל או פסיבית ספיגת גלוקוז. לפיכך ניתן להחליף את הבארות הממריצות את האינסולין על ידי טיפול מתאים אחר. השימוש myotube העיקרי האדם מרמז כי תאי השריר הגיעו למצב בידול עולה בקנה אחד עם ביטוי מספיק חלבון GLUT4. אם ההכנה מכילה תאים שאינם שרירים או מיובלאסטים במהותם, ערכי ספיגה של גלוקוז במצב גירוי אינסולין לא יהיו שונים מהמצב הבסיסי ( Ria לעומת R Ba ), בעיקר בשל הדומיננטיות של טרנספורטר GLUT1. אינסולין ניתן להוסיף לתרבית העיקרית שריר תרבות התא כדי לקדם ולשפר התפשטות תאים שרירים בידול. עם זאת, אינסולין הוכח גם לגרום לעמידות לאינסולין בגירוי כרוני 40 , 41 ,Class = &quot;xref&quot;&gt; 42. בניסויים שלנו, תאי השריר הראשיים של האדם מבדילים בצורה נכונה רק עם שינוי בינוני עם סרום מופחת. לכן אנו מעדיפים לא להוסיף אינסולין חיצוני במהלך התרבות כדי לשמר את התאים מפני גירוי כרוני לפני הערכה של היענות לאינסולין. לבסוף, השיטה דורשת כמה צעדים כביסה. לכן, יש להקפיד לא לנתק תאים מהצלחת כפי שהוא יכול לקרות עם תאים ראשוניים.

שריר השלד הוא הפיקדון הגדול ביותר גלוקוז ביונקים תורמת במידה רבה גלוקוז הומיאוסטזיס. זו רקמת תגובה אינסולין הוא האתר העיקרי של ספיגה הגלוקוז כי מופעלת על ידי גירוי אינסולין 1 . בסוכרת מסוג 2, עמידות לאינסולין נצפתה במספר רקמות, כולל שריר השלד, ומובילה לריכוז גבוה יותר של גלוקוז בדם. לכן, יש חשיבות רבה לקביעת רמת הרגישות לאינסולין של רקמה זו ותאייה, בין אם המטרה היא לאפיין פגם בנושא או להעריך את היעילות של טיפול המיועד לשפר אותו. בבעלי חיים אנושיים או בבעלי חיים, טכניקת הזהב סטנדרטית להעריך רגישות לאינסולין הוא מהדק hyperinsulinemic-euglycemic. הוצג על ידי DeFronzo בשנת 1979 2 ו שונה מאז 3 , 4 אז, השיטה מאפשרת לכמת את כל הגוףNd רקמות התגובה האינסולין נמדד כמו שיעור גלוקוז להיות perfused תחת גירוי אינסולין לשמור על ריכוז גלוקוז בדם רגיל. בדיקת רגישות לאינסולין יכולה להתבצע גם ברמת התא באמצעות מודלים של שריר במבחנה , ומדידת שיעורי ספיגת הגלוקוז נותרת כלי יעיל ואמין לכמת התגובה הביולוגית של התא לגירוי אינסולין 5 , 6 , 7 . ואכן, מדידת ספיגת הגלוקוז מכמתת את התגובה הביולוגית של התא לגירוי אינסולין, מהכריכה של אינסולין לקולטן שלה לטרנסלוקציה של שלפוחית ​​GLUT4 מועשר, כולל איתות תאיים ומפלצי זרחון 8 . זה עניין מרכזי עם דגימות אנושיות, כמו myotubes מובחן לשמור על תכונות רבות של פנוטיפ התורם, כולל trueat מטבוליתIes והפרעות שנצפו בחולה 9 , 10 , 11 , 12 . המיאוטובס מציג קווי דמיון מבניים, מטבוליים ופנוטיפיים לשרירי השלד 13 , 14 , כולל הביטוי של מובילי גלוקוז 15 ומנגנון האינסולין הסלולרי 16 . לפיכך, מדידה של ספיגה הגלוקוז ב myotubes העיקרי הוא רלוונטי לאפיון פנוטיפ השריר של התורם, או לחקור את ההשפעה של התערבות (סמים, תזונה, או פעילות גופנית) על רגישות האינסולין בתא השריר. המדידה של ספיגה גלוקוז על המיאוביים תרבותיים גם הוא כלי אמין בעת ​​ביצוע ניסויים לשנות רגישות לאינסולין 17 , 18 . במבחנה </Em&gt; מתאים למבחן של כל תרכובות שיכולות לשפר את היענות האינסולין, או למנוע או לבטל את התנגדות האינסולין שנרכשה או המושרה , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט לתרבות להבדיל מיוטוב האדם למדוד את שיעורי ספיגת גלוקוז התא. השיטה מתאימה לכל מקור של תאים מבשר שרירים אנושיים, בין אם הם באים מתוך ההכנות במעבדה, שיתוף פעולה או ספקים זמינים מסחרית. שורות תאים שרירים מונצחים, כמו C2C12 ו- L6, בהתאמה ממקור עכבר ומ חולדה, יכולים לשמש גם למדידת ספיגה של גלוקוז עם פרוטוקול זה. אנו מספקים פרוטוקול מפורט לכמת את שיעורי במדינות בסיס ומעוררת אינסולין באמצעות radiolabeled [ 3 H] 2dG. Tהוא משתמש אנלוגי גלוקוז שכותרתו מאפשר קביעת מדויקת של כניסת גלוקוז עם חומר מופחת החל, מצב שכיח בעת עבודה עם תאים ראשוניים. מולקולה גלוקוז שונה אינו מסוגל להיכנס נתיבים מטבוליים, ולכן, מצטבר בתוך התא, המאפשר כימות אמין באמצעות רדיואקטיביות התא הכולל. תנאי הניסוי כוללים את השימוש של מעכב גלוקוז תחבורה (cytochalasin B), ומדידות מבוצעות עם וללא אינסולין. שילוב זה מאפשר לקבוע את ערכי הכניסה הפעילים לגלוקוז, כמו גם את חישוב השינוי לקפל עבור אינדקס התגובה לאינסולין. השיטה מוצגת עם מנה אחת של אינסולין במהלך זמן הדגירה יחיד, אבל הפרוטוקול יכול בקלות להיות שונה עבור התגובה מינון או קורס זמן ניסויים 12 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="868">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Human primary muscle cell</td>
			<td style="width:171px;">In house preparation from human skeletal muscle biopsies</td>
			<td style="width:180px;">In house preparation from human skeletal muscle biopsies</td>
			<td style="width:257px;">If not available, use commercial source</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Human primary muscle cell</td>
			<td style="width:171px;">Promocell</td>
			<td>C-12530</td>
			<td style="width:257px;">Should be cultured with associated media C23060 and C23061</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">6-well plate</td>
			<td style="width:171px;">Corning</td>
			<td style="width:180px;">356400</td>
			<td style="width:257px;">BioCoat Collagen I Multiwell Plates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Ham&#39;s F10</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">L0145-500</td>
			<td style="width:257px;">1 g/l glucose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Glutamine</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">X0551-100</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">penicilin/streptomycin 100x</td>
			<td style="width:171px;">Thermo fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">15140122</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Serum substitute UltroserG</td>
			<td style="width:171px;">Pall France</td>
			<td style="width:180px;">15950.017</td>
			<td style="width:257px;">serum substitute in text</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">DMEM low glucose</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">L0064-500</td>
			<td style="width:257px;">1 g/l glucose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Fetal Calf Serum</td>
			<td style="width:171px;">Eurobio</td>
			<td style="width:180px;">CVFSVF00-01</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">L0625-500</td>
			<td style="width:257px;">Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Insulin solution human</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">I9278</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">2-deoxy-D-glucose&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">D6134</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Albumin bovine</td>
			<td style="width:171px;">euromedex</td>
			<td style="width:180px;">04-100-812-E</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">fatty acid-free BSA</td>
			<td style="width:171px;">Roche</td>
			<td style="width:180px;">10,775,835,001</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">palmitate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">P0500</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:180px;">NET328A001MC</td>
			<td style="width:257px;">Specific Activity: 5-10Ci (185-370GBq)/mmol, 1mCi (37MBq</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Cytochalasin B</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">c2743</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PICO PRIAS VIAL 6ml</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:180px;">6000192</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">ultima gold MW CA&#160;</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td>6013159</td>
			<td style="width:257px;">scintillation liquid</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">b&#234;ta counter&#160;</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:180px;">2900TR</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glucose uptake measurement and response to insulin stimulation in in vitro cultured human primary myotubes

שריר השלד הוא הפיקדון הגדול ביותר גלוקוז ביונקים תורמת במידה רבה גלוקוז הומיאוסטזיס. הערכה של רגישות לאינסולין של תאי שריר היא רלוונטית משמעותית עבור כל המחקרים המוקדש לחקר מטבוליזם גלוקוז בשרירים ואפיון שינויים מטבוליים. בתאי שריר, חלבונים מסוג 4 גלוקוז מסוג 4 (GLUT4) מתורגמים לממברנת הפלסמה בתגובה לאינסולין, ובכך מאפשרים כניסה מסיבית של גלוקוז לתא. היכולת של תאי שריר להגיב לאינסולין על ידי הגדלת שיעור ספיגת הגלוקוז הוא אחד readouts תקן לכמת רגישות תאי שריר לאינסולין. מיוטובין ראשוני האדם הם מתאימים במודל חוץ גופית , כמו התאים לשמור על תכונות רבות של פנוטיפ התורם, כולל רגישות לאינסולין. מודל זה במבחנה מתאים גם למבחן של כל תרכובות שעלולות להשפיע על היענות האינסולין. מדידות של שיעור ספיגת הגלוקוז במיטובים מובחנים משקפיםרגישות לאינסולין. בשיטה זו, תאי שריר ראשוניים אנושיים מתורבתים במבחנה כדי לקבל מיוטובים מובחנים, ושיעורי ספיגה של גלוקוז עם גירוי אינסולין ובלי נמדדים. אנו מספקים פרוטוקול מפורט לכמת שיעורי העברה גלוקטיבית פסיבית פעילה באמצעות [ 3 H] 2-deoxy-D-Glucose [ 3 H] 2dG). שיטות חישוב ניתנים לכמת פעיל basal ו אינסולין מגורה שיעורי, כמו גם גירוי לקפל.

ביום 3, myoblasts להגיע מפגש ( איור 1 א ). את myoblasts בשלב זה הם בדרך כלל mononucleated. בינוני השתנה ביום 8, הבחנה הושלמה ( איור 1 ב ) (פרוטוקול סעיף 2). לאחר 5 ימים של הבחנה, מיוטובים מיושרים ו polynucleated בדרך כלל. מיוטובים ראשוניים של האדם היו נתונים לפאלמיט או לטיפול BSA בלבד לפני מדידת קצב ספיגה של גלוקוז. תאים הודגרו עבור 48 שעות עם palmitate 0.5 מ&quot;מ ב BSA (PALM) או BSA לבד (BSA). גירוי האינסולין בוצע (פרוטוקול סעיף 3) ספיגה גלוקוז נמדדה (סעיף 4 פרוטוקול). איור 2 מציג קצב ספיגה של גלוקוז במצב בקרה (BSA) ומצב טיפול (PALM). ספיגה לא ספציפית הוא לכמת ב myotubes מודגרות עם cytochalasin B. בסל ואינסולין מגורה שיעורי ספיגת גלוקוז ניתן להשוות BSA ו PAL<html> תנאי M. אינסולין מגדיל באופן משמעותי את רמת הסוכר בדם במצב BSA (p &lt;0.01). שיעור ספיגת הגלוקוז הממריץ באינסולין נמוך משמעותית במיאוטובוסים שטופלו ב- PALM (p &lt;0.05). יתר על כן, תגובת האדם myotube האינסולין יכול גם לבוא לידי ביטוי כמו שינוי לקפל. איור 3 מראה כי התגובה לאינסולין הוא ירד ב myotubes שטופלו PALM בהשוואה לשליטה (p &lt;0.05). למרות הביטוי המוגבל של חלבון GLUT4 ב myotubes בתרבית, תאי השריר העיקריים מסוגלים להגיב לאינסולין עם עלייה ספיגה הגלוקוז ( איור 2 ). השינוי הקפל הממוצע שנצפה הוא ~ 1.3, בדומה למה שתואר על ידי קבוצות אחרות עם תאי שריר אנושיים 6 , 7 , 10 , 26 ,&gt; 27. אינדוקציה של עמידות לאינסולין בתאי שריר עם חומצת שומן רווי מתואר בדרך כלל בתאי שריר של עכבר, חולדה ותאי אדם, והוכח להפחתת ספיגת הגלוקוז של תאי שריר מטופלים 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 . ביצענו הדגירה palmitate (0.5 מ&quot;מ) במשך 48 שעות וצפתה ירידה בשיעור של ספיגת גלוקוז בבסיס ו אינסולין מגורה ירידה ירידה בקפל אינסולין, המשקף את מצב עמידות לאינסולין. זמן דגירה בשימוש בכתב יד זה נבחרה כדי להדגים באופן מלא את ההשפעה המעכבת על ספיגת גלוקוז. פעמים הדגירה קצר יכול גם לייצר עמידות לאינסולין מופחתת ספיגת גלוקוז 31 , 32 , 33 </<html> Sup , 34 . ריכוזים נמוכים יותר ולכן פיזיולוגיים יותר ניתן להשתמש במבחנה , כמו גם התגובה מינון ו / או ניסויים זמן, והשוואה עם ההשפעה של חומצות שומן בלתי רוויות כמו oleate 29 , 35 . <img alt="איור 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55743/55743fig1.jpg" /> איור 1: במבחנה ראשוני האדם. תמונות של מיאוטוב האדם ב 2 שלבים של התרבות המתקבל באמצעות מיקרוסקופ אופטי מוצגים. ( א ) יום 3 של תרבות myoblast ב מפגש. ( ב ) ביום 8 (5 ימים של הבחנה), מיוטובים מיושרים. סולם בר = 200 מיקרומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55743/55743fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> בתוך הדף = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55743/55743fig2.jpg" /> איור 2: השפעת גירוי האינסולין על שיעור ספיגה של גלוקוז במיאוטוביות האדם בתנאים BSA ו- PALM. Myotubes טופלו BSA לבד או 0.5 מ&quot;מ PALM במשך 48 שעות. לאחר שינוי בינוני ו 3 שעות של דלדול בסרום, שיעור ספיגת גלוקוז ספציפי (ב pmol / mg / min) נמדד בהיעדר (-) או בנוכחות (+) של אינסולין (1 h, 100 ננומטר). הנתונים הם ממוצעים של ארבעה ניסויים עצמאיים באמצעות מיוטובים מארבעה תורמים שונים. #P &lt;0.05 בהשוואה לערך הבסיסי; * P &lt;0.05 בהשוואה לערך גירוי אינסולין BSA. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55743/55743fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55743/55743fig3.jpg" /> איור 3: מקפל Iתגובת nsulin ב BSA ו PALM תנאי תרבות. יחס האינסולין מגורה על קצב העברת הגלוקוז הבסיסי בתנאים BSA ו- PALM. יחס זה נותן את הקליטה גלוקוז שיעור ספיגה על גירוי אינסולין (100 ננומטר). * P &lt;0.05 בהשוואה למצב BSA (n = 4). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55743/55743fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes at JoVE.com

מדידת ספיגת גלוקוז ותגובה לגירוי אינסולין ב-In Vitro Myotubes ראשוניים בבני אדם | ביולוגיה | וִידֵאוֹ

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

בשיטה זו, תאי השריר העיקריים של האדם מתורבתים במבחנה כדי לקבל מיוטובים מובחנים ושיעורי ספיגה של גלוקוז נמדדים. אנו מספקים פרוטוקול מפורט לכמת את שיעורי במדינות בסיס ומעוררת אינסולין באמצעות [ 3 H] 2-deoxy-D גלוקוז.

גלוקוז ספיגה מדידה ותגובה גירוי אינסולין ב<em&gt; במבחנה</em&gt; מיוטובים ראשוניים אדם מתורבת

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...

glucose-uptake-measurement-response-to-insulin-stimulation-in-vitro

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Cellular Processes

Metabolism

SCIENTISTS IN ACTION

19.7K Views.  University of Lyon.  בשיטה זו, תאי השריר העיקריים של האדם מתורבתים במבחנה כדי לקבל מיוטובים מובחנים ושיעורי ספיגה של גלוקוז נמדדים. אנו מספקים פרוטוקול מפורט לכמת את שיעורי במדינות בסיס ומעוררת אינסולין באמצעות [ 3 H] 2-deoxy-D גלוקוז. 

Video: Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

כימות γH2AX מוקדים בתגובה קרינה Ionising

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function to maintain glucose homeostasis during developmental larval stages 1,2. Studies on largely post-mitotic adult flies have revealed perturbation of glucose homeostasis as the result of genetic ablation of insulin-like peptide (ILP) producing cells (IPCs) 3. Thus, adult fruit flies hold great promise as a suitable genetic model system for metabolic disorders including type II diabetes. To further develop the fruit fly system, comparable physiological assays used to measure glucose tolerance and insulin sensitivity in mammals must be established. To this end, we have recently described a novel procedure for measuring oral glucose tolerance response in the adult fly and demonstrated the importance of adult IPCs in maintaining glucose homeostasis 4,5. Here, we have modified a previously described procedure for insulin injection 6 and combined it with a novel hemolymph extraction method to measure peripheral insulin sensitivity in the adult fly. Uniquely, our protocol allows direct physiological measurements of the adult fly's ability to dispose of a peripheral glucose load upon insulin injection, a methodology that makes it feasible to characterize insulin signaling mutants and potential interventions affecting glucose tolerance and insulin sensitivity in the adult fly.

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved insulin signaling pathways found in the fruit fly Drosophila melanogaster make this organism a potential tool for modeling metabolic disorders including type II diabetes. To this end, it is critical to establish physiological assays to effectively measure systemic insulin action in peripheral glucose disposal in the adult fly.

הזרקת אינסולין ו Extraction Hemolymph כדי למדוד את הרגישות לאינסולין אצל מבוגרים תסיסנית melanogaster</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

הבידוד של הריבוזום פוליפפטידים המתהווה כרוכים<em&gt; במבחנה</em&gt; כדי לזהות אתרים השהה של תרגום לאורך ה-mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized microtubules. Organelles move along these processes by microtubule motors. Easy maintenance, high sensitivity to RNAi-mediated protein knock-down and efficient procedure for creating stable cell lines make Drosophila S2 cells an ideal model system to study cargo transport by live imaging. The results obtained with S2 cells can be further applied to a more physiologically relevant system: axonal transport in primary neurons cultured from dissociated Drosophila embryos. Cultured neurons grow long neurites filled with bundled microtubules, very similar to S2 processes. Like in S2 cells, organelles in cultured neurons can be visualized by either organelle-specific fluorescent dyes or by using fluorescent organelle markers encoded by DNA injected into early embryos or expressed in transgenic flies. Therefore, organelle transport can be easily recorded in neurons cultured on glass coverslips using living imaging. Here we describe procedures for culturing and visualizing cargo transport in Drosophila S2 cells and primary neurons. We believe that these protocols make both systems accessible for labs studying cargo transport.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells and cultured neurons are great systems for imaging of motor-driven organelle transport in vivo. Here we describe detailed protocols for culturing both cell types, their imaging and analysis of transport.

אברון תחבורה בתרבית<em&gt; דרוזופילה</em&gt; תאים: תא קו S2 ויסודי נוירונים.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA (dsDNA) which has the requisite characteristics to stimulate the cytoplasmic DNA sensing pathways can be generated cheaply and with ease. By the concatemerization of short, synthetic oligonucleotides (which lack CpG motifs), dsDNA can be generated to be of sufficient length to activate the cytosolic DNA sensing pathway. This protocol involves blunt end ligation of the oligonucleotides in the presence of polyethylene glycol (PEG), which provides an environment for efficient ligation to occur. The dsDNA concatemers can be used, following purification by phenol/chloroform extraction, to simulate the innate immune response in vitro by standard transfection protocols. This DNA can also be used to stimulate innate immunity in vivo by intradermal injection into the ear pinna of a mouse, for example. By standardizing the concatemerization process and the subsequent stimulation protocols, a reliable and reproducible activation of the innate immune system can be produced.

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

The aim of the protocol is to use optimal methods for stimulating the cytoplasmic DNA sensing pathways in cells and in vivo. This is achieved by improving the generation of long, double-stranded DNA during blunt-end ligation. Cells or mice are then transfected using a lipid transfection reagent.

גירוי של cytoplasmic מסלולי חישה DNA<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

מדידת תגובת האכלה מושרה גלוטתיון בהידרה

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the large size of the human BRCA2 protein (approximately 390 kDa). We report modifications of standard siRNA transfection and immunoblotting protocols to silence human BRCA2 and detect endogenous BRCA2 protein, respectively, in human epithelial cell lines. Key steps include a high siRNA to transfection reagent ratio and two subsequent rounds of siRNA transfection within the same experiment. Using these and other modifications to the standard protocol we consistently achieve more than 70% silencing of the human BRCA2 gene as judged by immunoblotting analysis with anti-BRCA2 antibodies. In addition, denaturation of the cell lysates at 55 &#176;C instead of the conventional 70-100 &#176;C and other technical optimizations of the immunoblotting procedure allow detection of intact BRCA2 protein even when very low amounts of starting material are available or when BRCA2 protein expression levels are very low. Efficient silencing of BRCA2 in human cells offers a valuable strategy to disrupt BRCA2 function in cells with intact BRCA2, including tumor cells, to examine new molecular pathways and cellular functions that may be affected by pathogenic BRCA2 mutations in tumors. Adaptation of this protocol for efficient silencing and analysis of other &#39;large&#39; proteins like BRCA2 should be readily achievable.

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented.

השתקת<em&gt; BRCA2</em&gt; לזיהוי פונקציות ביולוגיות-מוסדר BRCA2 רומן בתאי אדם בתרבית

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

גאפ junctional אינטר תקשורת: ביומרקר פונקציונלית להערכת תופעות לוואי של toxicants ורעלים, ואת היתרונות הבריאותיים של מוצרים טבעיים

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium discoideum revealed that a complex signal transduction network of parallel pathways amplifies the response to chemoattractants, and leads to biased actin polymerization and protrusion of a pseudopod in the direction of a gradient. In contrast, molecular mechanisms driving other types of directed migration, for example, due to exposure to shear flow or electric fields, are not known. Many regulators of chemotaxis exhibit localization at the leading or lagging edge of a migrating cell, as well as show transient changes in localization or activation following global stimulation with a chemoattractant. To understand the molecular mechanisms of other types of directed migration we developed a method that allows examination of cellular response to acute mechanical stimulation based on brief (2 - 5 s) exposure to shear flow. This stimulation can be delivered in a channel while imaging cells expressing fluorescently-labeled biosensors to examine individual cell behavior. Additionally, cell population can be stimulated in a plate, lysed, and immunoblotted using antibodies that recognize active versions of proteins of interest. By combining both assays, one can examine a wide array of molecules activated by changes in subcellular localization and/or phosphorylation. Using this method we determined that acute mechanical stimulation triggers activation of the chemotactic signal transduction and actin cytoskeleton networks. The ability to examine cellular responses to acute mechanical stimulation is important for understanding the initiating events necessary for shear flow-induced motility. This approach also provides a tool for studying the chemotactic signal transduction network without the confounding influence of the chemoattractant receptor.

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Here we describe methods for assessing cellular response to acute mechanical stimulation. In the microscopy-based assay, we examine localization of fluorescently-labeled biosensors following brief stimulation with shear flow. We also test activation of various proteins of interest in response to acute mechanical stimulation biochemically.

הערכה של Dictyostelium discoideum בתגובה חריפה גירוי מכני

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...