עבודה זו נתמכה על ידי פריץ תיסן קרן (Az.10.14.2.152). אנו מודים למתקן הטבעת רקמות ואת מתקן גרעין מיקרוסקופ של CMMC. אנו מודים על הדיונים ותמיכה טכנית מסופק על ידי חברי המעבדה לביולוגיה centrosome ו נוגדנים. אנו מודים לי מינג Gooi להגהה את כתב היד.

<ol>
	<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501, 373-379 (2013).</li><li>Eiraku, M., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+embryonic+stem+cell+culture+for+generation+of+three-dimensional+retinal+and+cortical+tissues.">Mouse embryonic stem cell culture for generation of three-dimensional retinal and cortical tissues.</a> Nat Protoc. 7, 69-79 (2012).</li><li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs.">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).</li><li>Gabriel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CPAP+promotes+timely+cilium+disassembly+to+maintain+neural+progenitor+pool.">CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool.</a> EMBO J. 35 (8), 803-819 (2016).</li><li>Al-Dosari, M. S., Shaheen, R., Colak, D., Alkuraya, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+CENPJ+mutation+causes+Seckel+syndrome.">Novel CENPJ mutation causes Seckel syndrome.</a> J Med Genet. 47, 411-414 (2010).</li><li>Wollnik, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+mechanism+for+microcephaly.">A common mechanism for microcephaly.</a> Nat Genet. 42, 923-924 (2010).</li><li>Thornton, G. K., Woods, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+microcephaly:+do+all+roads+lead+to+Rome?.">Primary microcephaly: do all roads lead to Rome?.</a> Trends Genet. 25, 501-510 (2009).</li><li>Barbelanne, M., Tsang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+basis+of+autosomal+recessive+primary+microcephaly.">Molecular and cellular basis of autosomal recessive primary microcephaly.</a> Biomed Res Int. 2014, 547986 (2014).</li><li>Homem, C. C., Repic, M., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+control+in+neural+stem+and+progenitor+cells.">Proliferation control in neural stem and progenitor cells.</a> Nat. Rev. Neurosci. 16, 647-659 (2015).</li><li>Gabriel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CPAP+promotes+timely+cilium+disassembly+to+maintain+neural+progenitor+pool.">CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool.</a> EMBO J. 35, 803-819 (2016).</li><li>Mak, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules+greatly+improve+conversion+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+to+the+neuronal+lineage.">Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage.</a> Stem Cells Int. , (2012).</li><li>Morizane, A., Doi, D., Kikuchi, T., Nishimura, K., Takahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibitors+of+bone+morphogenic+protein+and+activin/nodal+signals+promote+highly+efficient+neural+induction+from+human+pluripotent+stem+cells.">Small-molecule inhibitors of bone morphogenic protein and activin/nodal signals promote highly efficient neural induction from human pluripotent stem cells.</a> J. Neurosci. Res. 89, 117-126 (2011).</li><li>Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cerebral+cortex+neurons+and+neural+networks.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks.</a> Nat Protoc. 7, 1836-1846 (2012).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+induction+of+neural+conversion+in+human+ESCs+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+with+a+single+chemical+inhibitor+of+transforming+growth+factor+beta+superfamily+receptors.">High-efficiency induction of neural conversion in human ESCs and human induced pluripotent stem cells with a single chemical inhibitor of transforming growth factor beta superfamily receptors.</a> Stem Cells. 28, 1741-1750 (2010).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells.">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nat Methods. 8, 409-412 (2011).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences.">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li><li>Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+with+CytoTune,+a+non-integrating+Sendai+virus.">Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus.</a> Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).</li><li>Bai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+analysis+of+genome+alterations+induced+by+single-cell+passaging+in+human+embryonic+stem+cells.">Temporal analysis of genome alterations induced by single-cell passaging in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells Dev. 24, 653-662 (2015).</li><li>Garitaonandia, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+risk+of+genetic+and+epigenetic+instability+in+human+embryonic+stem+cells+associated+with+specific+culture+conditions.">Increased risk of genetic and epigenetic instability in human embryonic stem cells associated with specific culture conditions.</a> PLoS One. 10, e0118307 (2015).</li><li>Ohnuma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-free+passage+of+human+pluripotent+stem+cells+by+controlling+divalent+cations.">Enzyme-free passage of human pluripotent stem cells by controlling divalent cations.</a> Sci. Rep. 4, 4646 (2014).</li><li>Currle, D. S., Monuki, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash+freezing+and+cryosectioning+E12.5+mouse+brain.">Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain.</a> J Vis Exp. , (2007).</li><li>Yingling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroepithelial+stem+cell+proliferation+requires+LIS1+for+precise+spindle+orientation+and+symmetric+division.">Neuroepithelial stem cell proliferation requires LIS1 for precise spindle orientation and symmetric division.</a> Cell. 132, 474-486 (2008).</li><li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+step+for+the+cell,+a+giant+leap+for+mankind:+a+hypothesis+of+neocortical+expansion+during+evolution.">A small step for the cell, a giant leap for mankind: a hypothesis of neocortical expansion during evolution.</a> Trends Neurosci. 18, 383-388 (1995).</li><li>Hu, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+follows+developmental+principles+but+with+variable+potency.">Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 4335-4340 (2010).</li><li>Wilson, P. G., Stice, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+differentiation+of+neural+rosettes+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Development and differentiation of neural rosettes derived from human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Reviews. 2, 67-77 (2006).</li><li>Dhara, S. K., Stice, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Neural differentiation of human embryonic stem cells.</a> J. Cell Biochem. 105, 633-640 (2008).</li><li>Christie, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+evaluation+of+synthetic+retinoid+derivatives+as+inducers+of+stem+cell+differentiation.">Synthesis and evaluation of synthetic retinoid derivatives as inducers of stem cell differentiation.</a> Org Biomol Chem. 6, 3497-3507 (2008).</li><li>Kim, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+enhancement+of+neural+differentiation+from+human+ES+and+iPS+cells+regardless+of+their+innate+difference+in+differentiation+propensity.">Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity.</a> Stem Cell Reviews. 6, 270-281 (2010).</li><li>Gabriel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Zika+Virus+Isolates+Induce+Premature+Differentiation+of+Neural+Progenitors+in+Human+Brain+Organoids.">Recent Zika Virus Isolates Induce Premature Differentiation of Neural Progenitors in Human Brain Organoids.</a> Cell stem cell. , (2017).</li><li>Wu, J., Hunt, S. D., Xue, H., Liu, Y., Darabi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+Characterization+of+a+MYF5+Reporter+Human+iPS+Cell+Line+Using+CRISPR/Cas9+Mediated+Homologous+Recombination.">Generation and Characterization of a MYF5 Reporter Human iPS Cell Line Using CRISPR/Cas9 Mediated Homologous Recombination.</a> Sci. Rep. 6, 18759 (2016).</li><li>Li, H. L., Gee, P., Ishida, K., Hotta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genomic+correction+methods+in+human+iPS+cells+using+CRISPR-Cas9+system.">Efficient genomic correction methods in human iPS cells using CRISPR-Cas9 system.</a> Methods. 101, 27-35 (2016).</li><li>Grobarczyk, B., Franco, B., Hanon, K., Malgrange, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Isogenic+Human+iPS+Cell+Line+Precisely+Corrected+by+Genome+Editing+Using+the+CRISPR/Cas9+System.">Generation of Isogenic Human iPS Cell Line Precisely Corrected by Genome Editing Using the CRISPR/Cas9 System.</a> Stem Cell Reviews. 11, 774-787 (2015).</li><li>Camp, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cerebral+organoids+recapitulate+gene+expression+programs+of+fetal+neocortex+development.">Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 15672-15677 (2015).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-Region-Specific+Organoids+Using+Mini-bioreactors+for+Modeling+ZIKV+Exposure.">Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure.</a> Cell. 165, 1238-1254 (2016).</li><li>Jo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain-like+Organoids+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Contain+Functional+Dopaminergic+and+Neuromelanin-Producing+Neurons.">Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons.</a> Cell Stem Cell. 19, 248-257 (2016).</li><li>Mariani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXG1-Dependent+Dysregulation+of+GABA/Glutamate+Neuron+Differentiation+in+Autism+Spectrum+Disorders.">FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders.</a> Cell. 162, 375-390 (2015).</li><li>D'Avanzo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+in+3D+culture:+challenges+and+perspectives.">Alzheimer's in 3D culture: challenges and perspectives.</a> Bioessays. 37, 1139-1148 (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

MCPH היא הפרעה נוירו-התפתחותיות מורכבות אנושית שלא ניתן לסכם במודלים של בעלי חיים in vivo או תרבית תאים אנושיים פשוטים גישות במבחנה. הביטוי הקליני של MCPH מתחיל להופיע במהלך הטרימסטר הראשון, כאשר בתחילת נוירוגנסיס מתחיל. לפיכך, organoids מוח 3D מייצג מערכת ניסיונית אמינה מודל פיתוח MCPH. בנוסף, organoids המוח האנושי 3D הוא גישה אידיאלית מאז i) הם מאפשרים ההתאמה של ספקטרום של דגימות חולות עם רקע גנטי שונה, ii) הם מציגים רקמות מאורגנות המכילות סוגי תאים עצביים שונים, וכן, חשוב, iii) בידול שונה שלבי התפתחות המוח בגישה במבחנה זו מקושרים עמיתיהם in vivo שלהם 25, 26, 27. לדוגמא, השושנה העצבית הוא מבנה שווה עצבי הפיתוחצינור. לנקסטר ואח. בשימוש מספר כפול של iPSCs החולה לעומת שליטה iPSCs כדי להצליח ביצירת organoids החולה. ראוי לציין, עם הפרוטוקול המתואר כאן, על ידי שינוי השיטות הקיימות, נוכל ליצור מלא organoids מוח ממיקרוצפלוס- החל מאותו המספרים הסלולריים 4. זה היה אפשרי בשל תנאי התרבות המוגדרים של iPSCs ובשל בידול מכוון יותר. בפרוטוקול זה, דור organoid השתפר ידי החלפת צעד היווצרות EB בצע פקודות באמצעות ייזום בידול עצבי ישירות iPSCs. שנית, בשלב 3, dorsomorphin ו SB431542 נוספו לתוך המדיום התרבות במקום החומצה הרטינואית לבד. חומצה רטינואית היא isomerized בקלות כאשר מוחלים על תרבית תאים בינוני 28. לכן, הפעילות הביולוגית שלה היא פחות מוגדרת מזו של תרכובות יציבות יותר כגון dorsomorphin. מעכב Dorsomorphinמסלול איתות BMP4, ו SB431542 הוא מעכב של מסלול Activin / איתות קטרי (TGF-β1 ALK מעכב). שילוב של שניהם התרכובות מוביל העיכוב של BMP ואת Activin / מסלול איתות קטרים, גורם בידול עצבי, ומקטין את הבידול לתוך שושלות אחרות שורות תאים שונות עובריים אנושי או תאי שב&quot;ס אדם עם יעילות דומה 29. יציבות מתחמת ותגובת תא אוניברסלית תרכובת הן נקודות חשובות לקביעת פרוטוקול שניתן להחיל שורות תאי חולים שונות למדל מחלה במבחנה. לפיכך, תוצאות בידול חזקות ויעילות מוח הומוגנית organoid תרבויות, בסופו של דבר, ב נתונים לשחזור יותר. עם שינויים אלה, שלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול הם מזעריים להתחלת הבידול בשלב 1. בשלב זה, חשוב לנתק את iPSCs בעדינות לתוך השעית תא בודדnd להפיץ אותם במדויק ובאופן שווה היטב בכל צלחת 96-היטב. Rho-מזוהה מעכב חלבון קינאז (Y-27,632) יש להוסיף B בינוני במהלך 24 h הראשון, כפי שהוא תומך הישרדות של iPSCs על ניתוק שלהם תאים בודדים. חשוב להביא תאים במגע קרוב עם השני על ידי ספינינג אותם לתחתית של בארות. לאחר neurospheres נוצרות בסוף השלב 1, ההשלמה המוצלחת של פרוצדורות נוספות ניתן לצפות. במקרה neurospheres לא יוצר את מגוונת&quot; של iPSCs האדם, אי-ההתמדה של התאים בצלחת 96-היטב, ואת התנאים צנטריפוגה חייבת להיבדק. ההליך כולו ביום 0 של צעד 1 צריך לקחת יותר 1 h בשל הרגישות של iPSCs האנושי. שינויים בינוניים במהלך הימים הבאים חייבים להיעשות בזהירות, הימנעות כוחות מוחלטים, כדי לא להרוס קשרי תא נוצרו טרי בין התאים. ראוי לציין כי centrosomיש מוטציות אל התפשטות תאים פגומים והדינמיקה מחזור התא משתנה. לפיכך, דוגמנות MCPH דורשת פרוטוקול חזק שיכול לעמוד פונקציות הסלולר נפגעות. לפיכך, הפרוטוקול הנוכחי מאפשר לדור של organoids הומוגנית של איכות גבוהה ומשמש ככלי ייחודי ללמוד הומאוסטזיס תא גזע בבית VZ. בניגוד פרוטוקולים אחרים, פרוטוקול זה מאפשר את הדור של organoids מן iPSCs המלא החולה, החל מספרים סלולריים שווים. עבור מחקרים המבוססים על בידול במבחנה, תנאי תרבות זהים עבור iPSCs השונה הם דרישה בסיסית לזהות שינויים הקשורים למחלות ולהימנע חפצי תרבות-תנאים. מלבד דוגמנות ממיקרוצפלוס- ממוצא גנטי, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם גם ממיקרוצפלוס- ממוצא לא-גנטי, לרבות זיהומים ויראליים נוירוטרופית, כימיקלים, או קרינה. 30 בנוסף, כלי ביולוגיה מולקולריים מודרניים, כגון קריספר / Cas9 הגנום עריכהing טכנולוגיות, ניתן ליישם organoids 3D לנתח היבטים ספציפיים של הפרדיגמה התפתחות המוח האנושי במבחנה 31, 32, 33. מצד השני, הדור של organoids המוח עד כה עדיין לא עבר את השליש השני הראשון ותחילת התפתחות אנושית 34. מצוין מגבלה זו ולאפשר לדור של organoids המוח הבוגר במבחנה היה לפתוח אפיקים חדשים למדל הפרעות ניווניות המתבטאים בשלבים מאוחרים יותר, כגון פרקינסון או אלצהיימר. ביישומים עתידיים, פרוטוקולי הכוונת בידול לאזורים ספציפיים יותר, כמו המוח הקדמי או המוח התיכון, עשוי להיות עניין ללמוד הפרעות נוירולוגיות מורכבות כמו אוטיזם וסכיזופרניה 35, 36, 37, </sעד&gt; 38. חשוב לציין, היבטים מסוימים צריכים להילקח בחשבון כאשר הסקת מסקנות ממחקרים organoid. המגבלה הראשונה היא כי אין כלי דם ברורים organoids. לפיכך, תחלופת גזים ואספקה מזינה במבחנה רק בקירוב תנאי vivo ב. שנית, מאז organoids המוח אינם מחוברים למערכות איבר מורכבות, מודל organoid חסר החיסונית שלמה, מטבוליות, ואת מערכת ההורמונלית. אף על פי כן, בהעדר ההיבטים הללו לפעמים מספק יתרון. לדוגמה, organoids המתואר כאן יכול להחליף immunosuppressed במודלים vivo כאשר פונה ההשפעה של המערכת החיסונית בפתוגנזה של הפרעות במוח. עם שימוש צלוחיות טווות, מספר רב של organoids יכול להיות שנוצר עבור ניסויים ביוכימיים, לניתוח רצפי transcriptome שלם, והקרנות תרופת תפוקה גבוהה. יחדיו, על ידי uלשיר פרוטוקול נוכחי, אפשר ליצור organoids מוח מתאי iPSCs אדם, אז מה שיכול להיות מנוצלים במגוון רחב של יישומים, מדוגמנות מחלה לפלטפורמות בדיקות סמים, על מנת להחליף ניסויים בבעלי חיים בצורה מהימנה בעתיד.

פרעות התפתחותיות אדם, כגון ממיקרוצפלוס-, ניתן ללמוד בצורה גרועה רק במודלים של בעלי חיים בשל העובדה כי מוח האנושי יש משטח קליפת מוח מורחב, תכונה ייחודית ושונת חיות לא אנושיות. היבט זה עושה התפתחות המוח האנושי תהליך מורכב כי לא ניתן ללמוד מספיק בתוך 2D, במערכת תרבית תאים במבחנה. מתעוררים טכניקות התרבות 3D לאפשר לדור של organoids דמויי רקמה מתאי גזע מושרים (iPSCs). במבחנת הבידול של תאי גזע פלוריפוטנטיים בתרבות השעית 3D מאפשר ההיווצרות של סוגי תאים שונים במועד ובאזור ספציפי, והוליד רקמות מאורגנות, מרובדת 1, 2, 3. הודות מעבד כי חלוץ בטכנולוגיות תרבות 3D ו demystified המורכבת של היווצרות איברים, החלה מתאי גזע,פתחנו שיטה חזקה של יצירת organoids המוח להתוות אירועים מוקדמים של התפתחות מוח אנושית מודל ממיקרוצפלוס- במבחנה 1, 2, 3. ראוי לציין כי התאמנו בשיטה המקורית שפיתח לנקסטר ואח. 1 כדי ליצור organoids מוחין. שיטה זו שונתה על פי דרישות הניסוי שלנו. מטרת מחקר מ ואח &#39;גבריאל. היה לנתח את המנגנונים התאיים ומולקולריים של תחזוקת תאי גזע עצבית במהלך התפתחות המוח. על מנת לעשות זאת, מחקר המכניסטי בוצע באמצעות ניתוח ובתאים עצביים (NPCs) ב organoids מוח 3D נגזר חולה ממיקרוצפלוס- 4. החולה הזה נשא מוטציה CPAP, חלבון centrosomal נשמר הנדרשים biogenesis centrosome 5. היפו מקובלהתזה היא כי ממיקרוצפלוס- הוא התוצאה של דלדול של ברכת NPC, זה עלול לנבוע גם למוות של תאים או בידול מוקדם 1, 6, 7, 8, 9. על ידי ניתוח אזורי חדרית (VZs) של organoids המוח ממיקרוצפלוס-, הודגם כי מספר משמעותי של NPCs לעבור חלוקת התא סימטרית, בניגוד organoids המוח נגזר מתורם בריא 4. ניתוחים מיקרוסקופים וביוכימיים נרחבים של organoids מוח microcephalic חשפו תפקיד לא צפוי עבור CPAP מבולגן ריסים בזמן 4. באופן ספציפי, CPAP מוטציה מזוהה עם פירוק cilium מפגר מחדש כניסת מחזור התא מתעכבת, מה שמוביל את הבידול המוקדם של NPCs 4. תוצאות אלו מצביעות על תפקיד עבור ריסים ב ממיקרוצפלוס- ו המעורבות EIR במהלך מלא הנוירוגנזה גודל המוח 10. חלקו הראשון של פרוטוקול זה הוא תיאור של שיטת שלושת השלבים ליצירת organoids המוח הומוגנית. כפי שהוזכר קודם לכן, הפרוטוקול לנקסטר המקורי הותאם ו שונה שמתאים למטרות שלנו 1. ראשית, iPSCs אדם מתורבת מצב מזין ללא מוגדר על Engelbreth-הולם-הנחיל (EHS) מטריקס. צעד זה ימנע את הווריאציות של תרביות תאי גזע פלוריפוטנטיים מזין תלוי. בפרוטוקול זה, בדומה להשפעת בידול העצבי להקים אפיתל עצבית מתחילה ישירות iPSCs. אם תדלג גוף embryoid (EB) צעד ההיווצרות, את ההתמיינות העצבית בצורה מבוקרת יותר וביים. גישה זו מגבילה את ההיווצרות הספונטנית undirected של שכבות תאי ניבט אחרות, כגון המזודרם ו endoderm. על ידי יישום פרוטוקול זה, neurospheres המכיל רוזטות עצבית ניתן לקצור ביום 5 עבור EHS הטבעת מטריקס ותרבות השעיה נייחת. מדיום organoid המשמש את הצעד השלישי של הפרוטוקול שלנו הוא השלים עם dorsomorphin ו SB431542. Dorsomorphin הוא מעכב מולקולות קטנות של חלבון העצם morphogenic (BMP), וכן SB431542 מעכב את TGFβ / Activin / מסלול איתות קטרים. השילוב של גורמים אלה יכול לקדם בידול עצבי בצורה יעילה יותר מאשר חומצה רטינואית לבד 11, 12, 13, 14. בסך הכל, שינויים אלה מאפשרים לדור לשחזור של organoids המוח, עם וריאציות מינימאליות ברחבי organoids. חשוב לציין, שיטה זו יושמה כדי ליצור organoids המוח microcephalic וחסונה מן iPSCs החולה, הנושאות מוטציות בגנים המשפיעים centrosomes והדינמיקה מחזור התא. החלק השני של פרוטוקול זה נותן הוראות להכנת brAin organoids לניתוח ופרשנות של ליקויים הסלולר ממיקרוצפלוס-. זה כולל קיבוע, cryosectioning, מכתים immunofluorescent, ואת ניתוח מיקרוסקופי confocal. פרוטוקול זה יספק את הקורא עם תיאור מפורט של תוצאות צפויות ובליווי לפרשנות.

<table><tbody><tr><td>Anti-mouse 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>Anti-rabbit 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21245</td><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td></tr><tr><td>Arl13b</td><td>proteintech</td><td>17711-1-AP</td><td>ARL13B rabbit polyclonal antibody&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CELLSPIN system</td><td>IBS Integra Bioscience</td><td>183001</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>32670</td><td>4&amp;prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco, US</td><td>31331093</td><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>P5499</td><td>Compound C; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Embedding medium</td><td>AppliChem</td><td>A9011, 0100</td><td>Mowiol; embedding medium; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified</td></tr><tr><td>Fish gelatin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>G7765-250ML</td><td>Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>AppliChem</td><td>A1067,1000</td><td>Glycine for molecular biology; multiple suppliers&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Inoculation loop with needle, disposable (1 &amp;micro;L)</td><td>Sigma Aldrich, US</td><td>BR452201-1000EA</td><td>multiple suppliers&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>I3536-100MG</td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco, US</td><td>25030081</td><td>L-glutamine (200 mM)</td></tr><tr><td>Medium A</td><td>Stem cell technologies</td><td>#05850</td><td>mTeSR1 (hiPSC medium)</td></tr><tr><td>Medium B</td><td>Stem cell technologies</td><td>#05835</td><td>Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium</td></tr><tr><td>Medium C</td><td>Gibco, US</td><td>21103049</td><td>Neural Basal Medium</td></tr><tr><td>MEM</td><td>Gibco, US</td><td>11140035</td><td>MEM non-essential amino acids solution (100x)</td></tr><tr><td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td><td>Lonza, Switzerland</td><td>#LT07-218</td><td>Mycoplasma detection kit; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Novus biologicals</td><td>NBP1-92717</td><td>Nestin mouse monoclonal antibody (4D11)</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>AppliChem</td><td>A3813, 0500</td><td>4% in PBS, store solution at -20 &amp;deg;C; caution: wear skin and eye protection and work under hood&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PBS tablets</td><td>Gibco, US</td><td>18912014</td><td>See manufacturer&amp;acute;s instructions; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL)</td><td>Gibco, US</td><td>15140122</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine solution (PLL)</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>P8920-100ML</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>pVim</td><td>MBL</td><td>D076-3S</td><td>Phospho-Vimentin (Ser55) mAb</td></tr><tr><td>Reagent A&amp;nbsp;</td><td>Stem cell technologies</td><td># 05872</td><td>Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer&amp;acute;s protocol; alternative products from muliple suppliers available</td></tr><tr><td>Reagent B&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>A6964-100ML</td><td>Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 &quot;enzymatic cell dissociation solution&amp;rdquo;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Research Cryostat Leica CM3050 S</td><td>Leica biosystems</td><td>CM3050 S</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Selleckchem.com</td><td>S1067</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Spinner flask 250 mL</td><td>IBS Integra Bioscience</td><td>182026</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>AppliChem</td><td>A4734, 1000</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Superfrost ultra plus microscope slides</td><td>Thermo scientific, US</td><td>J3800AMNZ</td><td>Slides should be labeled with a &quot;+&quot; and positively charged</td></tr><tr><td>Supplement 1</td><td>Gibco, US</td><td>17502048</td><td>N-2 supplement (100x)</td></tr><tr><td>Supplement 2 w/o Vitamin A</td><td>Gibco, US</td><td>12587010</td><td>B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura, NL</td><td>4565</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. compound</td><td>Sakura, NL</td><td>4583</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AppliChem</td><td>A1388,0500</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>TUJ1</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>T2200</td><td>&amp;beta;-Tubulin III (rabbit polyclonal)</td></tr><tr><td>TUNEL assay</td><td>Promega, US</td><td>G3250</td><td>DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Tween 20 for molecular biology</td><td>AppliChem</td><td>A4974,0500</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>waterproof sheet</td><td>BEMIS company, inc.</td><td>PM996</td><td>Parafilm &amp;ldquo;M&amp;rdquo;; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Y-27632&amp;nbsp;</td><td>Selleckchem.com</td><td>S1049</td><td>ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers</td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Gibco, US</td><td>31350010</td><td>2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers</td></tr></tbody></table>

generation of ipsc-derived human brain organoids to model early neurodevelopmental disorders

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that limits the translation of basic brain research into clinical application. While induced pluripotent stem cells (iPSCs) have replaced the ethically questionable human embryonic stem cells, iPSC-based neuronal differentiation studies remain descriptive at the cellular level but fail to adequately provide the details that could be derived from a complex, 3D human brain tissue. 
This gap is now filled through the application of iPSC-derived, 3D brain organoids, "Brains in a dish," that model many features of complex human brain development. Here, a method for generating iPSC-derived, 3D brain organoids is described. The organoids can help with modeling autosomal recessive primary microcephaly (MCPH), a rare human neurodevelopmental disorder. A widely accepted explanation for the brain malformation in MCPH is a depletion of the neural stem cell pool during the early stages of human brain development, a developmental defect that is difficult to recreate or prove in vitro. 
To study MCPH, we generated iPSCs from patient-derived fibroblasts carrying a mutation in the centrosomal protein CPAP. By analyzing the ventricular zone of microcephaly 3D brain organoids, we showed the premature differentiation of neural progenitors. These 3D brain organoids are a powerful in vitro system that will be instrumental in modeling congenital brain disorders induced by neurotoxic chemicals, neurotrophic viral infections, or inherited genetic mutations.

הדור של organoids המוח דורש לפחות שלושה שבועות של culturing רציפה (איור 1A). כדי להשיג תוצאות לשחזור, אנו ממליצים כי החוקר מתעד כל צעד, חשוב, ימנע שינויים כלשהם לגבי רכיבים בינוניים, בנקודות זמן, וטיפול תא. הנה, אנחנו נותנים תמצית כיצד להעריך אם אבני דרך קריטיות מתקבלות על מנת לקבל organoids באיכות מספקת בסוף הניסוי. היווצרות neurospheres בתוך צלחת 96-היטב צריכה להיות בבירור מיום 4. Neurospheres יכול להיות מוכר מוגדרים היטב בתחומים בתחתית כל טוב (האיור 1B, צעד 1). ביום 5, neurospheres צריך להיות ~ 500 מיקרומטר בקוטר מפגינים משטח חלק, עם שפה בהירה סביב מרכז כהה. ייתכן ואפשר יהיה כבר להתבונן stru הוארך שושנה דמוית עצבי<html> ctures בתוך החישוק בהיר זו (איור 1C, להתחיל של צעד 2). אם neurospheres להתפרק או להיראות יותר כמו אגרגטים התא, בידול אסור המשיך הלאה. לבסוף, organoids צריך להגדיל ולהציג גודל דומה במהלך תהליך הבידול צלוחיות טווה (1D איור, צעד 3). עיין בטבלת פתרון הבעיות (לוח 1) לקבלת מידע נוסף. איכות organoids יום-14 צריכה להיות מאומתת על ידי מיקרוסקופ אור. VZs מורכבים שכבות עבות של NPCs חיובית-nestin / תאי גליה רדיאלי עם צורה גרעינית מְשׂוֹכָה בצד הפסגה. מצד השני, הצליח קליפת המוח הפרימיטיבי יכיל נוירונים Tuj1 חיובי בשפע בצד הבסיסי, מובחנים במרחב מצד הפסגה (האיור 1E). חשוב לציין, הנוירונים Tuj1 חיובי אין לראות בצד הפסגה של VZ. הדק-page = &quot;1&quot;&gt; כדי לנתח את מטוס חלוקת תאי גליה רדיאלי פסגה (ARGS), אנחנו ממליצים להשתמש vimentin phospho (p-Vim) מכתים Arl13b. Arl13b תוויות הריסים העיקריים של ARGS הכמוס רירי לומן של VZ. לפיכך, באזור הריסים Arl13b החיובי משמש מדריך התמצאות לאתר ולנתח את מטוס חלוקת p-Vim חיובי ARGS ב anaphase. בדרך כלל, VZ של organoid מלא 14 ימים בת מציג מספר משמעותי של ARGS, אשר מטוסי חטיבה הם אופקי אורינטציה. מטוס חלוקה אופקי אורינטציה הוא חיוני להרחבה הסימטרית מוקדם של ARGS (איור 1F ו- G) 23,24. כאשר התרחבות ARG מספיק הוא הגיע, נוירוגנסיס מתחיל, התאים המתחלקים לשנות את הנטייה שלהם כלפי לומן, ומטוס חטיבת מתגים מ אופקי (סימטרי) אנכיים (אסימטרי) 4, 12, 24. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55372/55372fig1.jpg" /> איור 1: הדור של Organoids המוח מתאי שב&quot;ס האדם. (א) Workflow של פרוטוקול הבידול. שלב 1: התחל של בידול. בשלב זה, ההיווצרות של neurospheres מן iPSCs אדם צלחת 96-היטב מתרחשת. משך הזמן הוא 5 ימים. שלב 2: המטעת neurospheres בטיפות מטריקס EHS. תרבות השעיה נייחת של neurospheres-מוטבע מטריצת EHS יש משך זמן של 4 ימים. שלב 3: Organoids צלוחיות טווה. העברת neurospheres-מוטבע מטריצת EHS כדי Spinner צלוחיות מתרחשת. משך הזמן הוא 14 יום. (ב) neurosphere בתוך צלחת רבה היטב. תמונה מייצגת של neurosphere ביום 4 ב צלחת 96-היטב במהלך שלב 1 מוצג. התחום צריך להיות לעין בתחתית הבאר, עם משטח חלק, עגול (arro אדוםw). (ג) מורפולוגיה של neurospheres לפני EHS הטבעת מטריקס. Neurospheres שנאסף ביום 5 של שלב 1 צריך להיות אחיד בגודל ולהציג משטח חלק עם שפה בהירה (סוגר חץ). (ד) Organoids צלוחיות טווה. כד טווה עם organoids המוח במהלך שלב 3 (חצים אדומים) מוצג כאן. (E) הדמיה Immunofluorescent של organoids cryosectioned הצגת VZ טיפוסי הצלחת קליפת המוח הפרימיטיבי. הלוח השמאלי מציג את מכתים הגרעין של תאים על VZ. VZ משתרע מצד הפסגה (L לומן) לצד הבסיס (קו צהוב). שים לב תאים בתוך גרעיני מְשׂוֹכָה דמוי תצוגת VZ, מה שמראים כי הם תאי גליה רדיאלי. הפאנל הימני מראה את מכתים immunofluorescent של NPCs nestin חיובי (ירוק) בתוך VZ ונוירונים Tuj1 חיובי (מגנטה) ב הצלחת קליפת המוח הפרימיטיבי. בר סולם = 50 מיקרומטר. (F) הדמיה Immunofluorescent של organoids cryosectioned. שתי דוגמאותשל VZs מוכתם p-Vim ו Arl13b (I ו- III). האזורים המסומנים על ידי ריבועים לבנים מוגדלים בפינה הימנית עבור כל שיבוץ תמונה (ii ו- IV). מטוס חלוקת תאי גליה רדיאלי פסגת anaphase (ARGS). חלוקת תאי גליה רדיאלי פסגה בצד הפסגה של VZ היא p-Vim חיובי (מגנט). דוגמאות ARGS חלוקה סימטרית מוצגות (ריבועים לבנים ריבועים). מטוס החלוקה ניתן כקו לבן. מטוס חלוקת תא anaphase הוא אופקי לקו משטח לומן (קו מקווקו צהוב) והוא מסומן על ידי מכתים Arl13b (ירוק). בר סולם = 50 מיקרומטר. (G) סכמטי זה מספק הכיוון האנכי או האופקי של ARGS יחסית anaphase לומן. התאים המתחלקים של organoids המלא ביום 14 בעיקר מכוון אופקי (0-30 מעלות) ביחס לפני שטח לומן של VZ. צד הפסגה של לומן הוא בשורה של הריסים העיקריים של ARGS, אשר ציינו את שטח לומן של VZ (הקו ירוק). לעומת זאת, mosT של תאי גליה רדיאלי של organoids ממיקרוצפלוס- להציג בכיוון אנכי (60-90 מעלות) מטוס חלוק. הקו הלבן מציג את הציר של המטוס החלוק. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55372/55372fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> בְּעָיָה: </td><td> סיבות אפשריות: </td><td> הצעות: </td></tr><tr><td> שלב 1.1.1.2 </td><td rowspan="2"> יעילות ירודה של תכנות מחדש </td><td rowspan="2"> בדוק hiPSCs עבור סמני pluripotency: אם האיכות נמוכה, ידני לאסוף מושבות מובחנות עבור כמה קטעים להעשיר מושבות פלוריפוטנטיים </td></tr><tr><td> iPSCs האדם להבדיל לפני תחילת בידול </td></tr><tr><td></td><td> מתח בשל passaging או passagi מוקדםng כמו תאים בודדים </td><td> האם לא מעבר לפני 80% confluency מושגת. מעבר כמו אגרגטים, לא תאים בודדים </td></tr><tr><td></td><td> זיהום עם mycoplasma </td><td> מבחן עבור זיהום mycoplasma </td></tr><tr><td> שלב 2 </td><td> איכות ירודה של hiPSCs </td><td> שיפור איכות של hiPSCs (ראה לעיל) </td></tr><tr><td> Neurospheres אינו יוצר בכלל או להתפרק בכל יום 5 לאחר תחילת הבידול </td><td> המספר הראשון של תאים לכל גם הוא נמוך מדי או גבוה מדי </td><td> לחשב במדויק את מספר התאים ולהפיץ אותם באופן שווה בכל טוב </td></tr><tr><td></td><td> מדיום hiPSC שמש במקום מדיום בידול עצבי </td><td> השתמש בינוני בידול עצבי </td></tr><tr><td></td><td rowspan="2"> צעד צנטריפוגה היה קשה מדי או קל </td><td rowspan="2"> ספין הצלחת 96-היטב 500 XG במשך 3 דקות ולבדוק אם תאים שנצברו מרכזיים בביתבתחתית כל טוב </td></tr><tr><td></td></tr><tr><td></td><td> אין Y-27,632 לתחילת בידול </td><td> השתמשו Y-27,632 כדי לשפר את הישרדות התא </td></tr><tr><td></td><td> תאים מחוברים וגדלו בתחתית הצלחת </td><td> ודא כי צלחת V-bottom 96-היטב שאינו חסיד משמשת. </td></tr><tr><td> שלב 2 </td><td> אין שינוי מדיום יומי </td><td> שנה וחצי כמות יומית בינוני </td></tr><tr><td> Neurospheres אינו עשוי מקשה אחת בגודל </td><td rowspan="2"> החל מספר התאים בכל טוב היה לא שווה </td><td rowspan="2"> מערבבים את הצינור עם ההשעיה תא בודד בכל פעם לפני להוציא 100 ההשעיה תא μL </td></tr><tr><td></td></tr><tr><td></td><td> שינוי בינוני לא נעשה עבור כל טוב יומי </td><td> ודא שכל היטב מקבל שינוי המדיום יומי </td></tr><tr><td> שלב 2 </td><td> hiPSC לא היה מנותק into תאים בודדים לפני תחילת הבידול </td><td> בדוק תחת מיקרוסקופ אם hiPSC הם ניתקים תאים בודדים לאחר טיפול Accutase. אם יש עדיין אגרגטים, תאים פיפטה 10 פעמים למעלה ולמטה עם 100 micropipette μL ולבדוק שוב או לחזור Accutase טיפול </td></tr><tr><td> Neurospheres שאינו מציג שפה בהירה או משטח עגול; הם יוצרים ציסטות גדולות על פני השטח </td><td> החל מספר התאים בכל טוב היה גבוה מדי </td><td> לחשב במדויק את מספר התאים ולהפיץ אותם באופן שווה בכל טוב </td></tr><tr><td></td><td> שינוי בינוני לא נעשה יומי עבור כל טוב </td><td> שנה וחצי יומי בינוני </td></tr><tr><td> שלב 2.7 </td><td> איכות ירודה של hiPSCs </td><td> שיפור איכות של hiPSCs (ראה לעיל) </td></tr><tr><td rowspan="3"> neurospheres EHS מוטבע מטריצה ​​מקל גוש ביחד </td><td> לא מספיק בינוני (נפח) </td><td> לספקמינימום של המדיום 10 מ&quot;ל ב petridish 100 מ&quot;מ </td></tr><tr><td rowspan="2"> המדף של חממה אפילו לא </td><td> מניחים צלחת על משטח ישר </td></tr><tr><td> לאחר הצבת לתוך אינקובטור, להזיז את המנה כך neurospheres מופץ באופן שווה </td></tr></tbody></table> טבלה 1: שולחן פתרון בעיות.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders at JoVE.com

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described.

הדור של Organoids Human Brain iPSC הנגזרות למודל הפרעה נוירו-התפתחותית מוקדמת

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

generation-ipsc-derived-human-brain-organoids-to-model-early

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

19.6K Views.  University of Cologne. Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described. 

Video: Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. Efforts to study human cerebral cortex development have been limited by the availability of model systems. Translating results from rodent studies to the human system is restricted by species differences and studies on human primary tissues are hampered by a lack of tissue availability as well as ethical concerns. Recent development in human pluripotent stem cell (PSC) technology include the generation of three-dimensional (3D) self-organizing organotypic culture systems, which mimic to a certain extent human-specific brain development in vitro. Currently, various protocols are available for the generation of either whole brain or brain-region specific organoids. The method for the generation of homogeneous and reproducible forebrain-type organoids from induced PSC (iPSC), which we previously established and describe here, combines the intrinsic ability of PSC to self-organize with guided differentiation towards the anterior neuroectodermal lineage and matrix embedding to support the formation of a continuous neuroepithelium. More specifically, this protocol involves: (1) the generation of iPSC aggregates, including the conversion of iPSC colonies to a confluent monolayer culture; (2) the induction of anterior neuroectoderm; (3) the embedding of neuroectodermal aggregates in a matrix scaffold; (4) the generation of forebrain-type organoids from neuroectodermal aggregates; and (5) the fixation and validation of forebrain-type organoids. As such, this protocol provides an easily applicable system for the generation of standardized and reproducible iPSC-derived cortical tissue structures in vitro.

Cerebral organoids represent a new model system to investigate early human brain development in vitro. This article provides the detailed methodology to efficiently generate homogeneous dorsal forebrain-type organoids from human induced pluripotent stem cells including critical characterization and validation steps.

דור של Organoids מוחי סטנדרטית ו לשחזור הקדמי-סוג של האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a three-dimensional system. Here we present a relatively straightforward and inexpensive method that yields brain organoids. In this protocol human pluripotent stem cells are broken into small clusters instead of single cells and grown in basic media without a heterologous basement membrane matrix or exogenous growth factors, allowing the intrinsic developmental cues to shape the organoid&#39;s growth. This simple system produces a diversity of brain cell types including glial and microglial cells, stem cells, and neurons of the forebrain, midbrain, and hindbrain. Organoids generated from this protocol also display hallmarks of appropriate temporal and spatial organization demonstrated by brightfield images, histology, immunofluorescence and real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). Because these organoids contain cell types from various parts of the brain, they can be utilized for studying a multitude of diseases. For example, in a recent paper we demonstrated the use of organoids generated from this protocol for studying the effects of hypoxia on the human brain. This approach can be used to investigate an array of otherwise difficult to study conditions such as neurodevelopmental handicaps, genetic disorders, and neurologic diseases.

This protocol was generated as a means to produce brain organoids in a simplified, low cost manner without exogenous growth factors or basement membrane matrix while still maintaining the diversity of brain cell types and many features of cellular organization.

שיטת בימוי עצמי סטטי ליצירת אורגנואידים המוח מתאי גזע האדם העובריים

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

2D and 3D Human Induced Pluripotent Stem Cell-Based Models to Dissect Primary Cilium Involvement during Neocortical Development

Primary cilia (PC) are non-motile dynamic microtubule-based organelles that protrude from the surface of most mammalian cells. They emerge from the older centriole during the G1/G0 phase of the cell cycle, while they disassemble as the cells re-enter the cell cycle at the G2/M phase boundary. They function as signal hubs, by detecting and transducing extracellular signals crucial for many cell processes. Similar to most cell types, all neocortical neural stem and progenitor cells (NSPCs) have been shown harboring a PC allowing them to sense and transduce specific signals required for the normal cerebral cortical development. Here, we provide detailed protocols to generate and characterize two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cell-based models from human induced pluripotent stem cells (hIPSCs) to further dissect the involvement of PC during neocortical development. In particular, we present protocols to study the PC biogenesis and function in 2D neural rosette-derived NSPCs including the transduction of the Sonic Hedgehog (SHH) pathway. To take advantage of the three-dimensional (3D) organization of cerebral organoids, we describe a simple method for 3D imaging of in toto immunostained cerebral organoids. After optical clearing, rapid acquisition of entire organoids allows detection of both centrosomes and PC on neocortical progenitors and neurons of the whole organoid. Finally, we detail the procedure for immunostaining and clearing of thick free-floating organoid sections preserving a significant degree of 3D spatial information and allowing for the high-resolution acquisition required for the detailed qualitative and quantitative analysis of PC biogenesis and function.

We present detailed protocols for the generation and characterization of 2D and 3D human induced pluripotent stem cell (hIPSC)-based models of neocortical development as well as complementary methodologies enabling qualitative and quantitative analysis of primary cilium (PC) biogenesis and function.

מודלים מבוססי תאי גזע פלוריפוטנטיים דו-ממדיים ותלת-ממדיים אנושיים לניתוח מעורבות סיליום ראשוני במהלך התפתחות ניאוקורטיקלית

Primary cilia (PC) are non-motile dynamic microtubule-based organelles that protrude from the surface of most mammalian cells. They emerge from the older ...

Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology has emerged recently. It is still in its infancy and has some limitations unsolved yet. The current protocols do not allow obtaining organoids to be consistent enough for drug discovery and preclinical studies. The maturation of organoids can take up to a year, pushing the researchers to launch multiple differentiation processes simultaneously. It imposes additional costs for the laboratory in terms of space and equipment. In addition, brain organoids often have a necrotic zone in the center, which suffers from nutrient and oxygen deficiency. Hence, most current protocols use a circulating system for culture medium to improve nutrition.
Meanwhile, there are no inexpensive dynamic systems or bioreactors for organoid cultivation. This paper describes a protocol for producing brain organoids in compact and inexpensive home-made mini bioreactors. This protocol allows obtaining high quality organoids in large quantities.

Here we describe a protocol for generating brain organoids from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). To obtain brain organoids in large quantities and of high quality, we use home-made mini bioreactors.

דור אורגנויד במוח מתאי גזע פלוריפוטנטים מושרים במיני ביו-רהקטורים תוצרת בית

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology ...

שינוי גנטי של אורגנואידים מוחיים פרימטים

Targeted Microinjection and Electroporation of Primate Cerebral Organoids for Genetic Modification

The cerebral cortex is the outermost brain structure and is responsible for the processing of sensory input and motor output; it is seen as the seat of higher-order cognitive abilities in mammals, in particular, primates. Studying gene functions in primate brains is challenging due to technical and ethical reasons, but the establishment of the brain organoid technology has enabled the study of brain development in traditional primate models (e.g., rhesus macaque and common marmoset), as well as in previously experimentally inaccessible primate species (e.g., great apes), in an ethically justifiable and less technically demanding system. Moreover, human brain organoids allow the advanced investigation of neurodevelopmental and neurological disorders.
As brain organoids recapitulate many processes of brain development, they also represent a powerful tool to identify differences in, and to functionally compare, the genetic determinants underlying the brain development of various species in an evolutionary context. A great advantage of using organoids is the possibility to introduce genetic modifications, which permits the testing of gene functions. However, the introduction of such modifications is laborious and expensive. This paper describes a fast and cost-efficient approach to genetically modify cell populations within the ventricle-like structures of primate cerebral organoids, a subtype of brain organoids. This method combines a modified protocol for the reliable generation of cerebral organoids from human-, chimpanzee-, rhesus macaque-, and common marmoset-derived induced pluripotent stem cells (iPSCs) with a microinjection and electroporation approach. This provides an effective tool for the study of neurodevelopmental and evolutionary processes that can also be applied for disease modeling.

מחבר זרקור: מיקרו-הזרקה ממוקדת ואלקטרופורציה של אורגנואידים מוחיים פרימטים לשינוי גנטי  

The electroporation of primate cerebral organoids provides a precise and efficient approach to introduce transient genetic modification(s) into different progenitor types and neurons in a model system close to primate (patho)physiological neocortex development. This allows the study of neurodevelopmental and evolutionary processes and can also be applied for disease modeling.

מיקרו-הזרקה ממוקדת ואלקטרופורציה של אורגנואידים מוחיים פרימטים לשינוי גנטי

The cerebral cortex is the outermost brain structure and is responsible for the processing of sensory input and motor output; it is seen as the seat of ...

Generation of 3D Midbrain Organoids from Human-Induced Pluripotent Stem Cells

The development of midbrain organoids (MOs) from human pluripotent stem cells (hPSCs) represents a significant advancement in understanding brain development, facilitating precise disease modeling, and advancing therapeutic research. This protocol outlines a method for generating midbrain-specific organoids using induced pluripotent stem cells (iPSCs), employing a strategic differentiation approach. Key techniques include dual-SMAD inhibition to suppress SMAD signaling, administration of fibroblast growth factor 8b (FGF-8b), and activation of the Sonic Hedgehog pathway using the agonist purmorphamine, guiding iPSCs towards a midbrain fate.
The organoids produced by this method achieve diameters up to 2 mm and incorporate a diverse array of neuroepithelial cell types, reflecting the midbrain&#39;s inherent cellular diversity. Validation of these organoids as authentic midbrain structures involves the expression of midbrain-specific markers, confirming their identity. A notable outcome of this methodology is the effective differentiation of iPSCs into dopaminergic neurons, which are characteristic of the midbrain.
The significance of this protocol lies in its ability to produce functionally mature, midbrain-specific organoids that closely replicate essential aspects of the midbrain, offering a valuable model for in-depth exploration of midbrain developmental processes and the pathophysiology of related disorders such as Parkinson&#39;s disease. Thus, this protocol serves as a crucial resource for researchers seeking to enhance our understanding of the human brain and develop new treatments for neurodegenerative diseases, making it an indispensable tool in the field of neurological research.

This protocol describes a novel method for creating 3D midbrain organoids from human induced pluripotent stem cells, guiding their formation to mimic native midbrain tissue, thereby aiding in the study of development and disorders.

יצירת אורגנואידים תלת מימדיים של המוח התיכון מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

The development of midbrain organoids (MOs) from human pluripotent stem cells (hPSCs) represents a significant advancement in understanding brain ...

<meta charset="utf8"></head><body>יצירת אורגנואידים במוח האנושי עם מיקרוגליה מקומית באמצעות HPCs שמקורם ב-iPSC

Derivation of a Human Brain Organoid with Microglia Development

Three-dimensional (3D) brain organoid cultures derived from induced pluripotent stem cells (iPSC) provide an important alternative in vitro tool&#160;for studying human brain development and pathogenesis of neurological diseases. However, the lack of incorporation of microglia in the human brain organoids is still a major hurdle for 3D models of neuroinflammation. Current approaches include either the incorporation of fully differentiated microglia into mature brain organoids or the induction of microglial differentiation from the early stage of iPSC-derived embryoid bodies (EBs). The first approach misses the stage when microglial differentiation interacts with the adjacent neural environment, and the later approach is technically challenging, resulting in inconsistency among the final organoids in terms of the quantity and quality of microglia. To model brain organoids with microglia to study the early interactions between microglial and neuronal development, highly pure hematopoietic progenitor cells (HPC) differentiated from human iPSCs were incorporated&#160;into iPSC-derived EBs to make brain organoids. Using immunostaining and single-cell RNA sequencing (sc-RNA-seq) analysis, we confirmed that HPCs were incorporated into the 3D organoids, which eventually developed into brain organoids with both microglia and neurons. Compared to brain organoids without HPCs, this approach produces significant microglial incorporation in the brain organoids. This novel 3D organoid model, which consists of both microglial and neural development properties, can be used to study the early interactions between innate immune and nervous system development and potentially as a model for neuroinflammation and neuroinfectious disorders.

<meta charset="utf8"></head><body>גזירה של אורגנואיד מוח אנושי עם התפתחות מיקרוגליה

We present a protocol to generate a human brain organoid with resident microglia by incorporating Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived hematopoietic progenitor cells (HPCs) into organoid development.

גזירה של אורגנואיד מוח אנושי עם התפתחות מיקרוגליה

Three-dimensional (3D) brain organoid cultures derived from induced pluripotent stem cells (iPSC) provide an important alternative in vitro tool&#160;for ...

הדור של Organoids Human Brain iPSC הנגזרות למודל הפרעה נוירו-התפתחותית מוקדמת

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

דור של Organoids מוחי סטנדרטית ו לשחזור הקדמי-סוג של האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

שיטת בימוי עצמי סטטי ליצירת אורגנואידים המוח מתאי גזע האדם העובריים

מודלים מבוססי תאי גזע פלוריפוטנטיים דו-ממדיים ותלת-ממדיים אנושיים לניתוח מעורבות סיליום ראשוני במהלך התפתחות ניאוקורטיקלית

דור אורגנויד במוח מתאי גזע פלוריפוטנטים מושרים במיני ביו-רהקטורים תוצרת בית

מיקרו-הזרקה ממוקדת ואלקטרופורציה של אורגנואידים מוחיים פרימטים לשינוי גנטי

מיקרו-הזרקה ממוקדת ואלקטרופורציה של אורגנואידים מוחיים פרימטים לשינוי גנטי

מיקרו-הזרקה ממוקדת ואלקטרופורציה של אורגנואידים מוחיים פרימטים לשינוי גנטי

יצירת אורגנואידים תלת מימדיים של המוח התיכון מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

גזירה של אורגנואיד מוח אנושי עם התפתחות מיקרוגליה

גזירה של אורגנואיד מוח אנושי עם התפתחות מיקרוגליה