Unterstützt durch die NIH / NIDA DA034783. Wir danken Bryan A. Killinger für technische Unterstützung bei der Multimer-PAGE.

1. Gewebepräparation <ol><li> Herstellung von 10 ml der 4-fach BN-PAGE-Probenpuffer (200 mM Bis (2-hydroxyethyl) amino-tris (hydroxymethyl) methan (Bis-Tris), 200 mM NaCl, 40% w / v Glycerin, 0,004% Ponceau S, pH 7,2 ). HINWEIS: Diese Stammlösung im Voraus und bei 4 ° C durchgeführt werden kann. </li><li> Verdünnte 250 ul 4x Probenpuffer in 750 &amp; mgr; l dH 2 O , enthaltend 1x kommerziellen Protease - Inhibitor - Cocktail. Vortex und Chill auf Eis. </li><li> Homogenisiert 20 mg des Zielgewebes in den 1 ml 1x eiskalten BN-PAGE-Probenpuffern mit 30 Schlägen eines Dounce-Homogenisators sauber. HINWEIS: Für dieses Demonstrationsexperiment, das Zielgewebe ganze Rattenhirngewebe. Nach der Homogenisierung Proben werden mit einem milden Reinigungsmittel, wie beispielsweise 2% Digitonin zu solubilisieren und erlauben Elektrophorese von Membranproteinen behandelt. </li><li> Überträgt das Homogenisat in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugiert bei 14.000 xg für 30 min unlöslichen Zellinhalt zu pelletieren. after Zentrifugieren dekantiert den Überstand in ein sauberes Röhrchen auf Eis. </li><li> Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers überstehende Flüssigkeit Proteinkonzentration unter Verwendung von Bicinchoninsäure (BCA) oder ähnlichen Proteinquantifizierung Assay zu messen. </li><li> Wenn das Homogenat Probe (n) Reinigungsmittel enthält, eine Menge von 5% Coomassie Blue G-250 in wässriger Lösung hinzu ausreichen, um die Lösung Homogenat Coomassie bis 0,25% zu bringen. </li></ol> 2. BN-PAGE <ol><li> Verdünne 25 ml 20x blau nativen (BN) Elektrophoresepuffer Lager (1,0 M Bis-Tris, 1,0 M Tricin, pH 6,8) in 475 ml dH 2 O 0,002% Coomassie - Blau , das 500 ml 1x Laufpuffer zu machen. <ol><li> Wenn Proben Reinigungsmittel enthalten, stellen stattdessen 250 ml 1x Laufpuffer, enthaltend 0,02% Coomassie und weitere 250 ml enthielt keine. </li></ol></li><li> Chill-Puffer (n) auf 4 ° C. </li><li> Reinigen und montieren ein Polyacrylamidgel Ausgießen Kassette nach Herstelleranweisungen. </li><li&gt; BN Polyacrylamidgel (3% T Stapelschicht, 6% T Auflösungsschicht) Gießen nach einem Standardrezept 7 und legen den gut Kamm. </li><li> Nachdem die Gele polymerisiert haben, spülen Sie die Elektrophoresevorrichtung gemäß Herstelleranweisungen , um die Kassette mit dH 2 O und zusammenzubauen. </li><li> Entfernen Sie die gut Kamm und füllen die Vertiefungen mit 1x BN-PAGE - Laufpuffer. Vermeiden die gesamte Innenkammer mit Puffer füllt , bis Proben geladen werden. <ol><li> Wenn Proben Waschmittel enthalten, füllen die Vertiefungen mit dem Puffer 0,02% Coomassie-Blau enthält. HINWEIS: Führen Sie die Schritte 2,7-2,9 bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Verwendung von Gel-Ladespitzen, eine Pipette mit einem Volumen von Homogenisats, das 20 ug Protein in die gewünschten Vertiefungen. Pipette ein äquivalentes Volumen von 1x BN-PAGE-Probenpuffer, in einem nicht genutzten Vertiefungen. HINWEIS: Die Proteinkonzentration aus dem BCA-Test bestimmt das geeignete Volumen des Homogenats berechnen hinzuzufügenDie Brunnen. </li><li> Nachdem die Proben geladen sind, füllen Sie die innere Kammer mit 1x BN-PAGE-Laufpuffer. Seien Sie sicher, dass das Gel vollständig in Puffer untergetaucht ist. Als nächstes füllen Sie die Außenkammer mit 1x Laufpuffer auf das vom Hersteller angegebene Niveau. <ol><li> Wenn Proben Waschmittel enthalten, füllen Sie die innere Kammer mit dem 1x Puffer, der 0,02% Coomassie Blue enthält, und die äußere Kammer mit farbstofffreiem 1x Laufpuffer. </li></ol></li><li> Verbinden Sie die Elektroden mit der Stromversorgung und elektrophorieren Sie die Proteine ​​im Gel bei 150 V, bis das Farbstoffband ~ 2 cm in die Auflösungsschicht fortschreitet. Stoppen und trennen Sie die Stromversorgung. </li></ol> 3. Vernetzung HINWEIS: Die Schritte 3.1-3.6 bei 4 ° C durchführen. <ol><li> Demontieren Sie den Elektrophoreseapparat und trennen Sie die Glasscheiben der Gelkassette. Entfernen und entsorgen Sie die Stapelschicht. </li><li> Sorgfältig das Gel kurz unterhalb der Unterkante der Farbstofffront schneiden. NehmenPflege dieses Schnitt so glatt und gerade wie möglich zu machen, und dann die nicht verwendete Gelstück verwerfen. Dies wird einen ~ 2 cm breite, horizontale Streifen aus Polyacrylamidgel, läßt die alle das Protein in der Probe Homogenat enthalten. </li><li> Wegschneiden alle nicht verwendeten Teile entlang der Kanten des Gelstreifens. </li><li> Legen Sie das Band in 10 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) in einem kleinen Behälter, und sanft durch Nutation mischte für 30 Minuten äquilibrieren. </li><li> Nach der Äquilibrierung verwerfen und das PBS mit weiteren 10 mL ersetzen. Pipette 500 ul 25 mM DSP in Dimethylsulfoxid in das PBS gelöst und weiter wie oben (Schritt 3.4) für 30 min gemischt wurde. </li><li> Gießen Sie die DSP-Lösung ab. 10 ml 0,375 M Tris (hydroxymethyl) aminomethanhydrochlorid (Tris-HCl), pH 8,8, enthaltend 2% Natriumdodecylsulfat (SDS), um das nicht umgesetzte DSP quenchen. Weiter Nutation für 15 min. </li></ol> 4. SDS-PAGE <ol><li> Während Gelstreifen wird Abschrecken herzustellen SDS-PAGE Gellösungen nach Standardmethoden 9. Nicht Polymerisationsreagentien hinzuzufügen. </li><li> Nach dem Abschrecken auf Raumtemperatur zurückkehren die ΒΝ Gelstreifen, und der Streifen in eine neue Gelkassette gegossen. <ol><li> Um dies zu tun, nehmen Sie vorsichtig das Gel und legen Sie sie auf eine saubere Gelkassette Distanzplatte. </li><li> Orient der Streifen , so dass die Unterseite der Farbstofffront ist am nächsten an der Spitze der neuen Kassette (dh die Seite, die am weitesten in BN-PAGE gereist sollte auf der Oberseite der neuen Kassette am nächsten ist, der Gelstreifen aus seiner vorherigen umgedreht werden soll Orientierung). Siehe Abbildung 3. </li><li> Platzieren Sie den Streifen so , dass seine Oberkante liegt auch bei denen die Oberkante der Abdeckplatte wird ( das heißt, es wird an der Oberseite des neuen Gel sein). Sicherstellen, dass die Farbstofffront parallel zu den horizontalen Kanten der Glasplatte. </li><li> Schieben einer Seite des ausgeschnittenen Streifens gegen einen der Abstandshalterwände, so dass Raum für ter andere Seite für Gel gegossen werden und ein Protein-Standard oder Leiter geladen werden. </li><li> Wenn die Unterkante des Gelstreifens irgendwelche gezackten oder unebene Bereiche enthält, schneiden sie sorgfältig entfernt. Falls vorhanden, werden diese Blasen während trap Gelgießlösung. </li><li> Sobald die Gelstreifen korrekt positioniert ist, legte die Abdeckplatte über die Distanzplatte. Drücken Sie vorsichtig heraus drücken alle eingeschlossenen Luftblasen. </li><li> Weiterhin die gel-Gießvorrichtung nach Herstelleranleitung montieren. </li></ol></li><li> Hinzufügen Polymerisation Reagenzien zu dem Trenngel-Puffer und gießt es in die vorbereitete Gelkassette eine serologische Pipette. Füllen Sie das Gelkassette auf ~ 2 cm unterhalb der ausgeschnittenen BN-PAGE Gelstreifen, Raum für die Stapelung Schicht zu verlassen. </li><li> Füge 100 &amp; mgr; l Butanol über die oberen Rand des Gels gegossen, und ermöglicht es 30 Minuten zur Polymerisation des Auflösungsschicht. Gießen Sie das Butanol aus. </li><li> In Polymerisationsreagentien zur Stapel Gel - Lösung. Mit einem serologische Pipette, gieße die Stapelschicht alle verbleibenden Leerraum in der Gelkassette zu füllen. <ol><li> Neigen die Gelkassette als die Stapelschicht gegossen wird, so dass er den Raum unterhalb des Gelstreifens füllt, und Luftblasen werden nicht aufgefangen. </li><li> Da die Stapelung Gelpuffer den leeren Raum unter dem Gelstreifen füllt, kehrt allmählich die Gelkassette auf Augenhöhe. </li><li> neben dem exzidierten Gelstreifen mit dem Stapel Gelpuffer, bis es fast überläuft weiterhin den leeren Raum zu füllen. </li></ol></li><li> Ermöglicht die Stapelschicht für 30 Minuten zu polymerisieren. HINWEIS: Stellen 10x SDS-PAGE-Laufpuffer (250 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethan (Tris), 1,9 M Glycin, 1% SDS), während das Gel polymerisiert. Dies kann auch im Vorfeld und bei Raumtemperatur gelagert gemacht werden. </li><li> Verdünne 50 mL 10X - SDS-PAGE - Laufpuffer Lager in 450 ml dH 2 O 1x Arbeitspuffer zu machen. </li><li> Nachdem die Stapelschicht polymerisiert ist, entfernen Sie die Gelkassette von strömendemVorrichtung, Spülen mit dH 2 O, und montiert die Elektrophoresevorrichtung nach Herstelleranweisungen. </li><li> Füllen der inneren Kammer vollständig mit 1x SDS-PAGE-Laufpuffer, dann die Außenkammer durch den Hersteller angegeben auf das Niveau füllen. </li><li> Laden den Raum neben dem exzidierten Gelstreifen mit einem Molekulargewicht Leiter oder geeigneten Proteinstandard. </li><li> Befestigen der Elektroden an die Stromversorgung, und Elektrophorese der Proben bei 120 V. Wenn der Farbstoff Coomassie das Gel abläuft, stoppen und die Stromversorgung trennen. </li><li> Analysieren des Gels unter Verwendung von Standardverfahren des Elektroblotting und Proteindetektion durch Antikörperbindung 10. </li></ol>

<ol>
	<li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+as+a+collection+of+protein+machines:+preparing+the+next+generation+of+molecular+biologists.">The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists.</a> Cell. 92 (3), 291-294 (1998).</li><li>Pawson, T., Nash, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+define+specificity+in+signal+transduction.">Protein-protein interactions define specificity in signal transduction.</a> Genes Dev. 14 (9), 1027-1047 (2000).</li><li>Rual, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+proteome-scale+map+of+the+human+protein-protein+interaction+network.">Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network.</a> Nature. 437 (7062), 1173-1178 (2005).</li><li>Phizicky, E. M., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions:+methods+for+detection+and+analysis.">Protein-protein interactions: methods for detection and analysis.</a> Microbiol Rev. 59 (1), 94-123 (1995).</li><li>Ho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+protein+complexes+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+mass+spectrometry.">Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry.</a> Nature. 415 (6868), 180-183 (2002).</li><li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).</li><li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+PAGE.">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li><li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Beisiegel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Blotting.">Protein Blotting.</a> Electrophoresis. 7 (1), 1-18 (1986).</li><li>Killinger, B. A., Moszczynska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+alpha-Synuclein+Multimer+Stoichiometry+in+Complex+Biological+Samples+by+Electrophoresis.">Characterization of alpha-Synuclein Multimer Stoichiometry in Complex Biological Samples by Electrophoresis.</a> Anal Chem. 88 (7), 4071-4084 (2016).</li><li>Newman, A. J., Selkoe, D., Dettmer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+quantitative+immunoblotting+of+endogenous+alpha-synuclein.">A new method for quantitative immunoblotting of endogenous alpha-synuclein.</a> PLoS One. 8 (11), e81314 (2013).</li><li>Wong, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemistry of protein conjugation and cross-linking. , (1991).</li><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li><li>Tanford, C., Reynolds, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+membrane+proteins+in+detergent+solutions.">Characterization of membrane proteins in detergent solutions.</a> Biochim Biophys Acta. 457 (2), 133-170 (1976).</li><li>Peters, K., Richards, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+cross-linking:+reagents+and+problems+in+studies+of+membrane+structure.">Chemical cross-linking: reagents and problems in studies of membrane structure.</a> Annu Rev Biochem. 46, 523-551 (1977).</li><li>Lomant, A. J., Fairbanks, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+probes+of+extended+biological+structures:+synthesis+and+properties+of+the+cleavable+protein+cross-linking+reagent+[35S]dithiobis(succinimidyl+propionate).">Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate).</a> J Mol Biol. 104 (1), 243-261 (1976).</li><li>Sun, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+mitochondrial+respiratory+membrane+protein+complex+II.">Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein complex II.</a> Cell. 121 (7), 1043-1057 (2005).</li><li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions.">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Protein-Protein-Wechselwirkungen sind wichtig für jede Aufgabe Lebewesen auszuführen. Aus diesem Grunde sind sie Gegenstand intensiver Prüfung und Forschung. Multimer-PAGE ist ein neues Verfahren für die Erfassung, trennt, und eine Vielzahl von Proteinkomplexen zu analysieren. Wir haben bereits gezeigt , seine Anwendbarkeit oligimerization des krankheitsassoziierten Protein α-Synuclein 11 bis zu studieren. Jedoch ist es dehnbar zu vielen Proteinkomplexen, wie in Abbildung 2 gezeigt. Im Vergleich zu anderen Methoden der Proteinkomplexe zu studieren, Multimer-PAGE ist wegen seiner Einfachheit und Kürze vorteilhaft. Die Zeit von der Gewebeprobe vollständig getrennt SDS Gel etwa 8 h ist. Da Erkennung von typischem Western-Blot durchgeführt werden kann, kann das Protokoll auf unmodifizierten Gewebelysat durchgeführt werden, mit Nachweisgrenzen viel niedriger als die mit Pull-Down-Experimenten verbunden. Zusätzlich sind die meisten gut ausgestattete Molekularbiologie Laboratories in der Lage, die Technik mit wenig Vorab-Investition durchzuführen. Wie später diskutiert wird, kommt die größte Teil der Herausforderung mit Multimer-PAGE im Zusammenhang mit der Fehlersuche und das Verfahren für jeden Protein-Komplex untersucht zu optimieren. Während Multimer-PAGE zu dem meisten Molekularbiologen zugänglich sein soll, ist ihr Erfolg auf den Forscher Geschick und Erfahrung abhängig. Kritisch muss das Schneiden und Wieder Gießen des BN Gelstreifen in das neue SDS-Gel mit Vorsicht durchgeführt werden. Es ist wichtig, die Gelstreifen zu orientieren, so daß die Elektrophorese verursacht Proteine ​​in SDS-Gel in parallelen Bänder zu migrieren. Wenn der Gelstreifen krummen gegossen wird, werden die Proteinbanden in einer anderen migrieren und Daten gehen verloren. Speziell für große Komplexe, Drehen der Gelstreifen bevor es in das SDS-PAGE-Gel Gießen ist ähnlich wichtig. Dies ergibt größere Komplexe, die in das BN-PAGE-Gel, mehr Zeit gezogen werden in die Lösung Laye können nicht sehr weit gewandert sindr des SDS-PAGE-Gels. Wichtig ist, verursacht die Änderungen an Proteingröße und physikalischen Eigenschaften durch Vernetzung sollte auch während der Analyse berücksichtigt werden. Zum Beispiel sind einige niedermolekulare Proteine, wie α-Synuclein, sind nicht gut auf PVDF Membranen zurückgehalten, aber ihre vernetzte Oligomere sind 12. Dies kann eine vergleichende Analyse durcheinander bringen und müssen berücksichtigt werden. Wenn ein Komplex von Multimer-PAGE zum ersten Mal zu trennen, ist es wichtig, das Verfahren zu validieren. Wir schlagen vor, drei Validierung / Fehlerbehebung Tests. Zunächst sicher, dass das Peptid von Interesse in das BN-Gel wandert durch Befolgen des Multimer-PAGE-Protokolls, bis Exzision des Gelstreifens, dann stoppen, wobei die Streifen auf einem PVDF-Membran blot und für die Untereinheit von Interesse untersuchen. Wenn kein Signal vorhanden ist, wahrscheinlich der Komplex migrierte nicht in das BN-Gel, das heißt, es sollte mehr porös gemacht werden, oder die Probe sollte weiter in die resolv wandern gelassen werdening Schicht. Vorhandensein eines Signals wird bestätigt, dass mindestens ungebundene Untereinheit in das Gel migriert. Zu diesem Zeitpunkt wird es schwierig sein, das Vorhandensein des vollständigen Komplexes zu bestätigen. Wenn der Nachweis der Untereinheit in dem BN-Gelstreifen detektiert wird, bewegen sich auf den zweiten Test auf. Führen Multimer-PAGE ohne Vernetzungsschritt, dann auf eine PVDF-Blot-Membran und der Sonde für die Untereinheit. Die Untereinheit sollte in Gegenwart von SDS und wandert normalerweise in das SDS-Gel denaturiert. Wenn dies nicht der Fall, gibt es wahrscheinlich ein Problem mit der Technik des Forschers. Die BN Gelstreifen wurden möglicherweise schlecht geschnitten, hinter einem Protein zu verlassen, oder das SDS-Gel falsch gegossen wurde. Schließlich führt Multimer-PAGE mit einem eingeschlossenen Vernetzers Spaltungsschritt, dann Blot und Sonde, wie in 1 diskutiert. Dies bestätigt die Aggregation des Komplexes Zugabe von DSP zurückzuführen ist, und nicht eine unerwartete Konsequenz aus einem anderen Teil des Multimers-PAGE-Protokolls. Die Spaltung sollte in einer Folge reduzierend-intensity Aggregat Band und eine erhöhte Intensität -Untereinheit Monomerbande Bei der Bilderzeugung. Wenn kein Aggregat Band aus normaler Multimer-PAGE zu sehen ist, aber die Monomerbande an Intensität zunimmt, wenn DSP abgespalten wird, hat der Komplex wahrscheinlich, es zu dem SDS-Gel hergestellt, aber nicht in die Auflösungsschicht zu migrieren. In ihrem gegenwärtigen Zustand ist Multimer-PAGE auf viele Proteinkomplexe anwendbar, ist aber nicht ein one-size-fits-all-Protokoll. Es muss wahrscheinlich für jeden Komplex von Interesse modifiziert werden. Ein häufiges Problem ist in Abbildung 2 gezeigt: Erfasst-Komplexe sind oft so groß, dass sie kaum auf SDS-PAGE wandern. Dies kann durch Änderung der Porosität des SDS-Gel-Elektrophorese oder Durchführung für längere Zeiträume verwaltet werden. Eine zusätzliche Komplikation ist die gelegentliche Anwesenheit von mehr als zwei Banden auf dem Gel. Unvollständige Reaktion mit dem Vernetzer kann in einer Verteilung von mittlerem Molekulargewicht Bänder 13 führen. Dies kann es difrig, um zu bestimmen, ob mehrere Bänder von physiologisch wichtigen oligomere Zwischenprodukte repräsentativ sind, oder einfach unbeabsichtigten Folgen von Teilvernetzung. Für Membranproteine, die vor der Analyse in Lösung gebracht werden müssen, ist es auch wichtig, um die Auswirkungen zu berücksichtigen, dass die Wahl des Waschmittels auf dem Verhalten von Proteinkomplex aufweist. Das verwendete Detergens - Membranproteine solubilisieren wirkt sich auf ihre Konformationen, Verbände mit Bindungspartnern, und Funktionen 14, 15. Waschmittel Wahl hat auch Auswirkungen auf die Wirksamkeit von 16 Vernetzungs. Somit ist es wahrscheinlich, dass die idealen Bedingungen lösungsvermittelnde mit dem Komplex untersucht variiert werden. Multimer-PAGE nicht gelegentlich einen Komplex zu erfassen, wie es auf dem SDHA blot in Figur 2 Succinate-Dehydrogenase gezeigt wird, ist ein Teil der 124 kDa mitochondrialen Complex II, die klein genug ist, dass sie leicht in das Gel bewegen sollen.Dass es nicht erkannt wurde zeigt, dass Multimer-PAGE war nicht in der Lage, es zu erfassen. Fälle wie diese haben viele mögliche Erklärungen. Die meisten Vernetzungsreagenzien enthalten zwei reaktive Enden, die mit Aminosäure-Seitenketten kovalente Bindungen bilden. Die Effizienz, mit der Vernetzungsreagenzien capture Proteinkomplexe sind abhängig von ihrer Zugänglichkeit zu reaktiven Resten. Im Fall der DSP der Vernetzung wird durch Acylierung von Lösungsmitteln-exponierten primären und sekundären aliphatischen Aminogruppen erreicht, in der Regel der ε-Aminogruppen von Lysin 17. Lysin - Reste werden in der Regel auf der Proteinoberfläche gefunden, aber ihre gelegentliche Sequestrierung in hydrophoben Zentren verringert die Effizienz der Vernetzungs 13. Die Untereinheiten des Komplexes II sind in der mitochondrialen Membran begraben und kann auf DSP, auch nach der Solubilisierung mit Digitonin 18 unzugänglich bleiben. Sehr große und dichten Verpackungskomplexe wie Amyloid oligomers, kann auch die Verfügbarkeit von Oberflächenlysinresten an Vernetzungsreagenzien begrenzen. Als Ergebnis können diese Arten von Protein-Baugruppen nicht mit Multimer-PAGE kompatibel sein. Es ist auch möglich , dass Coomassie Blau, die an hydrophobe Bereiche und kationischen Reste verbindet, in PBS blockiert und Vernetzung in einigen Fällen nach der Äquilibrierung 19 verweilt. Dies könnte den Nachweis von Oligomeren beeinflußt durch Multimer-PAGE verringern oder beseitigen. Somit ist das Verfahren nicht ein universelles Assay für alle Protein-Assoziationen Charakterisieren und soll nicht in Betracht gezogen werden, wo die Quantifizierung in erwünscht. Jedoch ist Multimer-PAGE ein kostengünstigen, relativ schnellen Werkzeugproteinkomplexe für die Analyse und kann neben anderen Mitteln festgelegt betrachtet werden.

<html> Normale zelluläre Funktion ist abhängig von Protein-Protein - Wechselwirkungen 1, 2. Als Ergebnis werden menschliche Krankheiten , die oft durch Störungen in der Montage und Verhalten verschiedenen Proteinkomplexe 3 markiert. Die Fähigkeit, solche Interaktionen zu charakterisieren, ist daher von entscheidender Bedeutung. Aktuelle Mittel, um diese Wechselwirkungen zur Detektion erfordern Reinigung von Zielproteinen, die oft durch Pull-Down ihrer Interaktionspartner gefolgt. Herkömmliche Reinigung wird durch differentielle Zentrifugation, Präzipitation durchgeführt, und / oder Chromatographie 4. Diese Verfahren sind zeitaufwendig, muss für jedes Zielprotein verändert werden, und führen oft zu geringen Ausbeuten. Moderne Reinigungsverfahren umfassen die Fusion von Peptid - Tags an Zielproteine, durch Immunpräzipitation oder Extraktion auf Säulen , gefolgt mit Perlen zu einem Einfang - Moleküle gebunden 5 geladen wird ,„&gt; 6. Während dieses erweiterbaren viele Proteine ist, erfordert es Sequenzmodifikation des Ziels, möglicherweise in Konstrukten führt , die für ihre üblichen Bindungspartner in der Affinität unterscheiden. Die empfindliche Natur einiger Protein-Protein - Wechselwirkungen , bedeutet dieses Verfahren nicht anwendbar sein kann viele Szenarien. Außerdem ist das Pull-down-Assays verwendet, um Protein-Protein-Wechselwirkungen abbilden kann keine genaue zelluläre Bild erfassen, aufgrund eingeschränkter Freiheitsgrade und nicht-nativen Mengen des Köders Proteins. Idealerweise Proteinkomplexe könnten zur Reinigung oder Pull-Down ohne die Notwendigkeit, in ihren Heimatstaat nachgewiesen werden. Blau nativen Polyacrylamid - Gelelektrophorese (BN-PAGE) wurde als weniger denaturierende Alternative zu Natriumdodecylsulfat - Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) entwickelt und erlaubt die Trennung von einigen Proteinen und Komplexen aus biologischen Proben 7. Eine getrennte Proteine ​​in BN-PAGE auf Basis eines LARge Anzahl von Variablen, einschließlich der Größe, Ladung, dreidimensionale Struktur, und die Assoziation mit anderen Molekülen. Die Wechselwirkungen dieser Faktoren führen häufig in Zusammenarbeit Trennung von Proteinen, die Aggregatbildung und schlechter Proteinbande Auflösung. Zweidimensionale nativer Polyacrylamid - Gelelektrophorese löst einige, aber nicht alle dieser Probleme 8. Um die Komplikationen zu umgehen mit nativer Trennung verbunden sind , verwenden einige Autoren aminreaktive Vernetzungsreagenzien, wie Dithiobis (succinimidylpropionat) (DSP), Proteinkomplexe in Gewebelysaten 4 zu erfassen. Diese behandelten Lysate können dann durch SDS-PAGE denaturiert und abgetrennt werden, während die native Größe und Zusammensetzung von Proteinkomplexen zu erhalten. Da jedoch die Vernetzungsreagenzien auf die Nähe von einem Molekül zum anderen auf Basis reagieren und Proteine ​​in Gewebe-Lysaten haben viele Freiheitsgrade und kann stochastisch interagieren, nicht-spezifischen Hintergrund Quer-Verknüpfung kann in konzentrierten Proben hoch, vor allem sein. Dies kann schwierig zu interpretierenden Ergebnissen führen zu. Hier stellen wir die Verwendung eines Hybrid-BN-PAGE / SDS-PAGE-Verfahren zeigen, bezeichnet als Multimer-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Multimer-PAGE), zu trennen, und das Protein Baugruppen in komplexen Mischungen zu erfassen. Anfänglich wird Zelllysat in Polyacrylamidgel über BN-PAGE suspendiert. Das Lysat enthaltende Gel wird dann mit dem Vernetzungsreagenz DSP. Pseudo-immobilisierte und leicht auf dem Gel aufgetrennt, Proteine ​​sind viel weniger wahrscheinlich unspezifisch zu reagieren, was bedeutet, Hintergrund Vernetzers Reaktivität verringert wird. Nach der Vernetzung werden die Gel-Banden ausgeschnitten und mittels SDS-PAGE getrennt. Das resultierende Gel kann dann durch ein beliebiges Mittel typischerweise mit Polyacrylamidgelelektrophorese assoziiert analysiert werden. Dieses Verfahren ermöglicht die Trennung und den Nachweis von nativen Proteinkomplexen in unmodifizierter Gewebelysat, ohne die Notwendigkeit für eine zusätzliche Reinigung oder Pull-Down.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;epsilon;-Aminocaproic acid</td><td>Sigma</td><td>A2504</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Acros Organics</td><td>164855000</td><td>Toxic.</td></tr><tr><td>Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution)</td><td>BioRad</td><td>161-0148</td><td>Toxic.</td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>Sigma</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Anti rabbit IgG-HRP from goat</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2004</td><td></td></tr><tr><td>Bicinchoninic acid assay kit</td><td>Thermofisher</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Bis-tris</td><td>Sigma</td><td>B9754</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A399-1</td><td></td></tr><tr><td>Chemiluminescence substrate kit</td><td>ThermoFisher</td><td>24078</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie blue G-250</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0770</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td>Toxic.</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-1</td><td></td></tr><tr><td>Dithiobis(succinimidylpropionate)</td><td>Thermo Scientific</td><td>22585</td><td></td></tr><tr><td>Dry nonfat milk</td><td>LabScientific</td><td>M0841</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Thermofisher</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144SI-212</td><td>For titration. Caustic.</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td>For PVDF membrane activation. Toxic.</td></tr><tr><td>Monoclonal anti &amp;alpha;-synuclein IgG from rabbit</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7011-R</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&#039;,N&#039;-tetramethylethylenediamine</td><td>Sigma</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>N,N&#039;-methylenebisacrylamide</td><td>Acros Organics</td><td>16479</td><td>Toxic.</td></tr><tr><td>NP40</td><td>Boston Bioproducts</td><td>P-872</td><td></td></tr><tr><td>Polysorbate 20 (tween-20)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylidene fluoride transfer membranes</td><td>Thermo Scientific</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma</td><td>P3504</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Thermo Scientific</td><td>88265</td><td></td></tr><tr><td>SDS solution (10% w/v)</td><td>BioRad</td><td>161-0416</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate</td><td>Sigma</td><td>L37771</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP329-1</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8)</td><td>BioRad</td><td>161-0799</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8)</td><td>BioRad</td><td>161-0798</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Instruments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GE Imagequant LAS 4000</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9558-10</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 microplate reader</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel Former + Stand</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 22R centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 mL dounce homogenizer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonic tissue homogenizer</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB120220</td><td></td></tr></tbody></table>

multimer-page: a method for capturing and resolving protein complexes in biological samples

Es gibt viele gut entwickelte Methoden zur Reinigung und einzelne Proteine ​​und Peptide zu studieren. Allerdings sind die meisten zellulären Funktionen von Netzwerken interagierender Proteinkomplexen durchgeführt, die oft schwierig zu untersuchen, da ihre Bindung nicht-kovalent und leicht durch Reinigungstechniken gestört. Diese Arbeit beschreibt ein Verfahren zur Stabilisierung und Trenn native Protein-Komplexe aus nicht-veränderten Geweben zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter Verwendung von. Tissue-Lysat wird auf eine nicht-denaturierenden blau-native Polyacrylamidgel geladen, dann wird ein elektrischer Strom angelegt wird, bis das Protein, das eine kurze Strecke in das Gel wandert. Die Gelstreifen die migrierten Protein enthält, wird dann mit den aminreaktiven Vernetzungsreagenz Dithiobis (succinimidylpropionat), das kovalent Protein ausgeschnitten und inkubiert Komplexe stabilisiert. Die Gelstreifen vernetzten Komplexe enthalten, werden dann ein Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel eingegossen, und tEr komplexe sind vollständig getrennt. Die Methode beruht auf Techniken und Materialien, die den meisten Molekularbiologen vertraut sind, was bedeutet, dass es kostengünstig und leicht zu erlernen ist. Während es in seiner Fähigkeit, äußerst große Komplexe adäquat zu trennen, begrenzt ist und nicht allgemein erfolgreich war, war die Methode in der Lage, eine Vielzahl von gut untersuchten Komplexen zu erfassen und ist wahrscheinlich auf viele interessierende Systeme anwendbar.

In dieser Demonstration Experiment wurde Multimer-PAGE auf ganzem Rattenhirn-Lysat durchgeführt. Die resultierenden getrennten Proteine ​​wurden auf Polyvinylidendifluorid (PVDF) Membranen geblottet und dann mit Antikörpern gegen Proteine ​​untersucht, die Komplexe sind dafür bekannt, zu bilden. Abbildung 1 zeigt eine Validierung des Protokolls durch zwei Mittel. Erstens, zeigen wir , dass die vernetzten Proteine durch Zugabe eines Reduktionsmittels abspaltbar sind, ist die beobachtete höhere Molmassenfraktionen Bedeutung haben , durch das Vernetzungsreagenz gebildet wird , und sind nicht auf irgendeine andere Komponente des Protokolls (1A) . Zweitens zeigen wir , dass eine Vernetzung der Zugabe von Detergentien (1B) empfindlich ist, das heißt die Vernetzung ist spezifisch für komplexierte Proteine und dass zufällige Reaktivität aufgrund der Nähe auf dem Gel zu schließen , minimiert wird. Abbildung 2 zeigt , dass das Verfahren bzw. zur Erfassung fehlschlägtiratory Komplex II, hat aber sonst eine breite Anwendbarkeit für die Erfassung sowohl lösliche als auch membrangebundenen Komplexen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55341/55341fig1.jpg" /> Abbildung 1: Validierung der Multimer-PAGE - Methode. (A) Erfassung von Protein - Komplexen , die durch in-Gel - Vernetzung mit DSP ist empfindlich gegenüber Spaltung durch Dithiothreitol (DTT). Multimer-PAGE wurde an ganzen Rattenhirn ohne Lysat (A1) durchgeführt oder mit (A2), 5 mM Dithiothreitol in Tris / SDS Abschrecklösung enthalten. Das Gel wurde auf PVDF-Membranen elektrogeblottet und dann für Kinesin schweren Kette sondiert. Ein hohes Molekulargewicht Band ist auf beiden Membranen beobachtet, wahrscheinlich auf alle oder einen Teil des Kinesin Motorproteinkomplex entspricht. Es gibt eine zusätzliche Bande bei 126 kDa auftritt, auf dem DTT-behandelte Blot, die Molekularmasse des Kinesin-schweren Kette-Peptid. Dithiothreitol ist ein Reduktionsmittel, und ist in der Lage cr zu umkehrenoss Vernetzung durch die Disulfidbindung in DSP spalten. Das Kinesin-Aggregat ist daher empfindlich gegenüber Spaltung durch DTT. (B) Proteinkomplex capture ist empfindlich gegenüber Zusatz von Detergenzien zu denaturieren. Multimer-PAGE wurde an ganzem Rattenhirn-Lysats durchgeführt, wie im Text beschrieben, mit der Ausnahme steigender Mengen (0 bis 2%) von SDS (links) oder Triton X-100 (rechts) wurden zu dem Lysat Proben zugegeben, und dann auf Eis inkubiert 30 Minuten vor dem ersten Gel geladen. Die fertigen Gele wurden auf PVDF-Membranen geblottet und für α-Synuclein sondiert. Mindestens drei Banden von zunehmendem Molekulargewicht beobachtet werden, entspricht, a-Synuclein-Monomer, Tetramer und Octamer, respectively. Die Signalintensitäten der oligomeren Bänder nimmt mit Waschmittelkonzentration zunimmt, was anzeigt, dass Vernetzungs Wirksamkeit von nativen Proteinkonformation abhängt. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55341/55341fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55341/55341fig1large.jpg" target="_blank">um vi</a>ew eine größere Version dieser Figur. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55341/55341fig2.jpg" /> Abbildung 2: Nachweis der Einnahme von Proteinkomplexen unter Verwendung von Multimer-PAGE. (A) lösliche und membrangebundene Protein - Komplexe wurden von (A) insgesamt Rattenhirn - Lysat oder (B) Lysat mit 2% Digitonin für 1 h bei 4 ° C, durch Durchführen eines Multimer-PAGE inkubiert erfaßt , wie im Text beschrieben. Die Gele wurden dann abgetupft und die PVDF-Membranen für die Komponenten der verschiedenen Komplexe sondiert. Hochmolekularen Spezies wird auf dem für acetyliertes Tubulin sondiert Membran beobachtet wird, von dem bekannt ist Mikrotubuli zu stabilisieren. Dynein und Kinesin sind Multi-Untereinheit-Motor-Protein-Komplexe mit Molekulargewichten von 1,5 MDa und 380 kDa, respectively. Die Membranen für die Komponenten dieser Komplexe geblottet zeigen hochmolekulare Spezies. Zusätzlich Multimer-PAGE erfolgreich captured den HSP90-Dimer. &amp; agr; -Synuclein bildet Tetramere und Octamere sowie neurotoxischen hochmolekulare Oligomere. Der Octamer und ein Streifen von höhergewichtigen Spezies sind auf der geblotteten Membranen gesehen. VDAC Dimerisierung wird auch beobachtet. Hochmolekularen Spezies werden auf den für die Komponenten der mitochondrialen Komplexen I und IV geblotteten Membranen nachgewiesen. Jedoch geblottet die Membran für SDHA, ein Mitglied des Komplexes II, keine geeignete hochmolekulare Bande zeigen. AcetTUB: acetyliertes α-Tubulin; βTUB: β-Tubulin; Dynein: dynein schwere Kette; HSP90: heat shock protein 90; Kinesin: Kinesin schwere Kette; NDUFS3: Eisen-Schwefel-Zentrum 3 des mitochondrialen Komplex I; VDAC: porin; SDHA: Succinat-Dehydrogenase der mitochondrialen Komplexes II; COXIV: Cytochrom C-Oxidase mitochondrialer Komplex IV. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55341/55341fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55341/55341fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Bild 3: Allgemeine Multimer-PAGE Flussdiagramm. (A) Bereiten Gewebelysat unter Verwendung von nicht-denaturierenden Methoden, wie Homogenisieren in BN-PAGE - Probenpuffer. (B) Die Pipetten - Lysat in BN-PAGE - Gel, dann durchführt Elektrophorese (150 Volt) in BN-PAGE - Laufpuffer. Erlauben Probe zu wandern, bis die Farbstofffront ~ 2 cm in das Trenngel gewandert ist. (C) Entfernen Sie die Stapelschicht und ungenutzten Teil der Auflösungsschicht. (D) das Versenken Gelstreifen in PBS, und Äquilibrieren mit 30 min Schütteln. (E) Entfernen des PBS und erneut unterzutauchen den Gelstreifen in PBS , enthaltend 2,5 mM DSP. Schütteln für 30 min. (F) Entfernen DSP - Lösung, dann erneut unterzutauchen die Gelstreifen in 375 mM Tris , enthaltend 2% SDS und Schütteln für 30 min. Komplexe, die in dem Gelstreifen werden nun von Cros stabilisiertess-Anbindung. (G) drehen , das Gel 180 ° und in ein neues SDS-PAGE - Gel Gußbandes. Fügen Sie sowohl Stapel- und Auflösungsschichten. (H) Lösen Probe durch Elektrophorese (120 Volt). (I) Entfernen Gelstreifen und Stapelschicht, dann analysiert wie nötig Auflösungsschicht. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55341/55341fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55341/55341fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples at JoVE.com

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Verfahren zur Stabilisierung und Trenn nativen Proteinkomplexe aus unmodifizierten Gewebelysat gekoppelt, um ein Amin-reaktives Protein Vernetzers unter Verwendung von auf eine neuartige zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) -System dargestellt.

Multimer-PAGE: Ein Verfahren zum Erfassen und Auflösen von Proteinkomplexen in biologischen Proben

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

multimer-page-method-for-capturing-resolving-protein-complexes

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.3K Aufrufe.  Michigan State University.  Verfahren zur Stabilisierung und Trenn nativen Proteinkomplexe aus unmodifizierten Gewebelysat gekoppelt, um ein Amin-reaktives Protein Vernetzers unter Verwendung von auf eine neuartige zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) -System dargestellt. 

Serie: Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

Protein Complex Affinity Capture von Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Forschung

Biochemie

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a protocol is presented for the analysis of anionic and cationic metabolites in biological samples by capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry (CE-MS). CE is well-suited for the analysis of highly polar and charged metabolites as compounds are separated on the basis of their charge-to-size ratio. A recently developed sheathless interfacing design, i.e., a porous tip interface, is used for coupling CE to electrospray ionization (ESI) MS. This interfacing approach allows the effective use of the intrinsically low-flow property of CE in combination with MS, resulting in nanomolar detection limits for a broad range of polar metabolite classes. The protocol presented here is based on employing a bare fused-silica capillary with a porous tip emitter at low-pH separation conditions for the analysis of a broad array of metabolite classes in biological samples. It is demonstrated that the same sheathless CE-MS method can be used for the profiling of cationic metabolites, including amino acids, nucleosides and small peptides, or anionic metabolites, including sugar phosphates, nucleotides and organic acids, by only switching the MS detection and separation voltage polarity. Highly information-rich metabolic profiles in various biological samples, such as urine, cerebrospinal fluid and extracts of the glioblastoma cell line, can be obtained by this protocol in less than 1 hr of CE-MS analysis.

A protocol for metabolic profiling of biological samples by capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry using a sheathless porous tip interface design is presented.

Sheathless Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie zur metabolischen Profils von biologischen Proben

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of protein-protein interactions (PPI) is no novelty, experimental approaches aiming to characterize endogenous protein-metabolite interactions (PMI) constitute a rather recent development. Herein, we present a protocol that allows simultaneous characterization of the PPI and PMI of a protein of choice, referred to as bait. Our protocol was optimized for Arabidopsis cell cultures and combines affinity purification (AP) with mass spectrometry (MS)-based protein and metabolite detection. In short, transgenic Arabidopsis lines, expressing bait protein fused to an affinity tag, are first lysed to obtain a native cellular extract. Anti-tag antibodies are used to pull down protein and metabolite partners of the bait protein. The affinity-purified complexes are extracted using a one-step methyl tert-butyl ether (MTBE)/methanol/water method. Whilst metabolites separate into either the polar or the hydrophobic phase, proteins can be found in the pellet. Both metabolites and proteins are then analyzed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS or UPLC-MS/MS). Empty-vector (EV) control lines are used to exclude false positives. The major advantage of our protocol is that it enables identification of protein and metabolite partners of a target protein in parallel in near-physiological conditions (cellular lysate). The presented method is straightforward, fast, and can be easily adapted to biological systems other than plant cell cultures.

Protein-protein and protein-metabolite interactions are crucial for all cellular functions. Herein, we describe a protocol that allows parallel analysis of these interactions with a protein of choice. Our protocol was optimized for plant cell cultures and combines affinity purification with mass spectrometry-based protein and metabolite detection.

2 in 1: Affinitätsreinigung für die parallele Analyse von Protein-Protein und Protein-Metabolit komplexe in einem Schritt

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed complexes. The latter can be elegantly resolved according to molecular size using native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Coupling of such separations to sensitive mass spectrometry (BN-MS) has been well-established and theoretically allows for exhaustive assessment of the extractable complexome in biological samples. However, this approach is rather laborious and provides limited complex size resolution and sensitivity. Also, its application has remained restricted to abundant mitochondrial and plastid proteins. Thus, for a majority of proteins, information regarding integration into stable protein complexes is still lacking. Presented here is an optimized approach for complexome profiling comprising preparative-scale BN-PAGE separation, sub-millimeter sampling of broad gel lanes by cryomicrotome slicing, and mass spectrometric analysis with label-free protein quantification. The procedures and tools for critical steps are described in detail. As an application, the report describes complexome analysis of a solubilized endosome-enriched membrane fraction from mouse kidneys, with 2,545 proteins profiled in total. The results demonstrate identification of uniform, low-abundance membrane proteins such as intracellular ion channels as well as high resolution, complex protein assembly patterns, including glycosylation isoforms. The results are in agreement with independent biochemical analyses. In summary, this methodology allows for comprehensive and unbiased identification of protein (super)complexes and their subunit composition, providing a basis for investigating stoichiometry, assembly, and interaction dynamics of protein complexes in any biological system.

A versatile cryoslicing BN-MS protocol using a microtome is presented for high-resolution complexome profiling.

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

Isolierung von Labile Multi-Protein-Komplexe durch In vivo Kontrollierte Cellular Cross-Linking und Immuno-magnetische Affinitätschromatographie

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Biologie

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other proteins (Sali, Glaeser et al. 2003). Thus, the study of protein-protein interaction networks requires the detailed characterization of MPCs to gain an integrative understanding of protein function and regulation. For identification and analysis, MPCs must be separated under native conditions. In this video, we describe the analysis of MPCs by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). BN-PAGE is a technique that allows separation of MPCs in a native conformation with a higher resolution than offered by gel filtration or sucrose density ultracentrifugation, and is therefore useful to determine MPC size, composition, and relative abundance (Sch&auml;gger and von Jagow 1991); (Sch&auml;gger, Cramer et al. 1994). By this method, proteins are separated according to their hydrodynamic size and shape in a polyacrylamide matrix. Here, we demonstrate the analysis of MPCs of total cellular lysates, pointing out that lysate dialysis is the crucial step to make BN-PAGE applicable to these biological samples. Using a combination of first dimension BN- and second dimension SDS-PAGE, we show that MPCs separated by BN-PAGE can be further subdivided into their individual constituents by SDS-PAGE. Visualization of the MPC components upon gel separation is performed by standard immunoblotting. As an example for MPC analysis by BN-PAGE, we chose the well-characterized eukaryotic 19S, 20S, and 26S proteasomes.

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

In this video, we describe the characterization of multiprotein complexes (MPCs) by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). In a first dimension, dialyzed cellular lysates are separated by BN-PAGE to identify individual MPCs. In a second dimension SDS-PAGE, MPCs of interest are further subdivided to analyze their constituents by immunoblotting.

Blaue Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (BN-PAGE) zur Analyse von Multiproteinkomplexen aus Zelllysaten

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research is deciphering how these dynamic protein complexes act to integrate signals from multiple sources in order to direct a specific biological response, and how this becomes deregulated in many disease settings. Despite the importance of this key biochemical mechanism, there is a lack of experimental techniques that can facilitate the specific and sensitive deconvolution of these multi-molecular signaling complexes.
Here this shortcoming is addressed through the combination of a protein complementation assay with a conformation-specific nanobody, which we have termed Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel technique facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any pair of interacting proteins, to the exclusion of un-complexed individual proteins and complexes formed with competing binding partners. 
The BiCAP technique is adaptable to a wide array of downstream experimental assays, and the high degree of specificity afforded by this technique allows more nuanced investigations into the mechanics of protein complex assembly than is currently possible using standard affinity purification techniques.

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

This manuscript describes the protocol for Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel method facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any two interacting proteins, while excluding un-complexed individual proteins as well as complexes formed with competing binding partners.

Sezieren Signalisierung Multi-Protein-komplexe durch eine Bimolekulare Ergänzung Affinitätsreinigung (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...

Immunologie und Infektion

Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies

Proteins interact with their ligands to form active and dynamic assemblies which carry out various cellular functions. Elucidating these interactions is therefore fundamental for the understanding of cellular processes. However, many protein complexes are dynamic assemblies and are not accessible by conventional structural techniques. Mass spectrometry contributes to the structural investigation of these assemblies, and particularly the combination of various mass spectrometric techniques delivers valuable insights into their structural arrangement.
In this article, we describe the application and combination of two complementary mass spectrometric techniques, namely chemical cross-linking coupled with mass spectrometry and native mass spectrometry. Chemical cross-linking involves the covalent linkage of amino acids in close proximity by using chemical reagents. After digestion with proteases, cross-linked di-peptides are identified by mass spectrometry and protein interactions sites are uncovered. Native mass spectrometry on the other hand is the analysis of intact protein assemblies in the gas phase of a mass spectrometer. It reveals protein stoichiometries as well as protein and ligand interactions. Both techniques therefore deliver complementary information on the structure of protein-ligand assemblies and their combination proved powerful in previous studies.

The architecture of protein complexes is essential for their function. Combining various mass spectrometric techniques proved powerful to study their assembly. We provide protocols for chemical cross-linking and native mass spectrometry and show how these complementary techniques help to elucidate the architecture of multi-subunit protein assemblies.

Kombination von chemische Vernetzung und Massenspektrometrie intakt Proteinkomplexe, die Architektur des Multi-Untereinheit Protein Baugruppen zu studieren

Proteins interact with their ligands to form active and dynamic assemblies which carry out various cellular functions. Elucidating these interactions is ...

Multimer-PAGE for Separating Native Protein Complexes: A Hybrid Separation Technique Consisting of Blue Native-PAGE and SDS-PAGE to Separate Intact Multimeric Proteins From Tissue Lysate

Source: Rhinesmith, T. et al., <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/55341">Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples</a>. J. Vis. Exp. (2017).
This video describes multimeric PAGE for separating native protein complexes from tissue homogenates. The technique is a hybrid of blue native-PAGE and SDS-PAGE techniques. The separated complexes can be characterized and studied for their role in cell functioning.

Multimer-PAGE zur Trennung nativer Proteinkomplexe: eine hybride Trenntechnik bestehend aus blauem native-PAGE und SDS-PAGE zur Trennung intakter multimerer Proteine aus Gewebelysat

Source: Rhinesmith, T. et al., Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples. J. Vis. Exp. (2017).
This ...