Name: microrna-based regulation of picornavirus tropism
Uploaded: 2017-02-06T10:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism at JoVE.com

Al and Mary Agnes McQuinn, the Richard M. Schulze Foundation, and an NIH Relief Grant from the Mayo Clinic funded representative work described here.

The authors have nothing to disclose.

העיצוב, הרכב והלוקליזציה של האלמנטים בתגובת microRNA בתוך הגנום הויראלי יכתיבו מיקוד יעיל וספציפי. אופטימיזציה אלה ידרוש ניסוי וטעייה. עם זאת, תכנון רציונלי מבוסס על ניתוח RNA מבני מחקרים קודמים של שכפול נגיפי איידס חתימות microRNA ביישום הטכניקה הזו עם אופטימיזציה מינימאלי 10, 11, 12, 13, 38. בעת ביצוע העיצוב של מיל, החוקרים צריכים להתחיל על ידי הרכבת סט של מיקרו-רנ&quot;א המתבטאים בתאי המטרה של עניין, הם פחתה בתאים שאינם היעד של עניין, וכי אומתו באופן ניסיוני. בעקבות אוסף זה, כמה ניתוחים מבוססי חיזוי צריכים להתנהל להתייחס לאפשרות של microRNA-targe מתחרהאינטראקציות t. וירוסים רבים לקודד מיקרו RNA או RNAs ללא קידוד כי לעקל רנ&quot;א הסלולר כדי לתפעל ביטוי גנים נגיפיים המארח. יתר על כן, כמה וירוסים RNA הוכחו אינטראקציה עם מיקרו-רנ&quot;א הסלולר על מנת לשפר את כושר שכפול שלהם 39, 40. לכן, בעת תכנון מיל, הקפד לבדוק אם יש ידועים אינטראקציות של הנגיף עם מיקרו-רנ&quot;א הסלולר או אם הם מביעים רנ&quot;א נגיפי שעלולים לזהות את היעד microRNA נבחר או לשנות את ביטוי אנדוגני של microRNA הנבחר. בנוסף לחיפושי ספרות, הקורא צריך לשקול כלים ומאגרי מידע חיזוי ביואינפורמטיקה באינטרנט הכוללים מידע יעד microRNA ויראלי כדי לסייע בעיצוב רציונלית של מיל. מסדי נתונים כאלה וכלי חיזוי יכולים גם להקל על זיהוי של רצפי יעד שיכול להיות מוכר על ידי מייקרו-רנ&quot;א המרובה או רצפי זרע חופפים מראש<html> נשלח בתוך הגנום הויראלי. לדיון מעמיק יותר על שיטות לזיהוי מטרות microRNA ואת היתרונות וחסרונות של כמה מהכלים התחזו באינטרנט הקורא נקרא אזכור 41, 42. מומלץ כלי חיזוי אלה משרתים רק כמדריכים כנבואות פעמים רבות יכולות להניב תוצאות חיוביות או שליליים שגויות. לשם כך, ייתכנו רצפי זרע חופפים, אולם בסופו של דבר &#39;3 של microRNA גם ישפיע על יעילות המיקוד. שימוש מדי מחמיר של חקוק באבן יכול לפעמים להיות מזיק. לאחר סדרה של מטרות microRNA פוטנציאל זוהו, החוקר צריך להמשיך לפי הדירוג יעדי מבוסס על התכונות הביולוגיות של מיקרו-רנ&quot;א ותחזיות מבניים RNA 10, 11, 12, 13,EF &quot;&gt; 38. השפע המוחלט של microRNA בוגרת תאים ממוקדים ורמת ההתאגדות שלה עם חלבון argonaute יכתיב את המידה להשתקת גנים. מספר מחקרים הראו כי רק מבוטא בשפע רנ&quot;א יסדיר ביטוי גנים 16 באופן משמעותי, 43, 44. יתר על כן, בעוד מייקרו RNA כמה באים לידי ביטוי האינטראקציה שלהם בשפע עם חלבוני argonaute היווצרות של RISC אינו מספיק כדי להדחיק תרגום 44. באמצעות microRNA בהיקף הנרחב ביותר עם פונקציה תוקפת יהיה גם לצמצם את הסיכון רווי microRNA בתא יעד ההנחה מתוך באה רעילות היעד. גישה שונה עשויה להיות שימוש מיל אשר ממוקדות על ידי miRNAs מספר 45, 46, אשר יכולים להרשות לעצמנו מספר עותק מוקטן ועדיין מזעור הסיכון הפוטנציאלי toxiciti מחוץ היעדes. יחס mRNA היעד microRNA תהיה גם השפעה משמעותית על ההצלחה של גישה זו. מטרה גבוהה יחס microRNA תפחית את רמת דיכוי 42, 43, 47, 48. זהו עניין חיוני במיוחד עם וירוסים המחקים במהירות כאשר אם מוסדר כראוי מוקדם במהלך ההדבקה יצטברו לרמות בשליטת רנ&quot;א אנדוגני. זה חיוני כדי לשקול תכונות אלה בעת בחירת microRNA למיקוד; באופן אידיאלי, באמצעות microRNA שתפקידו יאומת באופן ניסיוני. היעילות של להשתקת גנים ממוקד הוא מושפע גם ההשלמה אחוז היעד אל microRNA בוגרת וכן את מספר העותקים של רצפי מיקרו-רנ&quot;א-היעד מוכנס. האזור &#39;5 של microRNA (נוקלאוטידים 2-8) מהווה את רצף זרע. מקובלכי אזור זה חייב להיות מושלם משלים מיקוד מוצלח 48, 49. רוב המחקרים להשתמש אלמנטים בתגובה עם השלמה מושלמת כי זה יכול להגביר את פעילות גנים-השתקה באמצעות קידום מחשוף endonucleolytic לפרוטוקול ומחזור המהיר של microRNA. מחשוף endonucleolytic זו מתרחשת רק כאשר microRNA אינטראקציה עם חלבון argonaute שיש לו פעילות endonucleolytic, אשר בתאי יונקים מוגבל argonaute-2. חלבונים argonaute אחרים לקדם השפלה mRNA על ידי deadenylation ולתקוף exonucleolytic לפרוטוקול. הקורא נקרא אזכור 4, 5, 13, 50, 51, 52 עבור תיאור מעמיק של biogenesis microRNA ותפקוד. הוא בדרך כלל חשב כי אינקרהקלת מספר העותק ותחזק את יעילות המיקוד. עם זאת, זה יכול גם להגביר רווית microRNA ולא תמיד מוכח יותר יעיל. לפעמים זה עדיף לשלב רצפי היעד עבור מיקרו-רנ&quot;א שונים מרובים מועשר בתאי המטרה או להשתמש רצפי היעד המוכרים על ידי מיקרו-רנ&quot;א מרובים. מספר העותק הנדרש הוא גם תלוי מאוד את כמות התעתיק שעליו תצטרך והשתקת השפע היחסי של microRNA בתאי המטרה. תמלילים כי יצטברו במהירות עשויים לדרוש יותר עותקים כדי למנוע מהם outcompeting רמות microRNA. ניסיוני קביעת מספר העותק האופטימלי עבור כל יעד microRNA שתוצאתו מיקוד מספיק, שומר כושר ויראלי, וכי מצמצם את שיעור מוטציות בריחה מומלץ. לוקליזציה של אלמנט תגובת microRNA בתוך הגנום הויראלי היא מאוד חשובה. תוצאה שלילית כאשר מנתחיםאת יעילות המיקוד לא תמיד אומרת הנגיף לא יכול להיות במיקוד microRNA. זה אולי פשוט מתכוון היעד אינו נגיש שמיקום או ההדחקה של הגן הממוקד אינה מספיקה כדי לעכב פתוגניות. רוב האלמנטים בתגובה מוכנסים לתוך אזורי 3 &#39;המתורגמים (UTR) לפרוטוקול הממוקד. עם זאת, מיקוד מוצלח של הגנום נגיפי הושג ולפעמים מייצגים משופר יציבות גנטית כאשר אלמנטים בתגובה מוכנסים לתוך &#39;UTR 5 או בתוך אזורי הקידוד של גנים חיוניים 38. אתרי החדרה אופטימליים ייאפשרו נגישות גבוהה של רצף היעד על microRNA. נגישות יכולה להתעכב על ידי מבנים משניים RNA והפרעת stoichiometric. לכן, אלמנטים בתגובה לאיתור באזורים מובנים אשר שמורים ביותר היא נקודת התחלה טובה. הרצפים להיות מוכנסים עשויים להשפיע גם ולהיות מושפעת הרצפים שמסביב. Tהוס, מיקום אופטימלי עבור רצף יעד microRNA אחד אינו אופטימלי בהכרח עבור אלמנטי תגובה אחרים. בעוד אימות ואופטימיזציה ניסיון של לוקליזציה RE יש צורך, באמצעות תוכנת חיזוי (למשל http://unafold.rna.albany.edu/; http://rna.urmc.rochester.edu/software.html) לסנן אתרים להוסיף פוטנציאל עבור הפרעות של מבני RNA שמסביב מומלץ מאוד 53, 54. שימוש הכנות חומצה נקיות גרעין של יושרה גבוהה גם קריטי בהשגת התוצאות הטובות ביותר. טכניקת אספטי ותחזוקה של סביבת RNase ללא בעת טיפול תעתיקי רנ&quot;א או מחק microRNA חיוני. עבור תעתיקי רנ&quot;א תוצאות הטובים ביותר, מחק microRNA, ומניות וירוס טיטרציה סופיות צריכים להיות מאוחסנות ב -80 מעלות צלזיוס aliquots הקטן כדי למנוע קפיאה חוזרת הפשרה וכתוצאה מכך שפלת RNA ואובדן infectivity וירוס. כאשר בשימוש, מגיב אלה<html> ים יש לשמור על הקרח בכל עת. חשוב לציין כי מיקרו-רנ&quot;א רבים הם בני משפחה של מיקרו-רנ&quot;א החולקות המשלימות. לכן כאשר עורכים מחקרים זה עשוי להיות מועיל לכלול בני משפחת microRNA מיידיות במטרה לשפר הערכה מיקוד-סגוליות. זה הופך להיות קריטי כאשר התאים שבתוכה שכפול נגיף הוא רצוי, להביע בני המשפחה (המשפחתי, למשל miR-Let7). כמו כן יש לציין כי assay הסגולית באמצעות מחקת microRNA היא מערכת מלאכותית יתר הביטוי של microRNA בתאים מסוימים עשויים לגרום לתופעות מחוץ היעד 55. במקרה זה, את הספציפיות ניתן להעריך גם בתאים המבטאים את מיקרו RNA המתאים באמצעות microRNA מעכבי במקום. assay זה יאפשר ניתוח של-סגוליות מיקוד על סמך readouts הכדאיות טיטרציה וירוס ותא בנוכחות רמות רלוונטי מבחינה פיזיולוגית של מיקרו-רנ&quot;א. &quot;jove_content&quot;&gt; הדאגות העיקריות בעת שימוש microRNA-מיקוד כשיטה לשלוט כמיהות ויראלי הן יציבות גנטית, פוטנציאל לתופעות מחוץ היעד, ואפקטי וירוס בתיווך על סביבת microRNA הסלולר 10, 11, 12, 13. וירוסים רבים להפגין את קצב המוטציות גבוהה ולברוח מוטציות שעלולות להתעורר במהירות. כולל מספר עותקים של רצף מטרה, לרבות יעדים יותר microRNA אחד, לאיתור המטרות בתוך אזורים המרובים השמורים ביותר, או בנוכחות גורמים אנטי נוספים ובן כמובן גם תגובה חיסונית יכול להקל על זה. בנוסף, החדרת חומר גנטי זר לתוך הגנום נגיפי תגרום שיכולת שכפול פחתה של הנגיף. במקרה זה, יעד microRNA צפוי להיות גנטי בלתי יציבים לברוח מוטציות יקומו מהר יותר. הכללה של ca עותקי יעד microRNA המרובהn גם להגדיל את הפוטנציאל למחיקת recombinatorial של מטרות microRNA. לכן, באופן ניסויי מספר עותק המינימלי הנדרש לצורך מיקוד מספיק הכרחי. לוקליזציה עותקי יעד microRNA במקומות שונים לאורך הגנום לעומת שימוש חוזר טנדם יכול לסייע לעקוף מגבלה זו. עם זאת, זיהוי תצורות RE אופטימליים עם המספר המזערי של עותקי יעד צורך ואתרי כנס שאינו נובע קינטיקה שכפול השונה של הווירוס הוא קריטי למזעור שיעור רקומבינציה ו מוטצית היעד. הכללה של עותקים רבים מדי של רצף יעד עשויה גם להגביר את הפוטנציאל רעיל מחוץ היעד אם התוצאה היא רווית microRNA. בשינוי גדול בסך של microRNA הזמין להסדרת חלבונים תאיים רגילים יכול לגרום לתופעות לא רצויות 55. לשם כך, וירוסים רבים לשנות את סביבת microRNA בתוך תא 56 ואם זהכוללת את microRNA הממוקד, את היעילות של רגולציה עשויה להיות ירידה אם שכפול נגיף מספיק נשמר. כל החששות האלה ניתן לפנות על ידי אופטימיזציה רכב אלמנט תגובה ו / או לוקליזציה עם הבנה מעמיקה של המערכת על כוונת ומגבלותיה. בעיות אופייניות הקשורות שיטות מיקוד אחרות כוללות הנחתה מחוץ היעד של הנגיף, אילוצי גודל חומר מיקוד גנטי וירוסים עם יכולות נושאת מוגבלות, חששות בטיחות הקשורים לוירוסי הנדסה למקד תאים כי הם בדרך כלל לא נגועים. MicroRNA מיקוד מאפשר ויסות של כמיהות ויראלי עם שינוי מזערי של הנגיף. זה דורש שטח מינימלי בתוך הגנום הנגיפי ויכול להיות מותאם המבוסס על מערך רחב ידיים של חתימות microRNA הסלולר. טכניקה זו אינה להציג tropisms חדש של וירוס ולכן אינו קובע ספקות בנוגע לבטיחות חדש. בנוסף, זההשיטה יכולה לשמש כדי לווסת tropisms מרובים בו זמנית באמצעות רצפי היעד עבור מיקרו-רנ&quot;א שונים מרובים מועשר בתוך תאים מסוגים שונים 16, 17, 57, 58, 59, 60, 61. זה יכול כל להיות מושלם בלי הפחתת הנגיף בתאים אשר אינם מבטאים את מיקרו RNA המתאים ולכן יכול לספק מנגנון לשיפור הבטיחות של וירוסים טיפולית עם עוצמה משופרת. ניצול של מכונות microRNA סלולריות יכול לשמש להסדרת הכמיהות של מעמדות שונות רבות של וירוסים. הפרוטוקולים המפורטים כאן נועדו להצלה והאפיון של picornavirus במיקוד microRNA, אולם הם יכולים להיות מותאמים לפי וירוס &#39;מחזור שכפול rea כתב המבוקשdouts. למרות וירוסים שונים יש אסטרטגיות הצלה ספציפי, רצפי היעד microRNA יכול להיות מוכנס לתוך הגנום הויראלי בין אם הגנום כולו מקודד פלסמיד יחיד או אם יש וירוס גנום DNA או RNA. כל עוד התאים המפיקים אינם מבטאים את רנ&quot;א מאותו המקור, מטרות microRNA אופטימיזציה אסור לשבש הצלת וירוס. ניסויים לנתח קינטיקה צמיחת וירוס microRNA-מיקוד סגולי ניתן לשנות על ידי שינוי המועדים לפי השעון שנאספו מבוססים על האורך של סיבוב בודד של שכפול נגיף ועל readouts ספציפית / רעילות שכפולות נגיף (חלבוני כתב למשל, cytotoxicity, כימות הגנום, וכו &#39;). חשוב לציין כי למרות טכניקה זו יכולה תיאורטית להיות מיושמת על כל סוגי וירוסים, גורמים רבים יכולים להשפיע על היעילות של שיטה זו. לדוגמא, וירוסי RNA שלילי במובן לא הוכיחו תגובה כמו וירוסי RNA חיובי במובן הנראה בשל ac המוגבלcessibility של RNA הגנומי אל מכונות מירנה 13. לפיכך, את המאפיינים הביולוגיים של כל סוג של וירוסים יהיה להקנות ואילוצים נוספים על אופטימיזציה RE. למרות מגבלות אלה, טכניקה זו מציעה שיטה חלופית למיקוד מחקר בהנחיית כמיהות ויראלי מעורבים הבטיחות, השירות, והבנה בסיסית של תהליכים ביולוגיים עבור כל סוגי וירוסים.

פיתוח שיטה ישימה, קלה ויעילה רחבים עבור הנדסת וקטור עם כמיהות מוגבלות מספק הזדמנות גדולה כדי לשפר את הבטיחות, הבנה ביולוגית תועלת טיפולית של וירוסים. מספר מנגנונים קיימים למקד כמיהות ויראלי כולל transductional, תעתיק, וטכניקות מבוססות translational. עם זאת, שיטות אלו אינן ישימות כלל לכל מערכות הווקטור, עשוי לדרוש מסלולי איתות פגומים בתאים ממוקדים או לדרוש החדרת רצפי קידוד גדולים לתוך הגנום הויראלי. בנוסף, שיטות אלה עלולות לגרום הנחתה של הנגיף, ולעכב הפעילות הטיפולית שלהם באופן משמעותי והגבלת תובנה על המערכת ללא שינוי. מיקרו RNA קטנים (22-25 נוקלאוטידים), ללא קידוד RNAs אשר מתווכים להשתקת גנים בתאים איקריוטיים. מיקרו RNA פונקציה באמצעות קשירה רצפי היעד משלימים (אלמנטים בתגובה) ב RNAs שליח (mRNA) resulti<html> ng ב יציבות תמליל, השפלה או דיכוי translational. מיקרו RNA בדרך כלל לאגד אלמנטים בתגובה עם השלמה חלקית להניב שינויים קטנים ביטוי גנים 1, 2, 3, 4, 5. עוד שינויים משמעותיים ביטוי גנים יכולים להיות מושגת על ידי הגדלת מידת ההשלמה של אלמנט התגובה 6. אלף מייקרו-רנ&quot;א בוגרת זוהו במגוון מיני דפוסי ביטוי הפרש תערוכה רב במגוון של סוגי תאים ורקמות 7, 8, 9. חתימות microRNA אלה ניתן לנצל עבור הגבלת תא ספציפי של הגברת וירוס על ידי שילוב אלמנטים בתגובה משלימים באופן מושלם לתוך הגנום הויראלי 10,= &quot;Xref&quot;&gt; 11, 12, 13. המטרה הכללית של טכניקת מיקוד-microRNA זה היא לשלוט הכמיהות של הגנום וקטור ללא הנחתה נוספת. השירות של שיטה זו להסדרת כמיהות ויראלי הודגם במקור וקטורים lentiviral להגביל ביטוי transgene ברקמות ספציפיות 14, 15, 16. טכניקה זו לאחר מכן יושמה למגוון רחב של משכפלים ולא משכפל וקטורים ויראליים עבור ריפוי גנטי משופר כמו גם לשפר את פרופיל הבטיחות של וירוסי oncolytic רבים על ידי ביטול רעיל רצוי ברקמות נורמליות 10, 11, 12, 13, 17 . זה גם נוצל כדי ליצור בטוח ודוארחיסונים חיים-מוחלש ffective וכן לשפר וירוס וייצור חיסון מעבד 18, 19, 20, 21. MicroRNA-מיקוד של וקטור יכול לאפשר הנחתה ב מארחים מחוסנים או מערכות ממוקדות תוך שמירה על רמות צמיחת wild-type במערכות יצרן. MicroRNA מיקוד יכול לשמש גם כדי לשפר את הבטיחות הביולוגית של וירוסים למטרות מחקר על ידי הגבלת הילוכים במינים אחד (אדם למשל) תוך שמירה על שידור צבאות אחרים 22. לבסוף, microRNA-מיקוד יכול לאפשר ניתוחים מעמיקים של מחזורי חיים של נגיף ותפקידים ספציפיים של סוגי תאים בפתוגנזה וחסינות ידי הפרדת צמיחת ויראלי 23, 24, 25, 26. טכניקה זו מציעה alternative שיטת מיקוד מיושמת בקלות ישימה עבור כל מערכות הווירוס. בנוסף, האוסף המתרחבת של מיקרו-רנ&quot;א בוגרת עם דפוסי ביטוי ההפרש בסוגי תאים ספציפיים עושה טכניקה זו תכליתי מאוד. MicroRNA מבוסס מיקוד הוכיח יעיל עבור מגוון רחב של מערכות וירוס מבלי להתפשר תפקוד מערכת. המגבלות העיקריות של גישה זו כוללות בדיקה ואופטימיזציה שגיאה, פוטנציאל מוטציות בריחה, ואת הפוטנציאל מחוץ יעד תופעות על תמלילי אנדוגני. עם זאת, מגבלות אלה ניתן להתגבר באופן כללי עם עיצוב אלמנט בתגובה אופטימלי רציונלים. וירוסי RNA חיובי תחושה נוטים להיות קשוב במיוחד כדי microRNA-מיקוד בשל האורינטציה החיובית תחושת הגנום שלהם ואת הזמינות של התמלילים אל מכונה microRNA במהלך מחזור השכפול ציטופלסמית לחלוטין. כאן אנו מתארים פרוטוקול להפקת picornavirus במיקוד microRNA ואת experimשיטות ental כדי לאמת את יעילות וספציפיות של שמיקוד במבחנה.

<table><tbody><tr><td>RE encoding Oligonucleotides</td><td>IDT</td><td>PAGE-Purified Ultramer</td><td>Sequence Designed by Investigator</td></tr><tr><td>Oligonucleotides encoding unique restriction site</td><td>IDT</td><td>25nM</td><td>Sequence Designed by Investigator</td></tr><tr><td>Expand High Fidelity PCR Kit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11732641001</td><td>Many other High Fidelity Polymerase PCR kits available</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase System</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM1333</td><td></td></tr><tr><td>MEGAclear Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td>RNase-free</td></tr><tr><td>5 M NH&lt;sub&gt;4&lt;sub&gt; Acetate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N/A</td><td>Comes in MEGAclear Kit</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free Water</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9938</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-2020 Transfection Reagent</td><td>Mirus</td><td>MIR 5404</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-mRNA Transfection Reagent</td><td>Mirus</td><td>MIR 2225</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;mu;m syringe filter</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Screw-Cap Tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.005</td><td></td></tr><tr><td>Cell Scrapers</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-241</td><td></td></tr><tr><td>MicroRNA Mimics</td><td>Dharmacon</td><td>Varied</td><td></td></tr><tr><td>MTT Cell Proliferation Assay</td><td>ATCC</td><td>30-1010K</td><td></td></tr><tr><td>Subcloning Efficiency DH5&amp;alpha; Competent Cells</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18265017</td><td></td></tr><tr><td>pBlueScript II Vectors</td><td>Agilent Technologies</td><td>Variable (e.g. 212205)</td><td>There are different plasmids with T7 or T3 promoters and variable cloning sites to enable cloning and RNA transcription.</td></tr></tbody></table>

microrna-based regulation of picornavirus tropism

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and understanding the biological properties of viruses. There are several mechanisms for regulating viral tropism, however they tend to be virus class specific and many result in virus attenuation. Additionally, many viruses, including picornaviruses, exhibit size constraints that do not allow for incorporation of large amounts of foreign genetic material required for some targeting methods. MicroRNAs are short, non-coding RNAs that regulate gene expression in eukaryotic cells by binding complementary target sequences in messenger RNAs, preventing their translation or accelerating their degradation. Different cells exhibit distinct microRNA signatures and many microRNAs serve as biomarkers. These differential expression patterns can be exploited for restricting gene expression in cells that express specific microRNAs while maintaining expression in cells that do not. In regards to regulating viral tropism, sequences complementary to specific microRNAs are incorporated into the viral genome, generally in the 3' non-coding regions, targeting them for destruction in the presence of the cognate microRNAs thus preventing viral gene expression and/or replication. MicroRNA-targeting is a technique that theoretically can be applied to all viral vectors without altering the potency of the virus in the absence of the corresponding microRNAs. Here we describe experimental methods associated with generating a microRNA-targeted picornavirus and evaluating the efficacy and specificity of that targeting in vitro. This protocol is designed for a rapidly replicating virus with a lytic replication cycle, however, modification of the time points analyzed and the specific virus titration readouts used will aid in the adaptation of this protocol to many different viruses.

טבלת 1 מייצגת תוצאות אופייניות של assay טיטרציה עבור picornavirus ומתארת כיצד לחשב את המינון זיהומיות תרבות 50% רקמות. ייצוג סכמטי של הרעיון הכללי של רגולציה המבוססת על microRNA של כמיהות ויראלי המתואר בכתב היד הזה מוצג באיור 1. האוריינטציה של microRNA לאלמנט התגובה במהלך אינטראקציות תאיים, תכנון נכון של oligonucleotides אלמנט בתגובה להכנסה חישול פלסמיד, וכן מפה של DNA פלסמיד קידוד הגנום הנגיפי במיקוד microRNA של שעתוק במבחנה מתואר באיור 2. איור 3 מראה תעתיקי רנ&quot;א בדרגות משתנות של שלמות דמיינו ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose. טיפול נכון ושימוש DNA תבניות נטולים זיהומים יגרמו תעתיקי רנ&quot;א עבדו כראוי כפי שמוצגים שביל 3A 2. זיהומים שיורית בתוך Lineaתבניות DNA rized או כמויות זעירות של nuclease יכול לגרום לרמות נמוכות של רנ&quot;א עיבד שלא כהלכה ו / או מוצרים פגומים דומה לזה שנצפה בנתיב 3A 3. לינאריזציה Incomplete של DNA פלסמיד או DNA המכיל כמויות גבוהות של זיהומים כגון אתנול שיורית תגרום מוצרי שעתוק והשפלה פסולים מיוצגים נתיבי 3A 4 ו -5 איור 3 מראים גם דימוי של תופעות cytopathic בתיווך Mengovirus (CPE) בעקבות transfection של תעתיקי רנ&quot;א נקיים. מציג איור 4 נציג נתונים של ניסוי כמובן זמן הערכת קינטיקה צמיחה של Mengovirus ללא שינוי ו microRNA במיקוד. התוצאות מראות כי אלמנטים בתגובה microRNA מהונדסים לגנום Mengovirus אינם משנים את קינטיקה של שכפול הנגיף בתאים H1-הלה, אשר אינם מבטאים כל מיקרו-רנ&quot;א מאותו מקור. עם זאת, ב 264.7 מקרופאגים RAW, המבטאים רמות ביניים של microRNA-125 לבין רמות גבוהות של microRNA-142, וירוסים קידוד האלמנטים בתגובה המקביל להציג קינטיקה שכפול עכבות כי בקורלציה עם רמת microRNA הביעו. נתונים איור 5 מראה את הספציפיות של רגולציה המבוססת על microRNA של כמיהות Mengovirus. התבטאות יתר של כל microRNA בודדים בתאים H1-הלה ​​מעכב התפשטות במיוחד (titers וירוס נמוך) ו cytotoxicity (כדאיות התא מוגברת) של Mengovirus קידוד האלמנט בתגובה microRNA מאותו מקור. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55033/55033fig1.jpg" /> איור 1: ייצוג סכמטי של רגולציה מבוססת microRNA של כמיהות ויראלי. אלמנטים בתגובה MicroRNA (RE) שולבו הגנום הנגיפי יוכרו על ידי מיקרו-רנ&quot;א מאותו מקור מועשר בתוך סוגי תאים ספציפיים לגרום השפלה ממוקד של תמלילי / הגנום הנגיפי. שכפול הנגיף ימנע זה, להתפשט רעילות thדואר תאים סובב. עם זאת, שכפול נגיפי יישמר בתאים אינם מבטאים את רנ&quot;א מאותו המקור המאפשר התפשטות נגיף, התפשטות מוות של תאים. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55033/55033fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55033/55033fig2.jpg" /> איור 2: עיצוב אלמנט בתגובה MicroRNA. (א) עבור מוצלחת מיקוד באזור רצף הזרע של RE צריך להיות משלימים באופן מושלם. רי צריכה להיות מכוונת בתוך הגנום הנגיפי כך שהוא יכול להיות מוכר על ידי microRNA בוגר מאותו המקור ב תעתיקי mRNA ו / או הגנום הויראלי. רוב המיל ממוקמים בתוך UTR &#39;3 של התמלילים. (ב) תיאור של oligonucleotides קידוד המכיל מיל תוכנן annealed כראוי טנדםחזרות של רצפי יעד microRNA (miRT) מוקפים נוקלאוטידים התלויים של אתר אנזים הגבלת XhoI. בעת תכנון מיל חוזרים טנדם, הקפד לכלול נוקלאוטידים spacer (בדרך כלל 4-6) בין כל עותק microRNA-היעד. (ג) ה- DNA פלסמיד קידוד גנום ויראלי באורך מלא עם RE שולבו 3 &#39;UTR, האמרגן T7, ואתר הגבלה ייחודי עבור לינאריזציה של שעתוק במבחנה. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55033/55033fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55033/55033fig3.jpg" /> איור 3: הצלת מהווירוס תעתיקי רנ&quot;א קידוד-הגנום. (א) RNA ג&#39;ל אלקטרופורזה של RNAs עיבד במבחנה קידוד הגנום picornavirus להעריך שלמות תמליל. נתיב<html> 1: סולם RNA. ליין 2: כראוי עבד RNA עם יושרה גבוהה. ליין 3: תעתיקי רנ&quot;א ביושר מתון. להקה גבוהה היא גודל נכון ואת הלהקה תחתונה היא פוטנציאל מוצר שפל או תעתיקי הרנ&quot;א רצויים. ליין 4: כיאות עבד RNA. ליין 5: RNA יושרה נמוך. 500 ננוגרם של רנ&quot;א במבחנה עיבד הועמס לכל טוב. מוצרי שעתוק או שפלה פסולים צפויים עקב השימוש של טוהר נמוך או DNA לינארית באופן חלקי. תמונה (B) של תאים H1-הלה transfected מדומה ותאי טרנספקציה עם תעתיקי רנ&quot;א קידוד Mengovirus. מנהל של ריאגנטים transfection בלבד (מוק) ישמור כדאיויות תא הבא transfection וכן מעבר על תאים טריים. Transfection של תעתיקי רנ&quot;א המקודדת הגנום Mengovirus (VMC 24) התוצאות תופעות cytopathic, אשר נשמרות לאחר סינון של supernatant והמעבר אל תאי H1-הלה טרי. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר.ce.jove.com/files/ftp_upload/55033/55033fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/55033/55033fig4.jpg" /> איור 4: קינטיקה צמיחה של Mengoviruses ללא שינוי ו במיקוד microRNA בנוכחות או העדר של מיקרו-רנ&quot;א מאותו מקור. השתנה בהפניה 17. (א) תאים H1-הלה מחווים miR-124, -125, או -142. כל מיל microRNA קידוד שלוש Mengovirus לשכפל עם קינטיקה דומה לזו של וירוס ללא שינוי (VMC 24) המציין הכניסה לזו של מיקרו-רנ&quot;א במיקום זה (5 &#39;UTR) אינם משנים את התרבות הנגיף. (ב) RAW 264.7 מקרופאגים מבטאים רמות ביניים של miR-125b ורמות גבוהות של miR-142-3p, אך אינם מבטאים miR-124. התאגדות של רצפי מיקרו-רנ&quot;א-היעד המתאים לתוך תוצאות הגנום וירוס attenuation בקנה אחד עם רמת הביטוי microRNA. נתונים מיוצגים titers ויראלי ממוצע +/- SD. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55033/55033fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/55033/55033fig5.jpg" /> איור 5: ניתוח של סגוליות מיקוד-microRNA באמצעות מחקה microRNA סינתטי. השתנה בהפניה 17. H1-הלה תאים transfected עם מחקה microRNA בודדים נדבקו בווירוס ללא שינוי (VMC 24) או וירוס במיקוד microRNA (miRT-VMC 24) ב משרד הפנים של 0.2. (א) כדאי התא מנורמלות תא מדומה שטופל נקבעו ל 24 שעות לאחר הדבקה באמצעות assay התפשטות תאי MTT. (ב) כייל הנגיף supernatant של כל הדגימות נקבע גם ב 24 שעות לאחר ההדבקה. הנתונים מיוצג הכדאיות מרושעים או כייל הנגיף +/- SD. שני זנב מבחני t סטודנטים מזווגים עם התיקון של וולש (עבור סטיות לא שוויוניות) שמשו לניתוח סטטיסטי. ערך p &lt;0.01 נחשב משמעותי. (**, P &lt;0.01, ***, p &lt;0.001). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55033/55033fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism at JoVE.com

MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism

We describe here a method for regulating picornavirus tropism by incorporating sequences complementary to specific microRNAs into the viral genome. This protocol can be adapted to all different classes of viruses with modifications based upon the length and nature of their life cycle.

תקנה מבוססת MicroRNA של Picornavirus כמיהות

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and ...

microrna-based-regulation-of-picornavirus-tropism

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.4K Views.  Mayo Clinic College of Medicine. We describe here a method for regulating picornavirus tropism by incorporating sequences complementary to specific microRNAs into the viral genome. This protocol can be adapted to all different classes of viruses with modifications based upon the length and nature of their life cycle. 

Video: MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close person-to-person contact cannot be avoided 1, 2. During the last few years an increase in the incidence of outbreaks in hospitals has been reported, causing significant disruptions to their operational capacity as well as large economic losses. The identification of new antiviral approaches has been limited due to the inability of human noroviruses to complete a productive infection in cell culture 3. The recent isolation of a murine norovirus (MNV), closely related to human norovirus 4 but which can be propagated in cells 5 has opened new avenues for the investigation of these pathogens 6, 7. 
MNV replication results in the synthesis of new positive sense genomic and subgenomic RNA molecules, the latter of which corresponds to the last third of the viral genome (Figure 1). MNV contains four different open reading frames (ORFs), of which ORF1 occupies most of the genome and encodes seven non-structural proteins (NS1-7) released from a polyprotein precursor. ORF2 and ORF3 are contained within the subgenomic RNA region and encode the capsid proteins (VP1 and VP2, respectively) (Figure 1). Recently, we have identified that additional ORF4 overlapping ORF2 but in a different reading frame is functional and encodes for a mitochondrial localised virulence factor (VF1) 8.
Replication for positive sense RNA viruses, including noroviruses, takes place in the cytoplasm resulting in the synthesis of new uncapped RNA genomes. To promote viral translation, viruses exploit different strategies aimed at recruiting the cellular protein synthesis machinery 9-11. Interestingly, norovirus translation is driven by the multifunctional viral protein-primer VPg covalently linked to the 5' end of both genomic and subgenomic RNAs 12-14. This sophisticated mechanism of translation is likely to be a major factor in the limited efficiency of viral recovery by conventional reverse genetics approaches. 
Here we report two different strategies based on the generation of murine norovirus-1 (referred to as MNV herewith) transcripts capped at the 5' end. One of the methods involves both in vitro synthesis and capping of viral RNA, whereas the second approach entails the transcription of MNV cDNA in cells expressing T7 RNA polymerase. The availability of these reverse genetics systems for the study of MNV and a small animal model has provided an unprecedented ability to dissect the role of viral sequences in replication and pathogenesis 15-17.

Noroviruses are a major cause of gastroenteritis yet molecular techniques for their characterisation are still relatively new. Here we report two different reverse genetics approaches for the efficient recovery of murine norovirus (MNV), the only member of this genus which can be propagated in cell culture.

שחזור הפוך גנטיקה מתווכת של norovirus Murine זיהומיות

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method requires a more technically demanding operation and involves complicated procedures, especially when used in larvae due to their small size, relatively thin and fragile cuticle, and high mortality, which limit its application. In contrast, viral vectors for gene delivery have been developed to surmount extracellular and intracellular barriers. These systems have the advantages of easy manipulation, high gene transduction efficiency, long-term maintenance of gene expression, and the ability to produce persistent effects in vivo. Mosquito densoviruses (MDVs) are mosquito-specific, small single-stranded DNA viruses that can effectively deliver foreign nucleic acids into mosquito cells; however, the replacement or insertion of foreign genes to create recombinant viruses typically causes a loss of packaging and/or replication abilities, which is a barrier to the development of these viruses as delivery vectors.
Herein, we report using an artificial intronic small-RNA expression strategy to develop a non-defective recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo delivery system. Detailed procedures for the construction, packaging and quantitative analysis of the rAaeDV vectors, and for larval infection are described.
This study demonstrates, for the first time, the feasibility of developing a non-defective recombinant MDV micro RNA (miRNA) expression system, and thus providing a powerful tool for the functional analysis of genes in mosquito and establishing a basis for the application of viral paratransgenesis for controlling mosquito-borne diseases. We demonstrated that Aedes albopictus 1st instar larvae could be easily and effectively infected by introducing the virus into the water body of the larvae breeding site and that the developed rAaeDVs could be used to overexpress or knock down the expression of a specific target gene in larvae, providing a tool for the functional analysis of mosquito genes.

We report using an artificial intronic small RNA expression strategy to develop a non-defective recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo delivery system. A detailed procedure for the construction, packaging, and quantitative analysis of the rAaeDV vectors as well as for larval infection is described.

שימוש Densovirus יתוש רקומביננטי כמו וקטור משלוח ג'ין לניתוח פונקציונלי של גנים רימות היתוש

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method ...

Developmental Biology

Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.

Virus-based microRNA silencing (VbMS) is a rapid and efficient tool for functional characterization of microRNAs (miRNAs) in plants. The VbMS system has been developed and applied for various plant species including Nicotiana benthamiana, tomato, Arabidopsis, cotton, and monocot plants such as wheat and maize. Here, we describe a detailed protocol using PVX-based VbMS vectors to silence endogenous miRNAs in potato. To knock down the expression of a specific miRNA, target mimic (TM) molecules of miRNA of interest are designed, integrated into plant virus vectors, and expressed in potato by Agrobacterium infiltration to bind directly to the endogenous miRNA of interest and block its function.

Potato Virus X-Based microRNA Silencing VbMS In Potato.

We present a detailed protocol for potato virus X (PVX)-based microRNA silencing (VbMS) system to functionally characterize endogenous microRNAs (miRNAs) in potato. Target mimic (TM) molecules of miRNA of interest are integrated into the PVX vector and transiently expressed in potato to silence the target miRNA or miRNA family.

וירוס תפוחי אדמה X מבוסס השתקת מיקרונה (VbMS) בתפוח אדמה.

Virus-based microRNA silencing (VbMS) is a rapid and efficient tool for functional characterization of microRNAs (miRNAs) in plants. The VbMS system has ...

Environment

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented, negative-sense, single-stranded, enveloped RNA virus (Figure 1) with potential applications as a vector for vaccination and treatment of human diseases. In-depth exploration of these applications has only become possible after the establishment of reverse genetics techniques to rescue recombinant viruses from plasmids encoding their complete genomes as cDNA2-5. Viral cDNA can be conveniently modified in vitro by using standard cloning procedures to alter the genotype of the virus and/or to include new transcriptional units. Rescue of such genetically modified viruses provides a valuable tool to understand factors affecting multiple stages of infection, as well as allows for the development and improvement of vectors for the expression and delivery of antigens for vaccination and therapy. Here we describe a protocol for the rescue of recombinant NDVs.

Newcastle disease virus (NDV) has been extensively studied in the last few years in order to develop new vectors for vaccination and therapy, among others. These studies have been possible due to techniques to rescue recombinant virus from cDNA, such as those we describe here.

הצלה של וירוס רקומביננטי ניוקאסל מחלות מcDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE

Host defenses to virus infection are dependent on a rapid detection by pattern recognition receptors (PRRs) of the innate immune system. In the cytoplasm, the PRRs RIG-I and PKR bind to specific viral RNA ligands. This first mediates conformational switching and oligomerization, and then enables activation of an antiviral interferon response. While methods to measure antiviral host gene expression are well established, methods to directly monitor the activation states of RIG-I and PKR are only partially and less well established.
Here, we describe two methods to monitor RIG-I and PKR stimulation upon infection with an established interferon inducer, the Rift Valley fever virus mutant clone 13 (Cl 13). Limited trypsin digestion allows to analyze alterations in protease sensitivity, indicating conformational changes of the PRRs. Trypsin digestion of lysates from mock infected cells results in a rapid degradation of RIG-I and PKR, whereas Cl 13 infection leads to the emergence of a protease-resistant RIG-I fragment. Also PKR shows a virus-induced partial resistance to trypsin digestion, which coincides with its hallmark phosphorylation at Thr 446. The formation of RIG-I and PKR oligomers was validated by native polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Upon infection, there is a strong accumulation of RIG-I and PKR oligomeric complexes, whereas these proteins remained as monomers in mock infected samples.
Limited protease digestion and native PAGE, both coupled to western blot analysis, allow a sensitive and direct measurement of two diverse steps of RIG-I and PKR activation. These techniques are relatively easy and quick to perform and do not require expensive equipment.

Innate defenses to virus infections are triggered by pattern recognition receptors (PRRs). The two cytoplasmic PRRs RIG-I and PKR bind to viral signature RNAs, change conformation, oligomerize, and activate antiviral signaling. Methods are described which allow to conveniently monitor the conformational switching and the oligomerization of these cytoplasmic PRRs.

הפעלת ניטור של התבנית אנטי רצפטורים ההכרה RIG-I ו PKR ידי מוגבל פרוטאז עיכול ועמוד Native

Host defenses to virus infection are dependent on a rapid detection by pattern recognition receptors (PRRs) of the innate immune system. In the cytoplasm, ...

A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells

MicroRNAs (miRNAs) are short RNA molecules that are widespread in eukaryotes. Most miRNAs are transcribed from introns, and their maturation involves different RNA-binding proteins in the nucleus. Mature miRNAs frequently mediate gene silencing, and this has become an important tool for comprehending post-transcriptional events. Besides that, it can be explored as a promising methodology for gene therapies. However, there is currently a lack of direct methods for assessing miRNA expression in mammalian cell cultures. Here, we describe an efficient and simple method that aids in determining miRNA biogenesis and maturation through confirmation of its interaction with target sequences. Also, this system allows the separation of exogenous miRNA maturation from its endogenous activity using a doxycycline-inducible promoter capable of controlling primary miRNA (pri-miRNA) transcription with high efficiency and low cost. This tool also allows modulation with RNA-binding proteins in a separate plasmid. In addition to its use with a variety of different miRNAs and their respective targets, it can be adapted to different cell lines, provided these are amenable to transfection.

We developed an intronic microRNA biogenesis reporter assay to be used in cells in vitro with four plasmids: one with intronic miRNA, one with the target, one to overexpress a regulatory protein, and one for Renilla luciferase. The miRNA was processed and could control luciferase expression by binding to the target sequence.

בדיקת כתב לניתוח התבגרות מיקרו-רנ"א אינטרוניים בתאי יונקים

MicroRNAs (miRNAs) are short RNA molecules that are widespread in eukaryotes. Most miRNAs are transcribed from introns, and their maturation involves ...

Cancer Research

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide cDNA library cloned into the 3'UTR downstream from the dual-selection fusion protein, thymidine kinase-zeocin (TKzeo). The first round of selection is for stable transformants, followed with introduction of a miRNA of interest, and finally, selecting for cDNAs containing the miRNA's target. Selected cDNAs are identified by sequencing (see Figure 1-3 for Target ID Library Workflow and details).
To ensure broad coverage of the human transcriptome, Target ID Library cDNAs were generated via oligo-dT priming using a pool of total RNA prepared from multiple human tissues and cell lines. Resulting cDNA range from 0.5 to 4 kb, with an average size of 1.2 kb, and were cloned into the p3&#900;TKzeo dual-selection plasmid (see Figure 4 for plasmid map). The gene targets represented in the library can be found on the Sigma-Aldrich webpage. Results from Illumina sequencing (Table 3), show that the library includes 16,922 of the 21,518 unique genes in UCSC RefGene (79%), or 14,000 genes with 10 or more reads (66%).

The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide collection of cloned cDNA used to identify miRNA targets. Here we demonstrate its use and application.

הגנום כולו מסך עבור מטרות מירנה שימוש יעד המשימה ספריית מזהה

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Biology

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes. More than 700 human miRNAs have been identified so far with each having up to hundreds of unique target mRNAs. Computational tools, expression and proteomics assays, and chromatin-immunoprecipitation-based techniques provide important clues for identifying mRNAs that are direct targets of a particular miRNA. In addition, 3'UTR-reporter assays have become an important component of thorough miRNA target studies because they provide functional evidence for and quantitate the effects of specific miRNA-3'UTR interactions in a cell-based system. To enable more researchers to leverage 3'UTR-reporter assays and to support the scale-up of such assays to high-throughput levels, we have created a genome-wide collection of human 3'UTR luciferase reporters in the highly-optimized LightSwitch Luciferase Assay System. The system also includes synthetic miRNA target reporter constructs for use as positive controls, various endogenous 3'UTR reporter constructs, and a series of standardized experimental protocols.
Here we describe a method for co-transfection of individual 3'UTR-reporter constructs along with a miRNA mimic that is efficient, reproducible, and amenable to high-throughput analysis.

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and have been shown to play a role in numerous biological processes. To better understand miRNA-UTR interactions, we have created a genome-wide collection of 3 UTR luciferase reporters paired with a novel luciferase gene and assay reagent, the LightSwitch system.

זיהוי מטרות של רנ&quot;א האדם עם מערכת Assay בלוציפראז LightSwitch באמצעות 3&#39;UTR-הכתב בונה microRNA מחקים בתאים חסיד

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

זיהומים arbovirus כמו כלים ההקרנה לצורך זיהוי גורמים אנטי ויראלי Immunomodulators ומנחה

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors (PRRs) such as the retinoic acid (RIG-I) like receptors (RLRs) RIG-I and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA-5) leads to the induction of the innate immune response. The formation and intracellular distribution of dsRNA in positive-sense RNA virus infection has been well characterized by microscopy. Many negative-sense RNA viruses, including some arenaviruses, trigger the innate immune response during infection. However, negative-sense RNA viruses were thought to produce low levels of dsRNA, which hinders the imaging study of PRR recognition of viral dsRNA. Additionally, infection experiments with highly pathogenic arenaviruses must be performed in high containment biosafety level facilities (BSL-4). The interaction between viral RNA and PRRs for highly pathogenic RNA virus is largely unknown due to the additional technical challenges that researchers need to face in the BSL-4 facilities. Recently, a monoclonal antibody (Mab) (clone 9D5) originally used for pan-enterovirus detection has been found to specifically detect dsRNA with a higher sensitivity than the traditional J2 or K1 anti-dsRNA antibodies. Herein, by utilizing the 9D5 antibody, we describe a confocal microscopy protocol that has been used successfully to visualize dsRNA, viral protein and PRR simultaneously in individual cells infected by arenavirus. The protocol is also suitable for imaging studies of dsRNA and PRR distribution in pathogenic arenavirus infected cells in BSL4 facilities.

Double-stranded RNA produced during RNA virus replication can be recognized by pattern recognition receptors to induce an innate immune response. For negative-sense RNA viruses, the interaction between the low-level dsRNA and PRRs remains unclear. We have developed a confocal microscopy method to visualize arenavirus dsRNA and PRR in individual cells.

הדמיה קונאפוקלית של זוגיות גדילי RNA ודפוס זיהוי רצפטורים להדבקת וירוס RNA שלילי-סנס

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...