עבודה זו נתמכה על ידי מענק דוקטורט מאוניברסיטת אנטוורפן VA; המילגה דוקטורט של קרן המדע פלמית (FWO, 11ZI916N) כדי KS; מענקי פרויקט מן FWO (G0D0514N); פעילות מחקרית מתואמת מענק מחקר (GOA), &quot;גישה ביולוגיה מערכות של ליף המורפוגנזה&quot; ממועצת המחקר של אוניברסיטת אנטוורפן; הפולנים ואת המשיכה הבינאוניברסיטאי (IUAP ז / 29, MARS), &quot;תירס ו ארבידופסיס רוט ולירות צמיחה&quot; ממשרד מדיניות המדע הפדרלית הבלגית (BELSPO) כדי GTSB האן Asard, Sizani Bulelani ל &#39;חמאדה AbdElgawad כל תרמו וידאו .

הערה: הפרוטוקול הבא לניתוח קינמטיקה תקף רק עלים במהלך הצמיחה יציבה. זה מצביע על שיעור התארכות עלה יציב ודפוסי מרחב של אורך תא והתרחבות עלה במהלך תקופה של מספר ימים 6. צמח צמיחת 1. ומדידות של דרג התארכות ליף (הימלר) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר עלו בצמיחה יציבה ואת שלב ההתפתחותי של עניין. הערה: יש הבדל בין צמיחה היציבה וצמיחה חוזרת, מה שמרמז תבניות המרחביות דומות על עלים רצופים על אותו ציר. במהלך השלבים המוקדמים של צמיחת שתיל, עלים רצופים בדרך כלל גדלים יותר ויותר מהר בגלל הגודל הגובר של אזור צמיחת 7. למרות כמה תפקידים עלה גבוה יכול להיות דפוס צמיחה דומה 8, זהו שלב חולף העשויים להיות מושפעים על ידי טיפולים תחת חקירה. לכן חשוב להשוות קווי tr<html> eatments ורק על העמדה עלה אותו, למרות שזה ניתן לפתח בזמן אחר. אפילו בקצב התארכות מתמיד, פרופיל שיעור הצמיחה אינו בהכרח זהה בשלבי התפתחותיים שונים. לכן, חשוב לנתח העלים באותו שלב התפתחותי 8, בדרך כלל מוגדר במספר ימים לאחר הופעתה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבצע ניתוח kinematic מלא צמיחה עלה ב monocots, לגדול לפחות 15 צמחים עבור כל טיפול ו גנוטיפ בתנאים מבוקרים בחדר צמיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באותו הזמן העלה של עניין מופיע (הופעתה מן במערבולת של עלים שמסביב), להתחיל למדוד את האורך של העלה יומי עם סרגל עד העלה מורחב מלא (האיור 1i). אורך ליף מרמז על אורך מרמה הקרקע עד קצה העלה. היזהר שלא לשבור או לפגוע עלה, כיוון שזה עלול לשנות את צמיחתה. </li></ol>בתשובה לשאלה 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54,887 / 54887fig1.jpg &quot;/&gt; איור 1:. סקירה סכמטי של ניתוח kinematic עלי תירס העלה של ריבית נמדד עם שליט במשך שלושה ימים רצופים כדי לחשב את שיעור ההתארכות ליף (הימלר). לאחר מכן, העלה שנקטף וקטע שלושה סנטימטר משמש לקביעת גודל meristem. הדבר נעשה על ידי מדידת אורך מהבסיס עד הדמות mitotic הדיסטלי ביותר לאחר מכתים DAPI. (א) דוגמאות של דמויות mitotic שגשוג ו (ב) דמויות mitotic מכוננות. אחד עשרה הסנטימטרים הראשונים מהבסיס עלה בצד השני של הווריד באמצע משמשים לחתוך עשרה קטעים חד-סנטימטר למדידות אורך תא. מדידות אלה מספקים את הבסיס ליצירת פרופיל אורך התא, המשמש כדי לקבוע את אורך התא הבוגר (מחצלת l) ואורך תאים עוזב את meristem (div l). ה <em&gt; הימלר מחצלת l משמשים לחישוב שיעור ייצור תאים (P), בעוד div L ו- L mer משמשים כדי לחשב את מספר התאים meristem (N mer). בתורו, P ו- N mer משמשים לחישוב שיעור חלוקת התא הממוצע (D), שהוא ההופכי של משך מחזור התא (ג T). חצים של אותו הצבע עולים פרמטרים המשמשים לחישוב הפרמטר הבא על החצים האלה. ברי סולם = 40 מיקרומטר. מספרים רומים משמשים להתייחס להליכים ספציפיים ניסיוני כמתואר בפרוטוקול. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54887/54887fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> קציר 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב ההתפתחותי של עניין (למשל, ביום השלישי לאחר הופעתה), לבחור לפחות חמש p נציגlants מהאצווה שעליו לנהל את ניתוח kinematic. המשך מדידת שאר הצמחים כמוסבר בשלב 1.3 כדי לקבוע את אורך הדף האחרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את החלק מעל הקרקע של המפעל. כדי לשמור על חלק meristematic שלם, לחתוך קרוב ככל האפשר אל השורשים (איור 1ii). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל העלים החיצוניים, להסיר את כל העלים עד העלה עניין ידי unrolling אותם אחד בעדינות על ידי אחד. במידת צורך, להסיר כמה מילימטרים נוספים מהבסיס לנתק את העלים. כמו כן להסיר את עלי איפקס קטנים וסגורים על ידי עלה העניין (איור 1iii). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים מקטע 3 ס&quot;מ, החל מבסיס בצד אחד של וריד באמצע, ולאחסן אותו צינור 1.5 מ&quot;ל מבחן מלא 3: 1 (v: v) אתנול אבסולוטי: פתרון חומצה אצטית (זהירות: ללבוש כפפות) ב 4 ° C. במשך 24 שעות עד מספר חודשים (איור 1iv). קטע זה ישמש מאוחר יותר כדי לקבוע את האורך של meristem. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מ הבצד השני של הווריד, לחתוך קטע 11 ס&quot;מ מבסיס (איור 1 נ) ולמקם אותו בתוך שפופרת 15 מ&quot;ל מלא אתנול אבסולוטי ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 6 שעות כדי להסיר פיגמנטים (איור 1 vi). הערה: בהמשך, השתמשו רק 10 הסנטימטרים הראשונים כדי לקבוע את פרופיל אורך תא (ראה דיון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חדשו את אתנול אבסולוטי לסיבוב נוסף של ניקוי על 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 24 שעות (איור 1vi). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, להחליף את אתנול האבסולוטי עם חומצה לקטית טהורה (זהירות: ללבוש כפפות) לניקוי ואחסון ב 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות או עד לשימוש נוסף (איור 1vi). </li></ol> 3. מדידות אורך meristem <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ שטיפה המכילים נתרן כלורי 50 מ&quot;מ (NaCl), 5 מ&quot;מ חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA; זהירות: ללבוש כפפות) ו -10 מ&quot;מ טריס (hydroxymethyl) חומצה aminomethane-הידרוכלורית (טריס-HCl; pH 7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את קטע 3 ס&quot;מ בסעיף 2.4 וכן הלאהAK אותו למאגר במשך 20 דקות (איור 1vii). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן ההמתנה, להשתמש חיץ שטיפה להכין פתרון מכתים 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) של 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל, שמירה על אותה על הקרח בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם הגרעינים ידי צבת במגזר meristem במשך 2-5 דקות בתמיסה המכתימה DAPI. עבודה על הקרח בחושך (איור 1vii). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו אותות קרינה על ידי הרכבה במגזר במהירות על כוס מיקרוסקופיה והמריחה עם מכסה זכוכית. תאי אפידרמיס צריכים להראות קרינה, בעוד שכבות תאי הבסיס לא צריכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם המכתים אינו מספיק, לשים במגזר בחזרה הפתרון המכתים DAPI עבור כמה דקות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעצור את המכתים, הר המגזרים בטיפת שטיפת חיץ בשקופית מיקרוסקופיה ומכסה כיסוי זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מיקרוסקופ מצויד קרינת UV בהגדלת 20X, המאפשר הדמיה של כ -1,000 epidermאל תאים בבת אחת. גלול לאורך קטע ולחפש דמויות mitotic שגשוג (metaphase, anaphase, telophase, ו cytokinesis), אך להימנע חלוקת התא המכונן של (1viii איור) בפיתוח הפיוניות 9. גדר שם דמות mitotic הדיסטלי ביותר ממוקמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את אורך meristem על ידי מדידת המרחק בין הבסיס של העלה והדמות mitotic ביותר דיסטלי אפידרמיס. השתמש תמונות תוכנה לניתוח (למשל, ImageJ) כדי למדוד את אורכו של מסגרת התמונה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר המסגרות שמכסות את אורך meristem המלא (מהבסיס עלה לנתון mitotic הדיסטלי ביותר) ו להכפיל את המספר הזה לפי אורך מסגרת אחת כדי לקבל את אורך meristem המלא (1ix איור). </li></ol></li></ol> 4. פרופיל אורך תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח במגזר המאוחסן חומצה לקטית (שלב 2.5) ולמקם אותו בזהירות על הספסל. חותכים את השנינות מגזריםחה אזמל ב 10 מקטעים של 1 ס&quot;מ כל אחת (איור 1x). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר המגזרים עלו הרצופים בשקופית מיקרוסקופ ב טיפה קטנה של חומצה לקטית. הקפד להתמודד באופן עקבי גם את adaxial או למעלה בצד abaxial. באופן עקרוני, אין העדפת צד מסוים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מיקרוסקופ מצויד התערבות הפרש לעומת זאת אופטיקה (DIC) לנתח את המגזרים, החל מבסיס העלה. מדוד עם תוכנת ניתוח התמונה אורך תאי אפידרמיס לשכפל 20 לפחות ב קבצים סמוכים ישירות לקבצי הפיוניות על מנת לבחור את סוג התא אותו בעקביות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האם זה על עמדות ברווחים שווים לאורך אחד ממגזרי (4 עמדות לכל להספיק קטע), ולוודא כדי לרשום את המיקום המתאים לכל מדידה לאורך (1xi איור) עלה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את אורך התא הממוצע בכל מ&quot;מ לאורך הציר עלה באמצעות p חלקת פולינום מקומיrocedure, ויושם R-סקריפט (איור 1xii; קובץ משלים 1). הערה: The-סקריפט R מספק סדרה של נתונים עם הגדלת חלקה. כמות החלקה הנדרשת היא שרירותית ו אידיאלי צריך רק להסיר את הרעש המקומי, אך לא להשפיע על עקומת הכולל. הקפד להשתמש באותה כמות של החלקה עבור כל הדגימות בתוך בניסוי אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממוצע אורך תא במיקום כל בין צמחים ובעלי לחשב את סטיית התקן ליצור פרופיל אורך התא לאורך ציר עלה. </li></ol> 5. חישובים של פרמטרים קינמטית (ראה משלים קובץ 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את הימלר על ידי לקיחת השינוי באורך עלה בין שתי נקודות זמן רצופות (למשל, 24 שעות, כמו בשלב 1.3) וחלוקתו את מרווח הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשבתי את אורך צמיחת האזור (GZ L) המתאים דיסטלי עמד מהבסיס שבו תאים מגיעים 95% של ce הבוגרת שלהםאורך ll על פרופיל אורך תא smoothened. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח לכל עמדה על% 95 פרופיל אורך תא smoothened של הממוצע של כל אורכי התא הבאים עמדה (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השוואת אורכי תא smoothened (שלב 4.4) עם אורך תא מחושב 95% בכל אחת מעמדות. החל מהבסיס של העלה, אזור הגידול ומסתיים במצב שבו אורך התא בפועל שווה 95% של אורכי התא הבאים (איור 2; לראות משלי נתונים 2). </li></ol></li></ol><img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54887/54887fig2.jpg" /> איור 2:. קביעת מועד לסיום לאזור הצמיחה meristem: במיקום מצוין עם כוכב אדום, גודל התא בפועל הוא קטן מ -95% (קו מקווקו אדום) של גודל התא הממוצע של כל התאים הבאים עמדה זו (אדום מוצק קַו). סופו של אזור הגידול (GZ L; מצוין עם ablue כוכב) ממוקם שבו 95% (קו כחול מנוקד) של גודל התא הממוצע של כל התאים הבאים עמדה זו (הקו הכחול מוצק) שווה לגודל התא בפועל. אגף אזור (D), אזור התארכות (E), ואת האזור הבוגר (M). חצים המקווקווים מציינים ההתכנסות בין הגודל המקומי ו -95% ביחס לגודל הממוצע על החלק הדיסטלי של העלה בעת מעבר מהעמדות הבסיסיות אל קצה העלה. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54887/54887fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את אורך אזור התארכות (L אל) כהפרש בין אורך של אזור הגידול (GZ L) ואת גודל meristem (L mer; נקבע בשלב 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשבתי את אורך התא הבוגר (מחצלת l) כמו אורך תא הממוצע באזור הבוגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את הימלר ידי מחצלת l כדי להשיג אתשיעור ייצור תאים (P). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את מספר התאים באזור התארכות (N אל) כהפרש בין GZ N ו- N mer. מספר תאי meristem (mer N) שווה למספר המצטבר של תאים הממוקמים במרווחים המתאימים meristem. מספר תאים באזור צמיחה (GZ N) שווה למספר המצטבר של תאים הממוקמים במרווחים החופף את אזור הגידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את קצב חלוקת התא הממוצע (ד) כפי mer P / N. משך מחזור התא (ג T) שווה ln (2) / D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הזמן באזור ההתארכות (T אל) על ידי חלוקת N אל ידי P. השעה באזור חלוקה שווה log 2 (mer N) * ג T. אורכו של תאים עוזב את meristem (div l)שווה אורך תא מהפרופיל אורך תא smoothened בסוף של meristem. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את קצב התפשטות תאים הממוצע (R אל) באמצעות הנוסחה הבאה: ln (מחצלת l) -ln (div l)] / T אל. </li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

ניתוח kinematic מלא על עלי תירס מאפשר קביעת הבסיס הסלולר של צמיחה עלה ומאפשר את העיצוב של אסטרטגיות דגימה יעילות. אף על פי הפרוטוקול הוא פשוט יחסית, קצת זהירות מומלצת השלבים הקריטיים הבאים: (1) חשוב לנתק את העלים הצעירים, סגורים (שלב 2.3) מבלי לפגוע meristem, מאז קביעת אורך meristem (שלב 3) מחייב המלא meristem להיות נוכחת. חלק באימון לפני כן ייתכן שיש צורך. (2) קביעת אורך Meristematic מבוססת על פרשנות של דמויות mitotic. לכן, אנו ממליצים כי, בתוך בניסוי אחד, אותו אדם מקיים מדידות אלה כדי להפחית את השונות בשל לפועל. (3) למרות שרק עשרה סנטימטרים משמשים עבור מדידות אורך תא בפועל, חשוב לכלול עשרה סנטימטרים כאשר קצירה במגזר למדידות אורך תא (שלב 2.5), כי הקצה במגזר עושה שוםלא תמיד מלא להטביע באתנול ו / או חומצה לקטית. לכן, סנטימטר נוסף זה מבטיח סליקת העשרה הסנטימטרים הראשונים של אזור הגידול. (4) בסופו של דבר, כדאי לבדוק את התוצאה של כל הפרמטרים קינמטיקה כדי לוודא שהם נכונים. בלוח 3, למשל, קצב ההפקה תא (P) של צמחים-הדגיש הבצורת הוקטנה 71%, או, במילים אחרות, הבצורת P הוא 0.29 השליטה P. מאז ייצור התאים תלוי בשיעור חלוקת תא ממוצע (D; -63%) ואת מספר תאי meristem (N mer; -20%; איור 3), את הדברים הבאים יכולים לשמש כדי לאמת את הפלט: P (0.29) ≈ N mer (0.8) x D (0.37). אותו ניתן ליישם עבור מחצלת לי x הימלר = P. בהתאם מהתקנים הזמינים, הפרוטוקול ניתן לשנות בצעדים מסוימים. (1) יותרחלופת dvanced עבור מדידות אורך עלה היומיות הידניות (בשלב 1.3) מבוססת על מתמר תזוזה לינארית Velocity (LVDTs) 13. היתרון בכך שהיא מאפשרת מדידות ברזולוצית זמן הרבה יותר גבוהה, נעה בין כמה דקות לשניות. (2) זה חיוני לכלול את אזור צמיחה המלא במהלך דגימה. עם זאת, תנאים סביבתיים, גנוטיפ, מינים, ואת השלב ההתפתחותי בחן עשוי לשנות את אורכו של אזור הגידול. לכן, כדאי לעשות ערכה ראשונה של האורך של אזור גידול תגובה לטיפול הניסוי שלך. פרוטוקול זה מבוסס על הקו הטהור B73 גדל ב 25 ° C / 18 ° C (יום / לילה) בשעה 300-400 μEm -2 s -1 (קרינת Active פוטוסינתזה - PAR). (3) על מנת להמחיש את דמויות mitotic (שלב 3.8) מבלי להשתמש קרינה, כתם Fuelgen ניתן ליישם 14. (4) החלקה של הנתונים יכול להיעשות גם ב- MS Excel במקום R באמצעות קואה חמש נקודותdratic הולם עם הפונקציה &quot;LINEST&quot; 15. מגבלה חשובה של טכניקה זו היא כי אזור הגידול כולו צריכה להיות שנקטף במהלך הצמיחה יציבה. על מנת להבטיח צמיחה יציבה, צמחים אידיאליים חייבים להיות מבוגרים בתנאי גידול מבוקרים, כי התנודות עוצמות אור, טמפרטורה, לחות או להשפיע על שער ההתארכות עלה 16. מסיבה זו, ניתוח קינמטיקה הוא פחות מתאים צמחים הגדלים בתנאי שדה. חיסרון נוסף הוא כי העלים צריכים להיות הגיח, מה שהופך את זה בלתי אפשרי לבחון עלים שעדיין מוקפת עלים מבוגרים. לבסוף, הפרוטוקול מתאים מיני monocotyledonous עם אזורי צמיחה גדולים המקיפים לפחות כמה סנטימטרים. ניתוח kinematic על monocots קטן (למשל, פואה, אורז), לעומת זאת, אינו ריאלי אבל צריך קצת שינויים בהכנת מדגם 17,18. עוד מרבה להשתמשד גישה לנתח פנוטיפים צמיחת הפרש הוא ניתוח צפי גידול הקלסי. ניתוח זה מכמת שיעורי צמיחה יחסיים כולה צמח וקובע ההקצאה הבסיסית של פחמן פוטוסינתטיים נגזר לאזור פוטוסינתטיים חדש לחלקים אחרים של הצמח 19. הניתוח קינמטיקה, לעומת זאת, מאפשר הבנה מפורטת יותר של תהליכים תאיים שבבסיס כי הם מצמידים את פנוטיפים צמיחה בהתבסס על לכימות חלוקת התא והתרחבות. יתר על כן, האפשרות לקבוע את משך הזמן של כל אזור צמיחה מאפשרת המתאם של מדידות מולקולריות לאורך הציר עלה לשלב ההתפתחותי הספציפי מושפע הטיפול נחקר. זה קריטי עבור נתונים לפרשנות. כאשר מוגבל בזמן או תקציב או כאשר מעוניינים בשלבים התפתחותיים ספציפיים, התוצאה של ניתוח זה מאפשר דגימה ממוקדת, צמצום מספר דגימות הנדרש לניתוח. לסיכום, ניתוח kinematic לאפשרזה קביעת הפרמטרים הסלולר הבסיסיים תגובות דחק וריאציה גנטית בצמיחה עלה יכול לקשר אותם במעלה זרם תהליכים רגולטוריים (טבלה 2).

ניתוח צמיחה תלוי סט של כלים המשמשים בדרך כלל על ידי מדעני צמח לתאר הבדלי צמיחה ו / או תשובות פנוטיפי נקבע גנוטיפ לגורמים סביבתיים. הם כוללים מדידות גודל ומשקל של הצמח כולו או איבר וחישובי שיעורי צמיחה לחקור את המנגנונים של צמיחה. צמיחת איברים נקבעת על ידי חלוקת תא והרחיב ברמה התאית. לכן, כולל הכימות של שני תהליכים אלו בצמיחת המנתח הוא מפתח להבנת הבדלים בצמיחה כולו באיברי 1. כתוצאה מכך, חשוב להיות בעל במתודולוגיה לקבוע פרמטרי צמיחה הסלולר כי הוא יחסית קל לשימוש על ידי מעבדות ללא התמחות. ניתוח קינמטית כבר קמה, כגישה מתן מסגרת רבת עוצמה לפיתוח מודלים של גידול איברים 2. הטכניקה כבר אופטימיזציה עבור מערכות לינאריות,כמו שורשי ארבידופסיס thaliana ועלי monocotyledonous, אלא גם למערכות שאינן ליניארי, כגון עלי dicotyledonous 3. כיום, מתודולוגיה זו נמצאת בשימוש יותר ויותר כדי ללמוד איך גנטי, הורמונלית, התפתחותיים, וגורמים סביבתיים משפיעים חלוקת תא והרחיב באיברים שונים (טבלה 1). יתר על כן, הוא גם מספק מסגרת לקשר תהליכים תאיים לתקנות ביוכימיים, מולקולריות, ופיזיולוגיים הבסיסיות שלהם (טבלה 2), למרות מגבלות שניתן להטיל לפי גודל איבר וארגון מרחבי טכניקות הדורשות כמויות גדולות יותר של חומר צמחי (למשל, המטבוליט מדידות, פרוטאומיקה, וכו &#39;). עלי Monocotyledonous, כגון התירס (Zea Mays) עלה, מייצגים מערכות ליניאריות שבו תאים להעביר מהבסיס של העלה כלפי הקצה, ברצף עוברים דרך אזור meristem ואת ההתארכות להגיע הבוגרתאֵזוֹר. זה עושה את זה מערכת מודל אידיאלית עבור מחקרים כמותיים של התבניות המרחביות של צמיחה 4. יתר על כן, עלי תירס יש אזורי צמיחה גדולים (meristem אזור התארכות פורשים כמה סנטימטרים 5) ולספק אפשרויות ללימודים ברמות ארגוניות אחרות. זה מאפשר חקירת מנגנוני הוויסות (המשוערים) שליטת חלוקת תא ורחב, לכמת ידי ניתוח kinematic באמצעות מגוון של שיטות מולקולריות, מדידות פיסיולוגיות, וגישות ביולוגיה של תא (טבלה 2). כאן, אנו מספקים פרוטוקול לביצוע ניתוח kinematic בעלי monocot. ראשית, נסביר כיצד לבצע ניתוח נכון של שני חלוקת התא ואת התארכות התא כפונקציה של המיקום לאורך ציר עלה וכיצד לחשב פרמטרים קינמטיקה. שנית, אנחנו גם להראות איך זה יכול לשמש כבסיס לעיצוב דגימה. כאן, אנו דנים בשני מקרים: דגימה ברזולוציה גבוהה<html> ד ממוקד דגימה, המאפשר פרשנות נתונים משופרות ולחיסכון בזמן / כסף, בהתאמה. סקירת טבלת 1. קינמטיקה מנתח שיטות כימות של חלוקת תא והרחבה באיברים שונים. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> אֵיבָר </td><td> התייחסות </td></tr><tr><td> עלי monocotyledonous </td><td> 16, 20, 21, 22 </td></tr><tr><td> טיפים שורש </td><td> 2, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 </td></tr><tr><td> עלי dicotyledonous </td><td> 21, 30, 31 </td></tr><tr><td> לירות meristem הפסגה </td><td> 32 </td></tr></tbody></table> סקירת טבלת 1. קינמטיקה מנתח שיטות כימות של חלוקת תא והרחבה באיברים שונים. ther.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54887/54887table2.jpg" /> קישור טבלה 2. בין תהליכים תאיים לכמת ידי ניתוח kinematic לרגולציה שלהם ברמה המולקולרית. הפניות למחקרים שונים מקשרים כימות של תהליכים תאיים לתוצאות מבחני ביוכימיים ומולקולריים במינים ואיברים שונים. Endotransglucosylase Xyloglucan (XET), malondialdehyde (מד&quot;א), קינאזות תלויות-ציקלין (CDK). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54887/54887table2large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הטבלה.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1670">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Pots</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td style="width:813px;">We use pots with the following measueres, but can be different depending on the treatment/study : bottom diameter: 11cm, opening diameter: 15 cm, height: 12 cm. We grow one maize plant per pot.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Planting substrate</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td>We use potting medium (Jiffy, The Netherlands), but other substrates can be used, depending on treatment/study.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Ruler</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td>An extension ruler that covers at least 1,5 meters is needed to measure the final leaf length of the plants.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Seeds&#160;</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">NA</td>
			<td>Seeds can be ordered from a breeder.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Scalpel</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td style="width:813px;">The scalpel is used during leaf harvesting to detach the leaf of interest from its surrounding leaves and right after harvesting to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">15 ml falcon tubes</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td style="width:813px;">The 15 ml falcon tubes are used for storing samples used for cell length measurements during sample clearing with absolute ethanol and lactic acid.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td style="width:813px;">The eppendorf tubes are used for storing samples used for meristem length measurements in ethanol:acetic acid 3:1 (v:v) solution.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Gloves</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td>Latex gloves, which protect against corrosive reagents.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td style="width:813px;">CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1; Flammable liquids, categories 1,2,3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Absolute ethanol</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td style="width:813px;">CAUTION: Hazardous in case of skin contact (irritant), of eye contact (irritant), of inhalation. Slightly hazardous in case of skin contact (permeator), of ingestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Lactic acid &#62;98%</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td>CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td style="width:813px;">CAUTION: Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), category 4 Skin irritation, category 2 Eye irritation, category 2 Skin sensitisation, category 1 Specific Target Organ Toxicity &#8211; Single exposure, category 3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride (Tris-HCl)</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td style="width:813px;">This material can be an irritant, contact with eyes and skin should be avoided. Inhalation of dust may be irritating to the respiratory tract.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">4&#8242;,6-Diamidine-2&#8242;-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td style="width:813px;">Cell permeable fluorescent minor groove-binding probe for DNA. Causes skin irritation. May cause an allergic skin reaction. May cause respiratory irritation.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Ice</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">NA</td>
			<td>The DAPI solution has to be kept on ice.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Fluorescent microscope</td>
			<td>AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td>Any fluorescent microscope can be used for determining meristem length.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Microscopic slide</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Cover glass</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Tweezers</td>
			<td style="width:333px;">Any</td>
			<td style="width:209px;">Any</td>
			<td style="width:813px;">Tweezers are needed for unfolding the rolled maize leaf right after harvesting in order to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Image-analysis software</td>
			<td>Axiovision (Release 4.8) from Zeiss</td>
			<td style="width:209px;">NA</td>
			<td style="width:813px;">The software can be downloaded at: http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/axiovision.html. Other softwares such as ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) could be used as well.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Microscope equipped with DIC</td>
			<td>AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td>Any&#160; microscope, equipped with differential interference contrast (DIC) can be used to measure cell lengths.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">R statistical analysis software</td>
			<td>R Foundation for Statistical Computing</td>
			<td style="width:209px;">NA</td>
			<td>Open source; Could be downloaded at https://www.r-project.org/</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:315px;">R script</td>
			<td style="width:333px;">NA</td>
			<td style="width:209px;">NA</td>
			<td style="width:813px;">We use the kernel smoothing function locpoly of the Kern Smooth package (Wand MP, Jones MC.&#160; Kernel Smoothing: Chapman &#38; Hall/CRC (1995)). The script is available for Mac and Windows upon inquire with the corresponding author. We have versions for Mac and Windows.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kinematic analysis of cell division and expansion: quantifying the cellular basis of growth and sampling developmental zones in zea mays leaves

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of these analyses is of crucial importance, because growth is driven by cell division and cell elongation. Kinematic analysis represents a methodology to quantify these two processes. Moreover, this technique is easy to use in non-specialized laboratories. Here, we present a protocol for performing a kinematic analysis in monocotyledonous maize (Zea mays) leaves. Two aspects are presented: (1) the quantification of cell division and expansion parameters, and (2) the determination of the location of the developmental zones. This could serve as a basis for sampling design and/or could be useful for data interpretation of biochemical and molecular measurements with high spatial resolution in the leaf growth zone. The growth zone of maize leaves is harvested during steady-state growth. Individual leaves are used for meristem length determination using a DAPI stain and cell-length profiles using DIC microscopy. The protocol is suited for emerged monocotyledonous leaves harvested during steady-state growth, with growth zones spanning at least several centimeters. To improve the understanding of plant growth regulation, data on growth and molecular studies must be combined. Therefore, an important advantage of kinematic analysis is the possibility to correlate changes at the molecular level to well-defined stages of cellular development. Furthermore, it allows for a more focused sampling of specified developmental stages, which is useful in case of limited budget or time.

הנה, אנחנו מראים השוואה בין צמחים מושקים (שליטה, 54% תכולת מים בקרקע, (SWC)) וצמחים נתונים בתנאי עקת בצורת (בצורת, 34% SWC) במונחים של צמיחת העלה שלהם. כל הצמחים גדלו בתא צמיחה בתנאים מבוקרים (16 שעות ביום / 8 שעות בלילה, 25 ° C / 18 ° C יום / לילה, 300-400 μEm -2 שניות -1 photosynthetically הקרינה פעילה (PAR). תנאי הבצורת הוקמו על ידי מניעת מים עד הנכון SWC הושג ולאחר מכן עוד נשמר. במחקר ראשוני, הוא הוגדר כי עלה החמישי הוא אחד הראשונים מתעוררים ומתפתחים בתנאי הלחץ הזה. לכן, נבחר עלה של הריבית. שהאורך ליף הסופי (LL) של הצמחים-הדגיש בצורת הייתה 40% נמוכה יותר מזו של הצמחים להשקות היטב, אשר נבע הימלר נמוך (לוח 3). כדי להבין את הבסיס התאי של לאהבתגובה צמיחה f, ביצענו ניתוח kinematic. בסך הכל, שיעור התארכות עלה הוא פונקציה של ייצור תא meristem וגודל תא בוגר שנקבע אזור ההתארכות (איור 3). לכן, הקיצור של העלה חייב להיות בשל השפעות על אחד או שני פרמטרים אלה. התוצאות שלנו מראות כי בעוד אורך התא הבוגר (מחצלת יב) לא נפגע, קצב הפקת תא (P) הופחת ב -71% (לוח 3). מחצלת l תלויה באורך של התאים עוזבים את meristem (div l) , הזמן התאים האלה מבלים באזור התארכות (T אל), ושיעור הרחבת התא יחסית (R אל). אין השפעה נצפתה div l, בעוד R אל הופחת ב -67% בתנאי יובש. השפעה זו פוצתה כמעט שולש T אל, אשר הביא את המחצלת באותו l &lt;/ Sub&gt; כמו את תנאי השליטה. הקיטון בשיעור ייצור תאים היה, בתורו, גרם הוא בשיעור חלוקת תא ממוצע נמוך יותר (D) ויש עוד מספר קטן של תאי meristem (mer N). אורך meristem (L mer) הופחת בניגוד אורך אזור הגידול (GZ L), אשר לא הושפע באופן משמעותי. לסיכום, תוצאות אלו מראות כי במקרה זה, מספר תאים, בניגוד גודל תא, היה תפקיד מרכזי בקביעת גודל עלה. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פרמטרים קינמטית </td><td> C </td><td> D </td><td> CD שינוי% </td><td> p-value </td></tr><tr><td> LL </td><td> 727 ± 15 </td><td> 436 ± 23 </td><td> -40 </td><td> 0.000 </td></tr><tr><td> הימלר (מ&quot;מ / שעה) </td><td> 2.8 ± 0.1 </td><td> 0.8 ± 0.0 </td><td> -73 </td><td> 0.000 </td></tr><tr><td> מחצלת l (מיקרומטר) </td><td> 140 ± 3 </td><td> 130 ± 6 </td><td> -7 </td><td> NS </td></tr><tr><td> P (תאים / h) </td><td> 20 ± 1 </td><td> 6 ± 0 </td><td> -71 </td><td> 0.000 </td></tr><tr><td> D (תאים · תא -1 · -1 hr) </td><td> 0.028 ± 0.003 </td><td> 0.010 ± 0.001 </td><td> -63 </td><td> 0.000 </td></tr><tr><td> ג T (HR) </td><td> 26 ± 3 </td><td> 71 ± 7 </td><td> 173 </td><td> 0.000 </td></tr><tr><td> Div T (HR) </td><td> 249 ± 27 </td><td> 656 ± 71 </td><td> 164 </td><td> 0.000 </td></tr><tr><td> L mer (מ&quot;מ) </td><td> 15 ± 1 </td><td> 11 ± 1 </td><td> -25 </td><td> 0.010 </td></tr><tr><td> N mer </td><td> 740 ± 31 </td><td> 590 + 20 </td><td> -20 </td><td> 0.000 </td></tr><tr><td> R el (מיקרומטר · מיקרומטר <sup&gt; -1 · hr -1) </td><td> 0.043 ± 0.002 </td><td> 0.014 ± 0.001 </td><td> -67 </td><td> 0.000 </td></tr><tr><td> div l (מיקרומטר) </td><td> 24 ± 2 </td><td> 23 ± 2 </td><td> -4 </td><td> NS </td></tr><tr><td> T אל (HR) </td><td> 42 ± 2 </td><td> 125 ± 11 </td><td> 199 </td><td> 0.000 </td></tr><tr><td> N אל </td><td> 844 ± 54 </td><td> 735 ± 65 </td><td> -13 </td><td> NS </td></tr><tr><td> L ז z (מ&quot;מ) </td><td> 68 ± 1 </td><td> 61 ± 5 </td><td> -11 </td><td> NS </td></tr><tr><td> N ז z </td><td> 1584 ± 33 </td><td> 1326 ± 66 </td><td> -16 </td><td> 0.010 </td></tr></tbody></table> לוח 3. ניתוח קינמטית על חלוקת תאי הרחבת תא במהלך הצמיחה היציבה של העלה החמישי. צמחים וצמחי היטב להשקות נתון הבצורת מתח הנתונים הנם ממוצעים ± SE (n = 5 עבור LL: n = 10). מבחן t שימש ניתוח סטטיסטי. פרמטרים: אורך עלה (LL), שיעור התארכות עלה (הימלר), אורך תא בוגר (מחצלת l), קצב ההפקה תא (P), שיעור חלוקת התא (ד), משך מחזור התא (ג T), משך האימון בטווח החלוקה ( T div), אורכו של meristem (mer L), מספר תאים meristem (N mer), שיעור התארכות התא יחסית (R אל), אורכו של תאים עוזב את meristem (div l), זמן באזור התארכות (T אל), מספר התאים באזור ההתארכות (N אל), אורכו של אזור הגידול (GZ L), מספר התאים באזור הצמיחה (GZ N), תנאים-להשקות היטב (C), מתח בצורת ( D), גידול<html> ד לא משמעותי (NS). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54887/54887fig3.jpg" /> איור 3:. קשר בין פרמטרי קינמטיקה אורכו העלה הסופי (LL) תלוי בשיעור ההתארכות ליף (הימלר), אשר בתורו תלוי ייצור התאים (P) ואורך תא בוגר (מחצלת l). מספר התאים meristem (mer N) והמחיר חלוקת התא (ד) יחד לקבוע P, עם (ג T) משך מחזור התא כמו ההופכי של D. זמן באזור התארכות (T אל), אורך של תאים עוזב את meristem (div l), ושיעור הרחבת התא יחסית (R el) לקבוע את אורך התא הבוגר (מחצלת l). מספר התאים באזור ההתארכות (N אל)..jove.com / קבצים / ftp_upload / 54,887 / 54887fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. בנוסף היישום שלה כמו ניתוח מפורט של צמיחה איברים, ניתוח kinematic מספק מפה של לוקליזציה אזור עלה צמיחה מאפשר דגימה עם רזולוציה subzonal עבור מולקולרית ביוכימיים מנתח 4,10,11. כדוגמה, איור 4 א מראה malondialdehyde (מד&quot;א) כימות לאורך אזור הצמיחה של העלה תירס בצמחים נתון באותם תנאים כמו לעיל. מד&quot;א הוא מטבוליט משני נוצרו במהלך חמצון של שומנים על ידי ROS ומשקף את רמות של נזק חמצוני 12. מד&quot;א נמדד בכל סנטימטר של העלה, החל מבסיסו, אשר אפשר ניתוח של שינויי ריכוז לאורך שיפוע הצמיחה 11. כטיפול הבצורת גרמה לקיצור עלה 40%, אורכו של אזורי התפתחותית (Meriגזע, אזור התארכות, אזור המבוגר) במפעלי הביקורת לא להתאים את האורך הזהים האזורים ב הבצורת הדגישה צמחים (איור 4B). כפי שניתן לראות באיור 4B, את meristem במפעלי המלא היה ארוך כ -1.5 סנטימטר, ואת אזור ההתארכות והקיף מ 1.5 כדי 6.8 סנטימטרים מבסיס העלה. בשאר המפעלים הדגיש, את meristem היה מקומי מן 0 כדי 1.1 ס&quot;מ ואת אזור התארכות מן 1.1 כדי 6.1 ס&quot;מ. רמות מד&quot;א אזור הגידול כולו הוגדלו בצמחים-הדגיש בצורת בהשוואה לטיפול ביקורת. בעזרת ניתוח קינמטיקה, נוכל להסיק כי תוכן מד&quot;א הוגדל במיוחד באזור הבוגר לשני טיפולים מלאי בצורת. בלי לדעת את הגדלים של אזורי התפתחותית, היינו מסיק כי, תחת לחץ בצורת, מגדילת תוכן מד&quot;א שלב התפתחותי מוקדם יותר מאשר הצמחים השליטים, וזה לא תהיה בסדר כפי שהוא אינו לוקח בחשבון את ההסטה של ​​האזורים בשל ל- tהוא קיצור עלה. לכן, ביצוע ניתוח kinematic לפני מדידות ביוכימיים היה חשיבות מכרעת על מנת לפרש את הנתונים בצורה נכונה. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54887/54887fig4.jpg" /> איור 4: דוגמא של מדידות ביוכימיות ברזולוציה גבוהה דגימה לניתוח ממוקד (א) Malonaldehyde ריכוזים (מד&quot;א) נמדדו לאורך אזור הצמיחה עלה תירס (מחולק לעשרה קטעים) של צמחים הגדלים במצב רווי מים וצמחים נתונים בצורת. טיפול 10. הנתונים הם ממוצעים ± SE (n = 5). דו כיוונית ANOVA שימש ניתוח סטטיסטי, ו- p-הערכים מוצגים ליד לוח גרף (גורמים: הבצורת (ד) מגזר (ים)); FW: משקל טרי. (ב) ויזואליזציה של אזורי הגידול השונים בשליטה וצמחים-הדגיש בצורת. אגף אזור (D), אזור התארכות (E), ואזור בוגר (M). תאים מוגדלים 125 פעמים. (C) תא באורך פרופיל שליטה וצמחים שטופל בצורת. הנתונים הם ממוצעים ± SE (n = 5). הבדלים (D) ב דגימה ממוקדת בשני מלא צמחים שטופל בצורת. את הקופסות הכחולות מציינות את מיקום דגימה להשוות אותה לשלב ההתפתחותי בשני הטיפולים. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54887/54887fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> בנוסף מתן האפשרות להשוות אותה אזורי התפתחותיות במחקרים ברזולוציה גבוהה, ניתוח kinematic יכול לשמש גם כבסיס ניתוחים ממוקדים יותר, שבו רק דגימות של אזורים ספציפיים המכילים תאים באותו שלב התפתחותי נלקחות. השווינו את פרופילי אורך תא, שמספקים החלקה של מדידות אורך תא המיקרוסקופיות, בעשרה ג הראשוןentimeters מבסיס העלה של מלאת צמחים-הדגיש בצורת. איור 4C מראה כי, באמצעות פרופיל אורך תא, נוכל לקבוע את האורך של אזורי התפתחותיים גם יכולים לעקוב אחר דינמיקת קצב הצמיחה היא בשליטה וצמחים-הדגיש בצורת. זה אפשר דגימה ספציפית של מתרבי תאי meristem (לפני העלייה החדה), הרחבת תאים באזור ההתארכות (באמצע העלייה החדה) ותאי בוגרת צעיר באזור הבוגר (תחילת הרמה). התוצאות שלנו מראות כי, בשל הקיצור עלה בתגובת הבצורת, באזורים אלה לא מתאימים בבקרה וב הצמחים הדגישו. על מנת לדגום מתרבים, מתרחב, תאי בוגרים צעירים בצמחים שליטים, אנו זקוקים הראשון, חמישי, ו הסנטימטר תשיעי מבסיס העלה, בהתאמה. עם זאת, ב הצמחים הדגישו, מקטעים אלה מתאימים הסנטימטר הראשון, רביעי, והשמיני בהתאמה. סוג זה של יותר ממוקדהדגימה הוכיחה להיות שימושי במקרה של מייגע יותר, יקר, או זמן רב מחקרים, כגון רצף RNA, פרוטאומיקה, metabolomics, וכו &#39; קובץ 1 משלים:. R-סקריפט עבור החלקת פולינום <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54887/Supplementary_Data_1.docx" target="_blank">אנא לחץ על זכות להוריד את הקובץ.</a> קובץ 2 משלים:. חישובים של פרמטרים קינמטיקה <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54887/Supplementary_Data_2.xlsx" target="_blank">אנא לחצו על זכות להוריד את הקובץ.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves at JoVE.com

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Quantifying cell division and expansion is of crucial importance to the understanding of whole-plant growth. Here, we present a protocol to calculate cellular parameters determining maize leaf growth rates and highlight the use of these data for investigating molecular growth regulatory mechanisms by directing developmental stage-specific sampling strategies.

ניתוח קינמטית של חטיבה ואת הרחבת תא: כימות הבסיס הנייד של אזורי התפתחותית צמיחת הדגימה<em&gt; Zea Mays</em&gt; מותיר

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of ...

kinematic-analysis-cell-division-expansion-quantifying-cellular-basis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

10.8K Views.  University of Antwerp. Quantifying cell division and expansion is of crucial importance to the understanding of whole-plant growth. Here, we present a protocol to calculate cellular parameters determining maize leaf growth rates and highlight the use of these data for investigating molecular growth regulatory mechanisms by directing developmental stage-specific sampling strategies. 

Video: Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

וידאו ביואינפורמטיקה ניתוח גדילה אנושי בתאי גזע עובריים קולוני

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

מערכת ל<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; Culturing של לבלב עוברי

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Flow cytometry has been widely used to obtain information about DNA content in a population of cells, to infer relative percentages in different cell cycle phases. This technique has been successfully extended to the mitotic tissues of the model organism Drosophila melanogaster for genetic studies of cell cycle regulation in vivo. When coupled with cell-type specific fluorescent protein expression and genetic manipulations, one can obtain detailed information about effects on cell number, cell size and cell cycle phasing in vivo. However this live-cell method has relied on the use of the cell permeable Hoechst 33342 DNA-intercalating dye, limiting users to flow cytometers equipped with a UV laser. We have modified this protocol to use a newer live-cell DNA dye, Vybrant DyeCycle Violet, compatible with the more common violet 405nm laser. The protocol presented here allows for efficient cell cycle analysis coupled with cell type, relative cell size and cell number information, in a variety of Drosophila tissues. This protocol extends the useful cell cycle analysis technique for live Drosophila tissues to a small benchtop analyzer, the Attune Acoustic Focusing Cytometer, which can be run and maintained on a single-lab scale.

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

A protocol for cell cycle analysis of live Drosophila tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer is described. This protocol simultaneously provides information about relative cell size, cell number, DNA content and cell type via lineage tracing or tissue specific expression of fluorescent proteins in vivo.

ניתוח מחזור תא חי של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רקמות באמצעות התמקדות Cytometer אקוסטית לכוונן וה-DNA ויולט Vybrant DyeCycle כתם

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

ניתוח ציטולוגית של תאי זרע: הכנות בשידור חי והקבועות של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אשכים

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

בידוד ופיזיולוגי ניתוח של שריר לב העכבר

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

הכינון מחדש של השפלה β-catenin ב<em&gt; Xenopus</em&gt; חלץ ביצה

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

מעקב וכימות תהליכים התפתחותיים ב<em&gt; C. elegans</em&gt; שימוש בכלי קוד פתוח

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

A Morphometric and Cellular Analysis Method for the Murine Mandibular Condyle

The temporomandibular joint (TMJ) has the capacity to adapt to external stimuli, and loading changes can affect the position of condyles, as well as the structural and cellular components of the mandibular condylar cartilage (MCC). This manuscript describes methods for analyzing these changes and a method for altering the loading of the TMJ in mice (i.e., compressive static TMJ loading). The structural evaluation illustrated here is a simple morphometric approach that uses the Digimizer software and is performed in radiographs of small bones. In addition, the analysis of cellular changes leading to alterations in collagen expression, bone remodeling, cell division, and proteoglycan distribution in the MCC is described. The quantification of these changes in histological sections - by counting the positive fluorescent pixels using image software and measuring the distance mapping and stained area with Digimizer - is also demonstrated. The methods shown here are not limited to the murine TMJ, but could be used on additional bones of small experimental animals and in other regions of endochondral ossification.

This manuscript presents methods for analyzing morphometric and cellular changes within the mandibular condyle of rodents.

Morphometric ושיטת ניתוח הסלולר עבור המפרקתי הנמוך מאתר הלסת

The temporomandibular joint (TMJ) has the capacity to adapt to external stimuli, and loading changes can affect the position of condyles, as well as the ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

ניתוח של תפקוד תאי בטא באמצעות הדמיה הסידן בתא יחיד ברזולוציה איונים דג זברה

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

זריקות פואפאל ומבוגרים לעריכת גנים RNAi ו- CRISPR בנסוניה ויטריפניס

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

ניתוח קינמטית של חטיבה ואת הרחבת תא: כימות הבסיס הנייד של אזורי התפתחותית צמיחת הדגימה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

וידאו ביואינפורמטיקה ניתוח גדילה אנושי בתאי גזע עובריים קולוני

מערכת ל

ניתוח מחזור תא חי של

ניתוח ציטולוגית של תאי זרע: הכנות בשידור חי והקבועות של

בידוד ופיזיולוגי ניתוח של שריר לב העכבר

הכינון מחדש של השפלה β-catenin ב

מעקב וכימות תהליכים התפתחותיים ב

Morphometric ושיטת ניתוח הסלולר עבור המפרקתי הנמוך מאתר הלסת

ניתוח של תפקוד תאי בטא באמצעות הדמיה הסידן בתא יחיד ברזולוציה איונים דג זברה

זריקות פואפאל ומבוגרים לעריכת גנים RNAi ו- CRISPR בנסוניה ויטריפניס