This work was supported by NIH grant R01 CA148673 (NH); the Ontario Institute for Cancer Research Clinical Investigator Award IA-039 (NH); BioCanRX Catalyst Grant (NH); The Princess Margaret Cancer Foundation (MOB, NH); Canadian Institutes of Health Research Canada Graduate Scholarship (TG); Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Postgraduate Scholarship (TG); Province of Ontario (TG, MA); and Guglietti Fellowship Award (TO). HLA and CD1d monomers were kindly provided by the NIH tetramer core facility.

1. הכנת retroviral לבנות קידוד TCR Hemichain עניין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Linearize וקטור PMX לאפשר החדרה של גנים TCR בשלבים הבאים. לעכל את ה- DNA פלסמיד עם אנזימי הגבלה EcoRI ו NotI ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות (טבלה 1) 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע אלקטרופורזה של פלסמיד מתעכל על 1.2% ג&#39;ל agarose. להקה ובלו של כ -4,500 זוגות בסיסים (bps), ו elute ב 30 μl מים סטריליים באמצעות ערכות חילוץ ג&#39;ל זמינות מסחרי 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פריימרים עיצוב 5 &#39;ו 3&#39; עבור הגן TCR של עניין כי גם לקודד 15-20 bps חופפים באתר העיכול EcoRI ו NotI של וקטור PMX, בהתאמה 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר גן TCR עם פריימרים. לבצע אלקטרופורזה של מוצר ה- PCR הלהקה elute של כ -1,000 bps כמתואר בשלב 1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Clone גן TCR לתוך וקטור מתעכל על ידי שילוב כל שבר ליניארי עם פלסמיד זמין מסחריהרכבת מיקס מאסטר מגיב דוגר על 50 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה. הערה: עיין הפרוטוקול של היצרן עבור כרכים יחסיים של כל רכיב. שיטת ההרכבה זה מבוסס על הטכניקה המתוארת במקור על ידי גיבסון et al. 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונלי) הגן תג TCR לציון transduced תאים עם בגרסה מקוצרת של קולטן גורם הגדילה העצבי האדם (ΔNGFR, חומצות אמינו 1-277) 11 מופרדות האתר מחשוף furin, מקשר גליצין-סרין, ו 2A רצפים 12,13. רצפים קידוד פריימרים עיצוב חופפים את הקצוות שבר ולהרכיב פלסמיד כמתואר בשלבים 1.3-1.5. הערה: אלה רצפים ניתן למצוא אזכור 11-13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transform כימי המוסמכות E. coli עם פלסמיד התאסף באי הפרוטוקול של יצרן 14. זרע טרנספורמציה חיידקים על צלחות אגר (20 מ&quot;ג / מרק lysogeny מ&quot;ל (LB), 15 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​אגר, ו 1 מיקרוגרם / אמפיצילין מ&quot;ל) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות מושבה חיידק יחיד 50 מ&quot;ל של מדיום LB (20 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​LB ו 1 מיקרוגרם / אמפיצילין מ&quot;ל) במשך 16 שעות בתוך חממה רועד ב 37 ° C ו -200 סיבובים לדקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר פלסמידים באמצעות ערכות midiprep זמינות המסחרי הבאות הפרוטוקול של היצרן. לדלל פלסמיד ריכוז של כ 1 מיקרוגרם / μl. הערה: פרוטוקול הטיהור פלסמיד מבוסס על שיטת חילוץ אלקליין 15. </li></ol> 2. יצירת שורת תאי אריזה יציבה הערה: שניהם 293GPG ו PG13 תאים חסידים. תאי תרבות הבינוני הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת סרום עובר עגל 10% (FCS) ו -50 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין. תרבות תאי 293GPG עם 1 מיקרוגרם / מיליליטר טטרציקלין לפני transfection. דגירת תאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 בין כל השלבים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect 293GPG אריזה תאים 16 בתרבית בבקבוק T75 עם וקטור hemichain קידוד שהושגו בשלב 1.9, using מגיב transfection זמין בעקבות פרוטוקול 1 7 של היצרן מסחרי. הערה: תאים Transfect 293GPG ב 50-60% confluency. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב בינוני עבור 293GPG תאים ולהוסיף 10 מ&quot;ל של transfection פוסט יום בינוני 1 טרי DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר מיוצר וירוס זמני מתאי 293GPG טרנספקציה 2 ימים לאחר שלב 2.2 באמצעות העברת בינוני תרבות מזרק עובר דרך 0.45 מיקרומטר הסינון. הערה: וירוס ניתן להשתמש מיד או לאחסן ב -80 ° C לשימוש עתידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות 1 x 10 5 PG13 תאי בקבוק T25. ספירת תאים באמצעות hemocytometer. אחרי יום אחד, בינוני תרבות לשאוב ולהוסיף 1.5 מ&quot;ל של וירוס 293GPG הנגזרות משלב 2.3 ו -1.5 מ&quot;ל DMEM בינוני, יחד עם 8 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של polybrene. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי המדיום כמתואר בשלב 2.4 פעם ביום במשך 4 ימים, להקים רטרו-וירוס לייצר קו תא אריזת PG13 יציב קידוד hemichain עניין TCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב בינוני ולהחליףעם מדיום DMEM טרי עבור שורות תאי PG13 24 שעות לאחר ההדבקה האחרונה לתרבות נוספת. הערה: להקפיא או תת-תרבות תאים על ידי ניתוק עם 0.05% טריפסין-EDTA פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לייצר וירוס שורות תאים transduced PG13, תרבות 2 x 10 6 תאים T75 בקבוקון עם 10 מ&quot;ל DMEM בינוני, ווירוסים הקציר כמתואר בשלב 2.3 שלושה ימים לאחר זריעת התאים. הערה: וירוס עדיף להשתמש מיד אבל יכול להיות מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס למשך עד חודשיים. </li></ol> 3. הפעלה ו התמרה של תאים האנושיים T הערה: דגימות אדם מתקבלות ומשומשות בהתאם הפרוטוקולים שאושרו בועדת אתיקה של מוסד רפואי. תאים אנושיים העיקרי תרבות במכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) בינוני בתוספת 10% נסיוב אדם במקום FCS ו -50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​גנטמיצין. דגירת תאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 בין כל השלבים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד תאי הדם היקפי mononuclear אדם (PBMC) על ידי צפיפותהפרדת שיפוע הבא הפרוטוקול של יצרן 18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל תאי T לגרום התפשטות הנדרשת זיהום retroviral. תרבות 2 x 10 7 PBMC טרי או מופשר היטב לכל צלחת 6-היטב, ב 5 מ&quot;ל של מדיום RPMI עם 100 IU / ml-2 interleukin אנושי רקומביננטי (rhIL-2) ו -50 ng / ml של נוגדנים חד שבטיים אנטי CD3 (שיבוט OKT3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלושה ימים שלאחר גירוי, לאסוף תאי T על ידי pipetting ו צנטריפוגות ב XG 350 למשך 4 דקות. בטל supernatant וזרעי 0.5-1 x 10 6 T תאים לכל היטב צלחת 24 גם resuspended ב 1 מ&quot;ל של וירוס PG13 משלב 2.7, ו 1 מ&quot;ל של מדיום RPMI בתוספת 200 IU / ml של rhIL-2. צלחת צנטריפוגה XG ב 1000 ו -32 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות, לאסוף תאי T על ידי pipetting ו צנטריפוגות ב XG 350 למשך 4 דקות. מחק תאים supernatant ו resuspend ב 1 מ&quot;ל של וירוס PG13 משלב 2.7, ו 1 מ&quot;ל של מדיום RPMI בתוספת 200 IU / ml של rhIL-2. חזור על שלב זה עבור סכום כולל של 6 להדביקיונים. הערה: מספר הזיהומים צריך להיות מותאם בהתאם כייל של וירוס המיוצר על ידי אריזות קו סלולארי. במידת הצורך, מעבר בתאי T על ידי הסרת 20-30% של תאים בכל יום כדי למנוע צמיחת יתר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות לאחר ההדבקה האחרונה, לאסוף תאי T על ידי pipetting ו צנטריפוגות ב XG 350 למשך 4 דקות. מחק תאים supernatant ו resuspend במדיום RPMI עם 100 IU / ml של rhIL-2 לתרבות נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2-3 ימים לאחר שלב 3.5, תאי T הכתם עם multimer HLA על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ואז אנטי אנושי CD3 ו נוגדנים חד שבטיים לקולטן שיתוף (מבז) בשעה 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לנתח ידי cytometry הזרימה. השתמש multimer הרלוונטי ו / או תאי untransduced שולט שלילי (איור 1 - 3) 19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם hemichain ממוקדת הציג הינה רשת TCRα, ולנתח את השימוש Vβ של תאים חיוביים דה נובו multimer באמצעות זמינים מסחרית לוח נוגדן Vβ ספציפי על ידי זרימת cytometry 20. </li></ol> 4. שיבוט דה נובו TCR מתפרצות hemichains <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיין האוכלוסייה החיובית דה נובו multimer בשלב 3.6 ידי מיון תא בסיוע זרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד RNA מן תאים ממוינים T בשיטת החילוץ פנול, כלורופורם thiocyanate guanidinium חומצה 21,2 2. הערה: RNA יכול להיות מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס, אך צריך לשמש כדי ליצור cDNA בהקדם האפשרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנתז ספריית cDNA מ- RNA חילוץ באמצעות ערכות transcriptase-PCR הפוך זמינים מסחרית הבאים פרוטוקול של היצרן 23,24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם שיבוט נגד רשתות TCRβ, לעצב גן Vβ ו פריימרים ספציפיים באזור קבוע TCRβ, כפי שנקבע בשלב 3.7, ולשכפל באורך מלא TCRβ גנים כמתואר בשלבים 1.3-1.9. ראה שלב 4.5 אם נגד שרשרת היא TCRα, אחרת המשך לשלב 5.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זמין מסחרי נוגדני Vα הספציפיים מוגבלים, כך ששימוש גן Vα לא יכולשייקבע על ידי cytometry הזרימה. Clone TCRα נגד רשתות באמצעות הגברת 5&#39;-מהירה של קצות cDNA (RACE) 25, באמצעות זמינים מסחריים 5 &#39;RACE ערכות 6. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנתז 5 &#39;cDNA RACE התואם מ- RNA שחולץ בשלב 4.2 באי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע -1 עגול PCR כמתואר בטבלה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע אלקטרופורזה של מוצר PCR ו elute להקה של כ -1,100 bps, כמתואר בשלב 1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע 2 nd עגול PCR כמתואר בטבלה 3, באמצעות 1 מוצר PCR עגול רח כתבנית. הערה: רצפים פריימר לראות תחת טבלה 3 תוכננו עבור שיבוט לתוך EcoRI ו NotI מתעכל וקטור PMX. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע אלקטרופורזה של מוצר PCR ו elute להקה של כ -1,000 bps, כמתואר בשלב 1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גני Clone TCRα לתוך EcoRI ו NotI מתעכלים וקטור PMX ו פורהפלסמידים פ.י. כמתואר בשלבים 1.5-1.9. </li></ol></li></ol> 5. רומן reconstituting אנטיגן ספציפי המשובטים TCR הערה: תרבות Jurkat 76 תאים שורות תאים עוקבות במדיום RPMI בתוספת 10% FCS ו -50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​גנטמיצין. דגירת תאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 בין כל השלבים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transduce Jurkat 76 תאים 26 (או שווה ערך TCR - / - שורת תאי T אנושית) עם hemichain TCR הממוקד באמצעות וירוס 293GPG מיוצר בשלב 2.3. לקבלת Jurkat 76, זרע 5 x 10 4 תאים לכל היטב צלחת 24 גם עם 1 מ&quot;ל של וירוסים 1 מ&quot;ל של מדיום RPMI. צלחת צנטריפוגה XG ב 1000 ו -32 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות לאחר ההדבקה, לאסוף Jurkat transduced hemichain 76 תאים על ידי pipetting ו צנטריפוגות ב XG 350 למשך 4 דקות. בטל supernatant ו resuspend במדיום RPMI טריים לתרבות נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר תאי transduced אם hemichain מולקולרית ניתן מתויג 2-3 ימים לאחר שלב 5.2, על ידי כתםing עם fluorophore מצומדות אנטי NGFR מב ואחריו בסיוע זרימה או תא מגנטי בסיוע מיון (אופציונלי) 27. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות צעדים 2.1 כדי 2.3, לייצר וירוס 293GPG קידוד נגדי שרשרת TCR משובטת צעדים 4.4 או 4.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקים מחדש את TCR מלא, transduce שורת תאי T ביציבות המבטא את שנוצרה TCR hemichain הממוקדת בצעדים 5.1-5.3 באמצעות וירוס משלב 5.4. בצע התמרה כמתואר בשלבים 5.1-5.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר CD3 + transfectants באמצעות מיון התא מגנטי בסיוע אנטי CD3 הבאים פרוטוקול של היצרן, 2-3 ימים לאחר שלב 5.5 27. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאמת סגוליות אנטיגן, להכתים את transfectants להביע TCRs clonotypic מורכב hemichain TCR ממוקדת זיווג עם-שרשראות הדלפק שונים, עם אנטי CD3 ו / או מבז קולטן שיתוף, ו- HLA multimer, 3-5 ימים שלאחר טיהור CD3. לנתח תאים על ידי cytometry זרימה (איור 4 - 5) 19. </li></ol>

<ol>
	<li>Maus, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+immunotherapy+for+cancer+or+viruses.">Adoptive immunotherapy for cancer or viruses.</a> Annu. Rev. Immunol. 32, 189-225 (2014).</li><li>Yokosuka, T., , ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predominant+role+of+T+cell+receptor+(TCR)-alpha+chain+in+forming+preimmune+TCR+repertoire+revealed+by+clonal+TCR+reconstitution+system.">Predominant role of T cell receptor (TCR)-alpha chain in forming preimmune TCR repertoire revealed by clonal TCR reconstitution system.</a> J.Exp.Med. 195, 991-1001 (2002).</li><li>Rudolph, M. G., Stanfield, R. L., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+TCRs+bind+MHCs,+peptides,+and+coreceptors.">How TCRs bind MHCs, peptides, and coreceptors.</a> Annu. Rev. Immunol. 24, 419-466 (2006).</li><li>Shimizu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+TCR+and+antigen+complexes+at+an+immunodominant+CTL+epitope+in+HIV-1+infection.">Structure of TCR and antigen complexes at an immunodominant CTL epitope in HIV-1 infection.</a> Sci. Rep. 3, 3097 (2013).</li><li>Nakatsugawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+roles+of+each+TCR+hemichain+in+generating+functional+chain-centric+TCR.">Specific roles of each TCR hemichain in generating functional chain-centric TCR.</a> J. Immunol. 194 (7), 3487-3500 (2015).</li><li>Ochi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+T-cell+Reactivity+by+Exploiting+TCR+Chain+Centricity+for+the+Purpose+of+Safe+and+Effective+Antitumor+TCR+Gene+Therapy.">Optimization of T-cell Reactivity by Exploiting TCR Chain Centricity for the Purpose of Safe and Effective Antitumor TCR Gene Therapy.</a> Cancer Immunol. Res. 3 (9), 1070-1081 (2015).</li><li>Chamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CDR3beta+sequence+motifs+regulate+autoreactivity+of+human+invariant+NKT+cell+receptors.">CDR3beta sequence motifs regulate autoreactivity of human invariant NKT cell receptors.</a> J. Autoimmun. 68, 39-51 (2016).</li><li>Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+plasmid+vectors+expressing+FLAG-tagged+proteins+under+the+regulation+of+human+Elongation+Factor-1&#945;+promoter+using+Gibson+Assembly.">Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human Elongation Factor-1&#945; promoter using Gibson Assembly.</a> J. Vis. Exp. (96), e52235 (2015).</li><li>Beshiri, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+using+ChIP+to+identify+isoform-specific+gene+targets.">Genome-wide analysis using ChIP to identify isoform-specific gene targets.</a> J. Vis. Exp. (41), e2101 (2010).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat. Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Johnson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+structure+of+the+human+NGF+receptor.">Expression and structure of the human NGF receptor.</a> Cell. 47 (4), 545-554 (1986).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+cleavage+efficiency+of+a+2A+peptide+derived+from+porcine+teschovirus-1+in+human+cell+lines,+zebrafish+and+mice.">High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice.</a> PloS one. 6, e18556 (2011).</li><li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+optimal+bicistronic+lentiviral+vectors+facilitates+high-level+TCR+gene+expression+and+robust+tumor+cell+recognition.">Development of optimal bicistronic lentiviral vectors facilitates high-level TCR gene expression and robust tumor cell recognition.</a> Gene Ther. 15 (21), 1411-1423 (2008).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method.">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> J. Vis. Exp. (6), e253 (2007).</li><li>Birnboim, H. C., Doly, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+alkaline+extraction+procedure+for+screening+recombinant+plasmid+DNA.">A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA.</a> Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).</li><li>Ory, D. S., Neugeboren, B. A., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stable+human-derived+packaging+cell+line+for+production+of+high+titer+retrovirus/vesicular+stomatitis+virus+G+pseudotypes.">A stable human-derived packaging cell line for production of high titer retrovirus/vesicular stomatitis virus G pseudotypes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (21), 11400-11406 (1996).</li><li>Imataki, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-21+can+supplement+suboptimal+Lck-independent+MAPK+activation+in+a+STAT-3-dependent+manner+in+human+CD8(+)+T+cells.">IL-21 can supplement suboptimal Lck-independent MAPK activation in a STAT-3-dependent manner in human CD8(+) T cells.</a> J. Immunol. 188 (4), 1609-1619 (2012).</li><li>Davies, J. K., Barbon, C. M., Voskertchian, A. R., Nadler, L. M., Guinan, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+alloantigen-specific+anergy+in+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+by+alloantigen+stimulation+with+co-stimulatory+signal+blockade.">Induction of alloantigen-specific anergy in human peripheral blood mononuclear cells by alloantigen stimulation with co-stimulatory signal blockade.</a> J. Vis. Exp. (49), e2673 (2011).</li><li>Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+analysis+of+immune+cells+within+murine+aortas.">Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas.</a> J. Vis. Exp. (53), e2848 (2011).</li><li>Butler, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+antitumor+memory+in+humans+using+in+vitro-educated+CD8++T+cells.">Establishment of antitumor memory in humans using in vitro-educated CD8+ T cells.</a> Sci. Transl. Med. 3 (80), 80ra34 (2011).</li><li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction.">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Anal. Biochem. 162 (1), 156-159 (1987).</li><li>Peterson, S. M., Freeman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+isolation+from+embryonic+zebrafish+and+cDNA+synthesis+for+gene+expression+analysis.">RNA isolation from embryonic zebrafish and cDNA synthesis for gene expression analysis.</a> J. Vis. Exp. (30), e1470 (2009).</li><li>Ying, S. Y., Ying, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+DNA+Libraries.">Complementary DNA Libraries.</a> Generation of cDNA Libraries: Methods and Protocols. 221, 1-12 (2003).</li><li>Hirano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engagement+of+CD83+ligand+induces+prolonged+expansion+of+CD8++T+cells+and+preferential+enrichment+for+antigen+specificity.">Engagement of CD83 ligand induces prolonged expansion of CD8+ T cells and preferential enrichment for antigen specificity.</a> Blood. 107 (4), 1528-1536 (2006).</li><li>Scotto-Lavino, E., Du, G., Frohman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5'+end+cDNA+amplification+using+classic+RACE.">5' end cDNA amplification using classic RACE.</a> Nat. Protoc. 1 (6), 2555-2562 (2006).</li><li>Heemskerk, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redirection+of+antileukemic+reactivity+of+peripheral+T+lymphocytes+using+gene+transfer+of+minor+histocompatibility+antigen+HA-2-specific+T-cell+receptor+complexes+expressing+a+conserved+alpha+joining+region.">Redirection of antileukemic reactivity of peripheral T lymphocytes using gene transfer of minor histocompatibility antigen HA-2-specific T-cell receptor complexes expressing a conserved alpha joining region.</a> Blood. 102 (10), 3530-3540 (2003).</li><li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+cell+sorting+and+flow+cytometry+sorting+methods+for+the+isolation+and+function+analysis+of+mouse+CD4++CD25++Treg+cells.">Magnetic cell sorting and flow cytometry sorting methods for the isolation and function analysis of mouse CD4+ CD25+ Treg cells.</a> J. Zhejiang Univ. Sci. B. 10, 928-932 (2009).</li><li>Padovan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+two+T+cell+receptor+alpha+chains:+dual+receptor+T+cells.">Expression of two T cell receptor alpha chains: dual receptor T cells.</a> Science. 262 (5132), 422-424 (1993).</li><li>Johnson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=transfer+of+tumor-reactive+TCR+confers+both+high+avidity+and+tumor+reactivity+to+nonreactive+peripheral+blood+mononuclear+cells+and+tumor-infiltrating+lymphocytes.">transfer of tumor-reactive TCR confers both high avidity and tumor reactivity to nonreactive peripheral blood mononuclear cells and tumor-infiltrating lymphocytes.</a> J. Immunol. 177 (9), 6548-6559 (2006).</li><li>Chinnasamy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+TCR+targeting+the+HLA-A*0201-restricted+epitope+of+MAGE-A3+recognizes+multiple+epitopes+of+the+MAGE-A+antigen+superfamily+in+several+types+of+cancer.">A TCR targeting the HLA-A*0201-restricted epitope of MAGE-A3 recognizes multiple epitopes of the MAGE-A antigen superfamily in several types of cancer.</a> J. Immunol. 186 (2), 685-696 (2011).</li></ol>

The University Health Network has filed a patent related to this methodology on which N.H., M.N., and T.O. are named as inventors. The other authors have no financial conflicts of interest.

הדרישה הראשונה עבור יישום מוצלח של שיטה זו היא השיגה יעילות תמרה מספקת של תאי T העיקריים עם hemichain עניין. מניסיוננו, השילוב של שימוש PG13 כמו שורת תאי אריזת PMX כתוצאות וקטור retroviral בביטוי יציב ויעיל של הגן הציג בתאי T עיקריים אדם. תאי אריזות PG13 יכולים להיות משובט מתא בודד כדי לבחור עבור תאי אריזה גבוהה כייל כדי לשפר את היעילות התמר. יתר על כן, התפשטות של תאי T נדרש גם עבור יעילות התמרה גבוהה על ידי רטרו-וירוס. בפרוטוקול המתואר, גירוי עם OKT3 מב אנטי CD3 מסיס, יחד עם ריכוז גבוה של rhIL-2, מספק אותות ההפעלה הצורכים להשרות חלוקת תא. מונוציטים נדרשים עבור הקיבולת של גירוי OKT3 המסיס, סביר באמצעות קשירה עם קולטנים Fc. לכן, עיקר PBMC, ולא מטוהרים תאי T, נדרש פרוטוקול גירוי ספציפי זה. Tתאים צריכים להיות מתורבתים ב RPMI בתוספת סרום אנושי עבור תוצאות ניסוי אופטימליות. כל התאים האחרים המתוארים כאן יכול להיות מתורבת בנוכחות נסיוב עגל העובר. שנית, דה נובו שנוצר TCRs אנטיגן ספציפי לבטא בתאי חייב להתגלות. לקבלת hemichains TCR מסוים, כגון TAK1β, דה נובו תאי מבטאי TCR הם רק לזיהוי לאחר גירוי עם תאי אנטיגן-פעם מציגי אנטיגן (נגמ&quot;שים). לכן, אם TCRs אנטיגן ספציפי אינם מזוהים מיד לאחר התמרה של hemichain ממוקדת, הם יכולים להתגלות לאחר הרחבת ידי נגמ&quot;שים. הערה התמרה לזה של hemichain הלא ממוקדת לא תניב דה נובו תאי T אנטיגן ספציפי גם לאחר הרחבת אנטיגן ספציפי עם נגמ&quot;שים, כפי שניתן לראות עם hemichain TAK1α (איור 1). במחקרים שלנו, multimers HLA משמשים לגילוי, לעומת זאת, זה לא יהיה זמין עבור חלק TCRs, במיוחד מלימודי HLA השני המוגבלים TCRים. חלופה תהיה לזהות תגובות התפקודיות של תאי T. Hemichain transduced תאי T יכול להיות מגורה עם נגמ&quot;שים פעמו עם האנטיגן של עניין. נגמ&quot;שים-פעם רכב ותאי T untransduced יכולים לשמש שולטים. בתגובה תא T ניתן לאתר על ידי גברת ביטוי של סמני הפעלת משטח כגון CD107a, CD154, או CD137. לבסוף, חשוב לאמת כי הרשתות ללא מרשם המשובט אל למעשה להכיר את האנטיגן של עניין כאשר יחד עם hemichain הממוקדת. הדבר חשוב במיוחד כאשר hemichain הממוקדת היא TCRβ שכנגד רשתות הן TCRα, מאז הדרה אללים גני TCRα היא דולפת ההערכה היא כי חלק ניכר של תאים היקפיים αβ T לבטא יותר מאחד TCRα שרשרת 28. תגובתיות ניתן לאשר עם מכתים multimer או למדוד את תגובתו הפונקציונלית לאחר גירוי עם נגמ&quot;שים הצגת אנטיגן מאותו המקור. limitati אחתעל הטכניקה הזו היא שלא כל TCR יהיה להלחין hemichain ממוקדת, שכן הן TCRα ו TCRβ לתרום וזהובה לאנטיגן הכרה ובמקרים מסוימים 3. לכן, תאי T היקפיים transduced עם hemichains כאלה שאינם ממוקדים לא עשויים להניב דה נובו TCRs אנטיגן ספציפי. עם זאת, שיטה זו מייצגת התקדמות רעיונית על הגישה המקובלת כדי TCRs שיבוט, שבו שני גני TCRα ו TCRβ חייבים להיות משובטים התאמה נכונה יש להבטיח 29,30. בטכניקה שלנו, זיווג בין hemichains הוא כבר לא דאגה עיקרית ורק אחת מרשתות TCR צריך להיות משובט, בהתחשב בכך שהאחר הוא קבוע. בנוסף לכיתת HLA אני או TCRs-מוגבל CD1d, השיטה המתוארת יכולה לחול גם על הבידוד של כיתת HLA TCRs II-מוגבל עבור ריפוי גנטי TCR.

לקולטנים המצויים בתאי T (TCRs) הם קולטנים החיסונית heterodimeric אדפטיבית שהביעו לימפוציטים מסוג T, מורכבת שרשרת TCRα ו TCRβ. הם מופקים באמצעות התארגנות סומטיים של V (D) קטעי גן J, המייצר רפרטואר מגוון מאוד מסוגל לזהות תצורות כמעט בלתי מוגבלות של מתחמי HLA / פפטיד. מבחינה קלינית, תאי T שהונדסו ספציפיים TCRs clonotypic עבור אנטיגנים גידולים הקשורים הוכיחו יעילות במגוון סוגי סרטן 1. עם זאת, רבי TCRs משובט למטרה זו חסרה זיקה מספקת את האנטיגן של עניין, מגבילות מריחות הטיפולית שלהם. כאן, אנו מתארים שיטה להתגבר על מגבלה זו על TCRs הקיים תוך ניצול-מרכזיות שרשרת. זה כבר דווח כי hemichain אחד TCR יכול לשחק תפקיד דומיננטי יותר לאות הוקרה על האנטיגן היעד 2, כאן כינה מרכזית. ניתוחים מבניים קריסטל הראו כי ממוקד אחדhemichain של TCR יכול להסביר את רוב טביעת הרגל על פפטיד MHC / 3,4 המורכב. תוך שימוש בקונספט זה, שהראנו בעבר כי SIG35α TCRα תוכל לשייך את רפרטואר מגוון של שרשראות TCRβ ולתחזק תגובתיות כנגד פפטיד MART1 27-35 שהציג HLA-A2 5. תוצאות דומות התקבלו עם TAK1 TCR, שבו hemichain TCRβ ממוקדת זיווג עם שרשראות TCRα שונים ומתוחזק תגובתיות לייצור הפפטיד WT1 235-243 שהציג HLA-A24 6. שניהם MART1 ו WT1 הם אנטיגנים גידולים הקשורים. שרשרת-מרכזיות יושמה גם ללמוד ההכרה אנטיגן של הרוצח הטבעי משתנה-מוגבל CD1d (iNKT) TCRs, על ידי הצמדת שרשרת Vα24-Jα18 (Vα24i) TCRα משתנה של TCRs iNKT אדם עם 7 שרשראות Vβ11 TCRβ שונים. בכל המקרים, הצלחנו ליצור רפרטואר דה נובו של TCRs על ידי טרנסמחוללות hemichain TCR ממוקדת לתאי T דם היקפיים, שבו hemichain הציג לזווג עם TCRα אנדוגני או נגד רשתות TCRβ. בעיקרו של דבר, hemichain הממוקדת משמשת פיתיון שיכול לשמש לזיהוי נגד השרשרות המתאימות, אשר כאשר לזווג יחד יוצרות TCRs המקיים את הספציפיות אנטיגן של עניין, עדיין משתנות זיקה. ברפרטואר הרומן אלה, הצלחנו לבודד TCRs clonotypic עם כוח אינטראקציה משופרת נגד אנטיגן היעד לעומת TCRs קיימים. לכן, אנו מאמינים בשיטה זו תאיץ את צנרת זיהוי TCRs האופטימלי עבור יישומים קליניים.

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>325-043-CL</td><td></td></tr><tr><td>293GPG cells</td><td>Generated by Ory &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; (ref 8)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>800-010-CG</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>800-015-CG</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin sodium salt</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>400-110-IG</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>BioShop</td><td>CCL402</td><td></td></tr><tr><td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, high glucose, pyruvate</td><td>Life Technologies</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit</td><td>BS353</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>12483020</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Corning</td><td>431220</td><td>0.45 mm pore SFCA membrane</td></tr><tr><td>FITC-conjugated anti-human CD271 (NGFR) mAb</td><td>Biolegend</td><td>345104</td><td>clone ME20.4</td></tr><tr><td>FITC-conjugated anti-human CD3 mAb</td><td>Biolegend</td><td>300440</td><td>clone UCHT1</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Life Technologies</td><td>15750078</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>E2611L</td><td>used for multi-piece DNA assembly</td></tr><tr><td>HLA-A2 pentamer</td><td>Proimmune</td><td>depends on antigenic peptide</td><td>HLA-A2/MART1 multimer used here was purchased from Proimmune</td></tr><tr><td>HLA/CD1d monomers</td><td>NIH Tetramer Core Facility</td><td></td><td>multimerize monomers according to protocol provided by NIH tetramer core facility</td></tr><tr><td>Human AB serum</td><td>Valley Biomedical</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>human CD3 microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-101</td><td></td></tr><tr><td>IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM3497</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat 76 cells</td><td>Generated by Heemskerk &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; (ref 10)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>800-060-LG</td><td></td></tr><tr><td>LS MACS column</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alpha Competent &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>New England Biolabs</td><td>C2987I</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 3.1</td><td>New England Biolabs</td><td>B7203S</td><td>used for EcoRI and NotI digestion</td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410</td><td>used for plasmid purification</td></tr><tr><td>PC5-conjugated anti-human CD8 mAb</td><td>Beckman Coulter</td><td>B21205</td><td>clone B9.11</td></tr><tr><td>PG13 cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-10686</td><td></td></tr><tr><td>Phusion HF Buffer Pack</td><td>New England Biolabs</td><td>B0518S</td><td></td></tr><tr><td>Phusion&amp;nbsp;High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>pMX retroviral vector</td><td>Cell Biolabs</td><td>RTV-010</td><td></td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-9268</td><td></td></tr><tr><td>Proleukin (recombinant human interleukin-2)</td><td>Novartis</td><td>by Rx only</td><td>equivalent product can be purchased from Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Purified anti-human CD3 antibody</td><td>Biolegend</td><td>317301</td><td>clone OKT3, used for T cell stimulation</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>SA-PE</td><td>Life Technologies</td><td>S866</td><td>used for multimerizing monomers from NIH tetramer core facility</td></tr><tr><td>SMARTer RACE 5&#039;/3&#039;&amp;nbsp; Kit</td><td>Clontech</td><td>634858</td><td></td></tr><tr><td>Sterile water</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>809-115-LL</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III First-Strand Synthesis System</td><td>Invitrogen</td><td>18080051</td><td>for cDNA synthesis</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>BD</td><td>301604</td><td>10 ml, slip tip</td></tr><tr><td>Tetracycline hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7660</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-293</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 2700</td><td>used to transfect 293GPG cells</td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>15596026</td><td></td></tr></tbody></table>

generating de novo antigen-specific human t cell receptors by retroviral transduction of centric hemichain

לקולטנים מצויים בתאי T (TCRs) משמשים קליני לכוון את הספציפיות של תאי T למקד גידולים כמו אופנות מבטיחות של אימונותרפיה. לכן, שיבוט TCRs הספציפית אנטיגנים סרטניים הקשורים שונים הייתה המטרה של מחקרים רבים. כדי לעורר תגובה של תאי T אפקטיבי, TCR חייב להכיר אנטיגן היעד עם זיקה אופטימלית. עם זאת, שיבוט כזה TCRs כבר אתגר ורבים זמין TCRs להחזיק זיקה תת אופטימלית עבור אנטיגן מאותו מקור. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה של שיבוט דה נובו זיקה גבוהה TCRs אנטיגן ספציפי באמצעות TCRs הקיים תוך ניצול מרכזיות hemichain. זה ידוע כי עבור חלק TCRs, כל TCRα או hemichain TCRβ לא לתרום באופן שווה הכרת אנטיגן, ואת hemichain הדומיננטי הוא המכונה hemichain הממוקדת. הראינו כי על ידי התאמת hemichain הממוקדת עם שרשרות דלפק שונות מדלפק השרשרת המקורית, אנו מסוגלים לשמור על אנטיגן specificity, תוך ויסות כוח האינטראקציה שלה עבור אנטיגן מאותו מקור. לפיכך, את הפוטנציאל הטיפולי של TCR נתון ניתן לשפר על ידי אופטימיזציה של זיווג בין hemichains ממוקדת הדלפק.

ללא ידע מוקדם של אשר hemichain הוא שרשרת ממוקדת, שרשרת TCRα ו TCRβ צריך להיות משובטים בנפרד transduced לתאי T בדם ההיקפי, אשר נעשה במקרה של HLA-A24 / WT1 תגובתי TAK1 TCR (איור 1). תמרה של TAK1β ניב תדירות ניכר גבוהה של תאי T אנטיגן ספציפי. לעומת זאת, תמרה של hemichain הלא ממוקד לא תניב דה נובו multimer תאי T החיוביים, כפי שראה עם שרשרת TAK1α (איור 1). במהלך ניתוח, שער על תאי NGFR + אם גן TCR תויג לאבחון תאי transduced במיוחד (איור 1 - 2). מצד שני, את hemichain אחת ממוקדת ניתן transduced אם ידוע להיות דומיננטי, למשל SIG35α ורשתות Vα24 TCRα משתנה (איור 2 ו -3). T תאים ספציפיים עבור cogn בהתאמהאכול אנטיגן גדל בתדירות על תמרה של hemichain TCRα ממוקד. (איור 2 - 3). יחד, נתונים אלה מדגימים הקדמה לזה של hemichain TCRα או TCRβ ממוקד לתאי T דם היקפיים יכול ליצור דה נובו TCRs עם האנטיגן-הסגולי של עניין. האוכלוסייה אנטיגן ספציפי ניתן למיין לפי התא זרימה בסיוע מיון hemichains TCR ניתן לשכפל כמתואר בסעיף פרוטוקול 4. נגד רשתות Clonotypic TCR ניתן מחדש בנפרד על קו תא T ביציבות המבטא את hemichain ממוקדת. Jurkat 76 transfectants, להביע משובטים חדשים TCRs הייחודי TAK1β או SIG35α ממוקד תאי T transduced hemichain, דיבוק משתנה להיטות האנטיגן מאותו מקור בהתאמה, כפי שנקבע על ידי HLA / פפטיד multimer מכתים 5,6. באופן ספציפי, הצלחנו לבודד דה נובו TCRα נגד רשתות tכובע כאשר יחד עם TAK1β הוכתמו או נמוך או בעוצמה גבוהה יותר על ידי המתחם אנטיגן WT1 מאשר זיווג TAK1αβ הורית (איור 4). באופן דומה, SIG35α זיווג עם-שרשרות דלפק ייחודיות מוכר HLA-A2 / MART1 בינונית עד גבוהה להיטות (איור 5). SIG35α שובט עצמאי של heterodimer 5 TCRαβ, ולכן זיווג הורי hemichain זה לא היה זמין להשוואה. חשוב לציין, נתונים אלה מצביעים על כך אפשר לווסת את הזיקה עבור אנטיגן היעד על ידי התאמת hemichain הממוקדת עם שרשרות דלפק שונות. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54697/54697fig1.jpg" /> איור 1:. TAK1β כדוגמה HLA-מוגבל TCRβ ממוקדת hemichain TCRα או TCRβ hemichains של HLA-A24 / WT1 תגובתי TAK1 TCR תויגה עם rece גורם הגדילה העצבי קטוםptor (ΔNGFR), וכל אחד לחוד transduced לתאי T בדם ההיקפי. Transfectants הוכתמו PC5 מצומדות אנטי CD8 (133x מדולל) ו FITC- מצומדות אנטי NGFR (20x מדולל) נוגדנים חד שבטיים (מבז), והצביע HLA-A24 multimer (5 מיקרוגרם / מ&quot;ל), בעקבות שני פעמים אנטיגן ספציפי גְרִיָה. סה&quot;כ 6 תורמים נבדקו. כל הנתונים היו מגודרים על תאי NGFR +. איור מחדש מודפס באישור התייחסות 6. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54697/54697fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54697/54697fig2.jpg" /> איור 2:. SIG35α כדוגמה HLA-מוגבל TCRα ממוקדת hemichain שרשרת SIG35α TCRα מתוייגים עם ΔNGFR, או תג לבד, היה transduced לתאי T בדם ההיקפי. Transfectants הוכתם-שיתוף PC5njugated אנטי CD8 (133x מדולל) ו FITC- מצומדות אנטי NGFR (20x מדולל) מבז, והצביע multimer HLA-A2 (8 מיקרוגרם / מ&quot;ל). סה&quot;כ 4 תורמים נבדקו. כל הנתונים היו מגודרים על תאי NGFR +. איור מחדש מודפס באישור התייחסות 5 (זכויות יוצרים 2015. האגודה האמריקאית של אימונולוגים, Inc.). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54697/54697fig2large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54697/54697fig3.jpg" /> איור 3:. הרג טבעיים קבועים T (iNKT) תא קולטן Vα24 (Vα24i) כדוגמה hemichain ממוקדת TCRα-מוגבל CD1d שרשרת Vα24i TCRα היה transduced לתאי T בדם ההיקפי. Transfectants הוכתמו FITC מצומדות אנטי CD3 (20x מדולל) מב והצביע CD1d multimer (5 מיקרוגרם / מ&quot;ל). CD1d פרק מוlecules הופק מתאי HEK293 ו-ליפידים עצמיים ידועים נוכחיים אנדוגני. iNKT TCR מוגדר על ידי הכרה CD1d הצגת α-GalCer או אנלוגי שלה PBS-57. סה&quot;כ 4 תורמים נבדקו. איור מחדש מודפס באישור התייחסות 7. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54697/54697fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54697/54697fig4.jpg" /> איור 4: נציג TCRα נגד רשתות משובטים TAK1β transduced תאי T T262 שיבוטים TCRα, A262, A186, A133, ו- T4 היו משובטים מן HLA-A24 / WT1 multimer חיובית transduced TAK1β תאים היקפיים T, וכל אחד לחוד מחדש על Jurkat 76 תאים. להביע CD8, יחד עם שרשרת TAK1β. Transfectants הוכתמו מב CD8 אנטי PC5 מצומדות (133x מדולל) והצביע HLA-A24multimer (5 מיקרוגרם / מ&quot;ל). נתונים מייצגים שני ניסויים בלתי תלויים. ברי שגיאה מצביעים מגוון. איור מחדש מודפס באישור התייחסות 6. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54697/54697fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54697/54697fig5.jpg" /> איור 5: נציג TCRβ נגד רשתות משובטים SIG35α transduced תאי T שיבוטים TCRβ 413, 523, 788, 1086, 794, ו 830 היו משובטים מן HLA-A2 / MART1 multimer תאי T היקפי חיובית transduced SIG35α, ומשוחזר בנפרד על Jurkat. 76 תאים המבטאים CD8, יחד עם שרשרת SIG35α. DMF5 היה TCR זיקה גבוהה משובט בעבר הכרת HLA-A2 / MART1. Transfectants הוכתמו מב CD8 אנטי PC5 מצומדות (133x מדולל) והצביע multimer HLA-A2 (2 מיקרוגרם / מ &#39;יב). נתונים מייצגים שני ניסויים בלתי תלויים. ברי שגיאה מצביעים מגוון. איור מחדש מודפס באישור התייחסות 5 (זכויות יוצרים 2015. האגודה האמריקאית של אימונולוגים, Inc.). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54697/54697fig5large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="שולחן 1" src="/files/ftp_upload/54697/54697table1.jpg" /> טבלה 1:.. ההתקנה לעיכול וקטור PMX ריאגנטים ואמצעי אחסון בהתאמה מוצגים <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54697/54697table1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של השולחן הזה.</a> <img alt="טבלה 2" src="/files/ftp_upload/54697/54697table2.jpg" /> טבלה 2: תוכנית ההתקנה של 1 st ה -5 &#39;RACE PCR. ריאגנטים ואמצעי אחסון בהתאמה, הגדרות PCR, ורצף פריימר מוצגים. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54697/54697table2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של השולחן הזה.</a> <img alt="טבלה 3" src="/files/ftp_upload/54697/54697table3.jpg" /> טבלה 3: תוכנית ההתקנה של 2 nd ה -5 &#39;RACE PCR ריאגנטים ואמצעי אחסון בהתאמה, הגדרות PCR, רצפים פריימר מוצגים.. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54697/54697table3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של השולחן הזה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain at JoVE.com

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

בזאת אנו מתארים שיטה חדשנית להפקה לקולטנים המצויים בתאי T אנטיגן ספציפי (TCRs) על ידי התאמת TCRα או TCRβ של TCR קיים, שהוא בעל אנטיגן-הסגולי של עניין, עם hemichain המשלים של רפרטואר קולטן תא ההיקפי T. TCRs שנוצר דה נובו לשמר אנטיגן-סגולי עם משתנה זיקה.

יצירה<em&gt; דה נובו</em&gt; לקולטנים המצויים בתאי אנטיגן ספציפי האדם T על ידי retroviral התמרה של Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

generating-de-novo-antigen-specific-human-t-cell-receptors-retroviral

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

8.4K Views.  University of Toronto.  בזאת אנו מתארים שיטה חדשנית להפקה לקולטנים המצויים בתאי T אנטיגן ספציפי (TCRs) על ידי התאמת TCRα או TCRβ של TCR קיים, שהוא בעל אנטיגן-הסגולי של עניין, עם hemichain המשלים של רפרטואר קולטן תא ההיקפי T. TCRs שנוצר דה נובו לשמר אנטיגן-סגולי עם משתנה זיקה. 

Video: Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

התמרה retroviral של T-cell קולטנים עכבר מתאי T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

דור Multivirus ספציפיים תאים T כדי למנוע / לטפל זיהומים נגיפיים לאחר השתלת allogeneic תא גזע hematopoietic

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

דור של תאי T האנושי Alloantigen ספציפיים מהדם היקפי

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

Retroviral התמרה של ובתאים מח עצם כדי ליצור תאי T קולטן Retrogenic עכברים

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

Retroviral תמרה של Helper T תאים כגישה גנטית לחקר מנגנוני בקרת הבידול והתפקוד שלהם

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

דור של תאי דנדריטים אדם נגזר מונוציטים מן הדם מלא

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have been conducive to downstream in vivo functional analysis of TCR heterodimers. We have developed an improved protocol based on a two-step multiplex-nested PCR, which results in a PCR product that spans entire variable regions of a human TCR alpha and beta chains. By identifying unique restriction sites and incorporating them into the PCR primers, we have made the PCR product compatible with direct sub-cloning into the template retroviral vector. The resulting retroviral construct encodes a chimeric human/mouse TCR with a mouse intracellular domain, which is functional in mouse cells or in in vivo mouse models. Overall, the protocol described here combines human single cell paired TCR alpha and beta chain identification with streamlined generation of retroviral vectors readily adaptable for in vitro and in vivo TCR expression. The video and the accompanying material are designed to give a highly detailed description of the single cell PCR, so that the critical steps can be followed and potential pitfalls avoided. Additionally, we provide a detailed description of the cloning steps necessary to generate the expression vector. Once mastered, the whole procedure from single cell sorting to TCR expression could be performed in a short two-week period.

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

The current protocol combines single cell paired human TCR alpha and beta chain sequencing with streamlined generation of retroviral vectors compatible with in vitro and in vivo TCR expression.

יעיל בידוד TCR תא בודד, דור של וקטורים Retroviral עבור במבחנה In Vivo הביטוי של האדם TCRs

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

דור שמסווגת נוגדנים חד-שבטיים אנושי מתאי B אנטיגן ספציפי נדיר במחזור הדם

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Use of Single Chain MHC Technology to Investigate Co-agonism in Human CD8+ T Cell Activation

Non-stimulatory self peptide MHC (pMHC) complexes do not induce T cell activation and effector functions, but can enhance T cell responses to agonist pMHC, through a process termed co-agonism. This protocol describes an experimental system to investigate co-agonism during human CD8+ T cell activation by expressing human MHC class I molecules presenting pre-determined peptides as single polypeptides (single chain MHC) in a xenogeneic cell line. We expressed single chain MHCs under conditions where low levels of agonist single chain p-MHC complexes and high levels of non-stimulatory single chain p-MHC complexes were expressed. Use of this experimental system allowed us to compare CD8+ T cell responses to agonist pMHC in the presence or absence of non-stimulatory pMHC. The protocol describes cell line transfection with single chain MHC constructs, generation of stable cell lines, culture of hepatitis B virus-specific human CD8+ T cells and T cell activation experiments simultaneously quantifying cytokine production and degranulation. The presented methods can be used for research on different aspects of CD8+ T cell activation in human T cell systems with known peptide MHC specificity.

This protocol describes the use of single chain MHC class I complexes to investigate molecular interactions in human CD8+ T cell activation: generation of engineered antigen presenting cells expressing single chain constructs, culture of human CD8+ T cell clone and T cell activation experiments.

שימוש בטכנולוגיה MHC שרשרת אחת לחקור Co-agonism ב אנושי CD8 + T Cell הפעלה

Non-stimulatory self peptide MHC (pMHC) complexes do not induce T cell activation and effector functions, but can enhance T cell responses to agonist ...

<meta charset="utf8"></head><body>הנדסה והרחבה של רכבי CAR אנושיים לטיפולים לוויסות מערכת החיסון

Generation of Human Chimeric Antigen Receptor Regulatory T Cells

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has reshaped the face of cancer treatment, leading to record remission rates in previously incurable hematological cancers. These successes have spurred interest in adapting the CAR platform to a small yet pivotal subset of CD4+ T cells primarily responsible for regulating and inhibiting the immune response, regulatory T cells (Tregs). The ability to redirect Tregs&#39; immunosuppressive activity to any extracellular target has enormous implications for creating cell therapies for autoimmune disease, organ transplant rejection, and graft-versus-host disease. Here, we describe in detail methodologies for bona fide Treg isolation from human peripheral blood, genetic modification of human Tregs utilizing either lentivirus or CRISPR/Cas9-aided knock-in using adeno-associated virus-mediated homologous directed repair (HDR) template delivery, and ex vivo expansion of stable human CAR Tregs. Lastly, we describe the assessment of human CAR Treg phenotypic stability and in vitro suppressive function, which provides insights into how the human CAR Tregs will behave in preclinical and clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>יצירת תאי T רגולטוריים של קולטן אנטיגן כימרי אנושי

This protocol provides a streamlined workflow to generate and test human chimeric antigen receptor regulatory T cells (CAR Tregs).

יצירת תאי T רגולטוריים של קולטן אנטיגן כימרי אנושי

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has reshaped the face of cancer treatment, leading to record remission rates in previously incurable ...

יצירה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video